کلون سازی و تعیین توالی ژن هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 5، دوره 4، 1 (13) بهار، خرداد 1389، صفحه 747-751   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

مهدی دیانی نیا¹؛ مرتضی کریمی پور²؛ وهاب باباپور³؛ لهراسب شاهقلیان¹؛ عباس دوستی^{* 1}

¹مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران

²مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، انستیتو پاستور ایران، تهران، ایران

³دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

هورمون رشد باعث تحریک رشد و تکثیر سلول­ها در انسان و حیوانات می­شود. این هورمون یک پلی پپتید تک زنجیره­ای با  191 اسید آمینه است که در سلول­های سوماتوتروف واقع در بال جانبی غده هیپوفیز پیشین ساخته شده و ذخیره و ترشح می­گردد. هدف از این تحقیق کلون سازی و تعیین توالی ژن هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری برای اولین بار در ایران می­باشد. به منظور کلون­سازی و تعیین توالی ژن هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری، RNA  از غده هیپوفیز گوسفند تازه کشتار شده، استخراج و cDNA هورمون رشد ساخته شد. با استفاده از روش کلون­سازی T/A، قطعه cDNA هورمون رشد کلون شد و سپس به باکتری E. coli به عنوان میزبان منتقل گردید. تأیید صحت کلون­های به­دست آمده با روش­های PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی انجام گرفت. کلون سازی cDNA ژن هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری با موفقیت انجام شد و توالی ژن کد کننده هورمون رشد گوسفند با طول690 جفت باز مشخص گردید. مقایسه توالی ژن هورمون رشد موجود در پلاسمید نوترکیب ساخته شده با رکوردهای ثبت شده در بانک ژن جهانی، نشان دهنده شباهت بسیار زیادی بین توالی هورمون رشد گوسفند بومی ایران با سایر نژادهای دنیا می­باشد.

کلیدواژه‌ها

هورمون رشد؛ گوسفند نژاد لری بختیاری؛ کلون سازی

اصل مقاله

مقدمه

 

     هورمون رشد پلی­پپتیدی است که تحت تأثیر هورمون
آزاد­کننده هورمون رشد از غده هیپوفیز پیشین ترشح می­شود. این هورمون، باعث رشد تمام بافت­های دارای قابلیت رشد، پس از تولد می­شود. همچنین دارای اثرات متابولیکی مانند افزایش تولید پروتئین، افزایش مصرف اسید چرب و کاهش مصرف گلوکز می­باشد (2). بیان ژن این هورمون تحت تأثیر عوامل تغذیه­ای و استرس و در پاسخ به هورمون­های تیروئیدی و گلوکوکورتیکوئیدی افزایش می­یابد (1). هورمون رشد به صورت یک هورمون پلی­پپتیدی تک­زنجیره‌ای می­باشد که وزنی در حدود 22 کیلو دالتون دارد و دارای 191 اسید آمینه است (10 و 11).

ژن هورمون رشد در پستانداران، پرندگان و برخی از گونه­های ماهی شامل 5 اگزون و 4 اینترون با طول kb 3-2 است (2 و 11). این هورمون از 4 رشته مارپیچی تشکیل شده (14) و به نظر می­رسد، تکامل این ژن به­وسیله مضاعف­سازی ژن اجدادی آن رخ داده است. این مضاعف­سازی در ژن هورمون رشد گوسفند و بز نیز به طور اختصاصی توسط Valinsky و همکاران در سال 1990 مطالعه شده است (14).

چند شکلی ژن هورمون رشد بر سطح پلاسمایی آن مؤثر است اما ظاهراً سطوح پلاسمایی هورمون رشد وابسته به میزان بیان ژن هورمون رشد نیست (3 و 9).

از آنجایی که تاکنون مطالعه‌ای درباره کلون­سازی و تعیین توالی ژن هورمون رشد گوسفندهای ایرانی صورت نگرفته، لذا در این مطالعه برای اولین بار ژن کدکننده هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری به عنوان یکی از نژادهای گوسفند ایرانی پس از کلون­سازی، تعیین توالی شده و ردیف نوکلئوتیدی حاصله با رکوردهای ثبت شده از این ژن در بانک ژن مقایسه شد.

