تعداد نشریات | 418 |
تعداد شمارهها | 9,985 |
تعداد مقالات | 83,469 |
تعداد مشاهده مقاله | 76,606,334 |
تعداد دریافت فایل اصل مقاله | 53,718,262 |
تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه در نمونههای بالینی با استفاده از روش VlhA-PCR | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
آسیبشناسی درمانگاهی دامپزشکی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقاله 7، دوره 3، 4 (12) زمستان، اسفند 1388، صفحه 673-681 اصل مقاله (507.2 K) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
نویسندگان | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
حسین انصاری1؛ سید علی پوربخش* 2؛ نریمان شیخی3؛ محمد حسن بزرگمهری فرد3؛ عباس اشتری4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1دانشجوی دوره دکترای تخصصی بیماریهای طیور، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3گروه علوم درمانگاهی، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4آزمایشگاه رفرانس مایکوپلاسما، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج، ایران | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
چکیده | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مایکوپلاسما سینوویه به عنوان یکی از اصلیترین پاتوژنهای پرندگان، خسارات اقتصادی فراوانی را به صنعت مرغداری وارد میکند. هدف اصلی این مطالعه شناسایی گونه مایکوپلاسما سینوویه در نمونههای بالینی با استفاده از روش VlhA-PCRمیباشد. برای بررسی تیتر سرمی، تعداد 375 نمونه سرمی از 25 گله مادر گوشتی اخذ و بر روی آن تست (Rapid Serum Agglutination) RSA انجام گردید که 143 نمونه، معادل 19 گله در آزمایش RSA مثبت گردید. جهت نمونهبرداری برای (Polymerase Chain Reaction) PCR از 25گلهای که 19 گله آن در تست RSA مثبت شده بودند، 20 گله انتخاب و سوآپهای استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه از آنها تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلیلیتر PBS انداخته شد و به آزمایشگاه منتقل گردید تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. در این مطالعه، از پرایمرهای اختصاصی برای ژن VlhA استفاده شد. محصول PCR تولیدی توسط پرایمرهای اختصاصی، در 8 گله، باند 400-350 جفت بازی را برای همه سویههای فیلدی بر روی ژل الکتروفورز تشکیل داد. VlhA-PCR با حساسیت بسیار بالا میتواند در تشخیص قطعی عفونت با مایکوپلاسما سینوویه در آزمایشگاه به کار برده شود. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
کلیدواژهها | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مایکوپلاسما سینوویه؛ نمونههای بالینی؛ PCR؛ ژن VlhA | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
اصل مقاله | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مقدمه
مایکوپلاسما سینوویه یکی از عوامل بیماریزای مهم ماکیان و بوقلمون است که همه ساله خسارت اقتصادی زیادی به صنعت طیور وارد مینماید. اگرچه اولین بار مایکوپلاسما سینوویه به عنوان عامل بیماری سینوویت عفونی معرفی شد، اما امروزه علاوه بر سینوویت عفونی به عنوان عامل بیماری تنفسی و عفونت کیسههای هوائی نیز شناخته شده است (3، 6 و 12). با وجود پیشرفتهای ایجاد شده در روشهای کنترل و ریشهکنی، مایکوپلاسما سینوویه همچنان در صنعت طیور خصوصاً در گلههای مرغ مادر از اهمیت ویژهای برخوردار است. شکل تنفسی عفونت مایکوپلاسما سینوویه بیشتر به صورت عفونت تحت بالینی قسمت فوقانی دستگاه تنفس رخ میدهد. حالت بالینی عفونت به شکل تنفسی، خصوصاً هنگامی که مایکوپلاسما سینوویه با بیماریهای ویروسی مانند بیماری نیوکاسل یا برونشیت عفونی و یا واکسیناسیون با ویروسهای زنده فوق همراه میشود، بروز میکند که با عفونت کیسههای هوایی همراه است و باعث شدیدتر شدن بیماری میشود. در برخی موارد، عفونت سیستمیک شده و به سینوویت عفونی منجر میشود که یک بیماری عفونی حاد تا مزمن ماکیان و بوقلمونها است و بهطور عمده غشاء سینوویال مفاصل و غلاف تاندونها را درگیر میکند. متعاقب آن سینوویت اکسوداتیو و بورسیت ایجاد میگردد (3، 6 و 8). تشخیص به موقع مایکوپلاسما هم از جهت پرورشدهندگان مادر، هم پرورشدهندگان جوجههای تجارتی و هم از نظر سازمان دامپزشکی حائز اهمیت میباشد. مایکوپلاسماها پروکاریوتهای بسیار کوچکی هستند که فاقد دیواره سلولی بوده و به این دلیل در مقابل آنتیبیوتیکهایی که روی سنتز دیواره سلولی اثر میکنند، مقاوم میباشند. شکل کلونیها مثل تخممرغ پخته یا تکمهای شکل میباشد. همچنین نسبت به احتیاجات پیچیدة غذایی در صورت کمبودشان مقاوم هستند. بعضی از مایکوپلاسما فقط یک نوع حیوان را آلوده میکنند ولی بعضیها قادرند در چندین حیوان مختلف ایجاد بیماری نمایند. مایکوپلاسماها در گیاهان، جانوران و انسان و حشرات ایجاد بیماری میکنند. به طور عمومی مایکوپلاسماها در سطح مخاطی کلونیزه میشوند و اکثراً غیرمهاجم هستند ولی بعضی گونهها مثل مایکوپلاسما گالیسپتیکوم قادر به سوراخ کردن