مواد و روش­ها

     بافت هیپوفیز از گوسفند تازه کشتار شده جداسازی شد. استخراج RNA از بافت هیپوفیز با استفاده از محلول RNX-Plus (CinnaGen, Iran) انجام شد. از روی RNA، cDNA ژن هورمون رشد با استفاده از کیت مخصوصcDNA  سازی (Fermentas,Germany) ساخته شد و cDNA ژن هورمون رشد به وسیله PCR تکثیر و جدا سازی شد.

 به منظور طراحی پرایمرهای مورد نیاز برای تکثیر ژن هورمون رشد، ابتدا توالی این ژن از GenBank گرفته شد. شماره ثبت این ژن در بانک ژن X15976 می­باشد. در انتهای '5 هر یک از پرایمرهای Forward و Reverse به ترتیب سایت برش آنزیم­های  Xho I و Not I قرار داده شد که زیر سایت برش این آنزیم­ها خط کشیده شده است. سایت­های برش مذکور به منظور سهولت انجام کلون­سازی این قطعه ژنی در پلاسمید بیان شونده PET32 در نظر گرفته شده­اند.

توالی پرایمرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری به صورت زیر می باشد:

Ovis GH-F: 5'-TGG CTC GAG CTA TGATGG CTG CAG G– '3

Ovis GH-R: 5'- ATA GCG GCC GCA CAG GGG AGG GGT AAC A–'3

آزمون PCR برای تکثیر cDNA هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری در حجم 25 میکرولیتر با استفاده از مقادیر زیر انجام شد.

غلظت بهینه مواد به کار رفته در واکنش PCR، در حجم نهایی 25 میکرولیتر به صورت 20 نانوگرم DNA الگو، X1 بافر PCR، 2 میلی­مولار MgCl2، 25 پیکومول از هر پرایمر، 1 واحد آنزیم DNA پلیمراز Taq و 200 میکرو­مولار dNTP Mix  تعیین گردید. سپس 2 تا 3 قطره روغن معدنی استریل برای جلوگیری از آلودگی و تبخیر، به مخلوط واکنش PCR اضافه گردید.

انجام واکنش PCR با مرحله دناتوراسیون اولیه به مدت 5 دقیقه در ۹۴ درجه سانتی­گراد آغاز گردید و با انجام ۳۰ سیکل   (Hot start) ۹۴ درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، 58 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و ۷۲ درجه سانتی­گراد به مدت 40 ثانیه ادامه یافت و با مرحله طویل شدن به مدت 5 دقیقه در75 درجه سانتی­گراد به اتمام رسید.

محصول PCR روی ژل آگارز 1% الکتروفورز شد و پس از مشاهده باند690 جفت بازی مربوط به cDNA ژن هورمون رشد، باند مذکور با حداقل ژل آگارز بریده شد و با استفاده از کیت تخلیص DNA از ژل (Gel Extraction Kit, Bioneer, Korea ) عمل خالص­سازی انجام شد. در مرحلة بعد  DNAژن هورمون رشد در وکتور کلونینگ T/A (pCR 8/GW/TOPO Vector) ساخت شرکت Invitrogen کلون شد. سپس از طریق ترانسفورماسیون شیمیایی با استفاده از کلرید کلسیم، حامل نوترکیب به داخل سلول میزبان انتقال یافت. برای تأیید حضور پلاسمید حاوی ژن هورمون رشد در باکتری بعد از 18 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه
سانتی­گراد بر روی کلونی­های رشد یافته در پلیت حاوی
 آنتی­یوتیک اسپکتینومایسین، واکنش PCR انجام شد.
کلون­هایی که در آزمون PCR باند 690 جفت بازی مربوط به ژن GH را داشتند، انتخاب و با استفاده از کیت تخلیص پلاسمید (Plasmid Purification Kit Bioneer) خالص­سازی شدند. به منظور تأیید همسانه­سازی ژن هورمون رشد در وکتور نوترکیب از دو روش هضم اندونوکلئازی و تعیین توالی (Sequencing) استفاده شد.

یافته­ها

     تکثیر ژن هورمون رشد و کلونینگ آن :

پرایمرهای هورمون رشد که بر اساس شماره ثبت X15976 در بانک ژن طراحی شده­اند، طی واکنش PCR، محصولی با طول 690 جفت باز ایجاد نمودند که در وکتور pCR 8/GW/TOPO Vector  با موفقیت کلون شد و در
سلول­های E.coli از طریق ترانسفورماسیون وارد گردید. کلون­های مثبت واجد ژن  GH در وکتورTopo   انتخاب شدند.

تأیید قطعی پلاسمید نوترکیب:Topo-GH  

پلاسمید­های تخلیص شده با استفاده از روش هضم آنزیمی و واکنش PCR مورد بررسی قرار گرفتند. قطعه 690 جفت بازی ژن هورمون رشد، طی واکنش هضم آنزیمی با آنزیم   EcoRI از پلاسمیدهای  Topo-GHخارج شد. (نگاره 1).  به این ترتیب کلون واجد  Topo-GH تأیید گردید.

جهت بررسی توالی ژن کلون شده توالی ژن هورمون رشد انجام شد. توالی خوانده شده از ژن  GH با استفاده از توالی ژن  GHیک نژاد گوسفند به شماره ثبت X15976 در پایگاه اطلاعاتی NCBI تحت آنالیز Blast قرار گرفت و صحت آن مورد تأیید قرار گرفت.

 

 

 

 

 

نگاره 1- شکل حاصل از Digestion پلاسمید­های آمیخته pCR 8/GW/TOPO Vector با آنزیم اندونوکلئازی .EcoRI شماره 1: Topo-GH، شماره 2: پلاسمید  Topoفاقد ژن GH، شماره 3: (Topo-GH UN CUT)، مارکرkb 1 (ساخت شرکت Fermentas).

بحث و نتیجه‌گیری

     با توجه به اهمیت تولید فرآورده­های دامی، طی دهه­های اخیر راهکارها و تکنیک­های متعددی مورد ارزیابی و مطالعه قرار گرفته است که میزان تولید فرآورده­های قابل عرضه به بازار فروش را در این دام­ها افزایش دهد. در این راستا تحقیقات زیادی در مورد استفاده از هورمون رشد نوترکیب در بسیاری از کشورها انجام گرفته است. تحقیق حاضر با هدف تولید پلاسمید نوترکیب حاوی ژن هورمون رشد گوسفند برای اولین بار در ایران آغاز شد.

Dellacha و همکاران در سال 1969 درمقاله­ای تحت عنوان: «جداسازی و خصوصیات سکانس ناحیه C انتهایی هورمون رشد گوسفند» بیان کردند که در مقایسه ترکیب اسیدهای آمینه با نقشه­های پپتیدی هورمون رشد گوسفند و گاو شباهت زیادی بین این دو پروتئین وجود دارد. در این تحقیق همچنین سکانس اسیدهای آمینۀ C انتهایی هورمون رشد گوسفند عبارت بودند از Ala – Ser – Ala – Phe – OH (4).      

سکانس cDNA ژن هورمون رشد گوسفند پس از مطابقت با هورمون رشد هیپوفیز در سال 1984 توسطWarwick وWallis  گزارش شد و همین محققین در سال 1989، cDNA پیش هورمون رشد را کلون، سکانس و سپس در باکتری E. coli بیان نمودند (13). در سال 1988 سکانس ژن هورمون رشد گوسفند بررسی و گزارش آن منتشر شد (8).

درسال 1990، Valinsky و همکاران به وسیله تکنیک RFLP، پلی مورفیسم ژن GH را تعیین کردند که نتیجه آن شامل دو آلل برای جایگاه ژن GH در گوسفند و بز بود. در گوسفند یکی از آلل­ها (GH) توسط یک ژن نمایش داده
می­شد، اما آلل دیگر ژن GH حالت مضاعف داشت یعنی به صورت GH -2 -N و () GH -2-Z بود (11).

در تحقیق دیگری بره­های نر با سه ژنوتیپ Gh1Gh1، GH2/GH2 وGh1/GH2  هیچ­گونه تفاوتی در وزن بدن، ترکیب بدن و یا افزایش بیان ژن GH، از لحاظ نگه­داری و ترشح نداشتند. اگر چه تفاوت­های خیلی سطحی در محتوای GH هیپوفیز و هورمون ترشح کننده GH یافت شد (6).

در سال 1992، Gurn و همکاران، پس از ساخت cDNA هورمون رشد گوسفند و کلون نمودن آن، سکانس پیش هورمون رشد را تعیین نمودند و سکانس هورمون رشد را از روی سکانس اسیدهای آمینه این هورمون که قبلاً تعیین شده بود، مشخص نمودند. البته ایشان تفاوت در دو جایگاه اسید آمینه­ای نسبت به تحقیقات قبلی را شناسایی و گزارش نمودند (5).

Lacroix و همکاران در سال 1996 بیان پروتئین ژن هورمون رشد و سایر پلی پپتیدهای وابسته به آن در جفت پستانداران را نشان دادند. ایشان در بررسی جفت در روزهای
140-30 آبستنی توانستند دو نوع پروتئین 22 و 28 کیلو دالتنی را جدا سازی نمایند. mRNA رمز کننده این پروتئین­ها بین روزهای 50-40 آبستنی بیان می‌شود. بررسی‌های بیشتر سه نوع mRNA هورمون رشد (GHP1، GHP2 و GHP3) را در جفت نشان داد (7).

توالی کانستراکت نوترکیب حاوی ژن هورمون رشد گوسفند نژاد لری بختیاری با سایر ژن­های هورمون رشد ثبت شده در بانک ژن، مقایسه شد. نتایج این مقایسه حاکی از  شباهت قابل توجهی بین توالی ژن هورمون رشد با تمام پستانداران
به­خصوص نشخوارکنندگان بود. 

مراجع

1. بیگدلی، م.ر. 1381. مروری بر فیزیولوژی پزشکی گانونگ. چاپ اول، انتشارات تیمورزاده، صفحات: 251 و 295-286.
   1. Agellon, E., Sise, J.A., Penty, J.M. and Montgomery, G.W. 1993. The duplicated gene copy of ovine growth hormone gene contains a P. vull polymorphism in the second intron. Animal generics. 24:319-321.
   2. Brenner, C.A., Tam, A.W., Nelson, P.A., Engeman, E.G., Suzuki, N., Fry, K.E. et al. 1989. Novel method for studying mRNA phenotypes in single or small numbers of cells. Biotechniques. 7(10):1096-1103.
   3. Dellacha, J.M., Enero, M.A., Sentome, J.A. and Palodini, A.C. 1970. Isolation, characterization and C-Terminal sequence of ovine growth hormone. European Journal of Biochemistry. 12:289-295.
   4. Guron, C., Roa, K.B., Jain, S.K., Totey, S.M. and Talwar, G.P. 1992. Cloning and nucleotide sequencing of sheep growth hormone cDNA. Indian Journal of Experimental Biology. 30(8):659-63.
   5. Fleming, J.S., Suttee, J.M., Montgonery, G.W., Gwnn, J., Stuart, S.K., Little john, R.P. et al. 1997. The effects of duplication in the ovine growth hormone (GH) gene on GH expression in the pituitaries of ram lambs from lean and fat-selected sheep line. Domestic Animal Endocrinology. 14:17-24.

 

1. Lacroix, M.C., Devinoy, E., Servely, L., Pulssant, C. and Kann, T. 1996. Expression of the growth hormone gene in ovine placents: detection and cellular localization of the protein. Journal of Endocrinology. 137:4886-4892.
2. Orian, J.M., O’Mahoneg, J.V. and Brandon, M.R. 1988. Cloning and sequencing of ovine growth hormone gene. Nucleic Acids Reserch. 16:9046.
3. Sch-lee, P., Grami, R., Schallenberger, E. and Scham, S.D. 1994. Growth hormone and Insulin-like growth Factor I concentrations in bulls of various growth hormone genotypes. Theoretical and Applied Genetics. 88:497-500.
4. Tashjian, A.H., Bancroft, F.C. and Levince, L. 1970. Hormone production cell culture model. Journal of Cell Biology. 47:61-70.
5. Valinsky, A., Shani, M. and Gootwine, E. 1990. Restriction fragment length polymorphism in sheep at the growth hormone locus is the result of variation in gene number. Animal Biotechnology. 1:135-144.
6. Wallis, M. 1994. Variable evolutionary rates in the molecular evolution of mammalian growth hormone. Journal of Molecular Evolution. 38:619-627.
7. Warwick, J.M. and Wallis, M. 1984. Characterization of mRNA sequences encoding sheep somatotropin (growth hormone) by cloning of pituitary complementary DNA. Biochemical society Transactions. 12:247-250.
8. Warwick, J.M., Wallis, O.C. and Wallis, M. 1989. Cloning, sequence and expression in Escherichia coli of cDNA. Biochimica et Biophysica Acta. 1008:247-250.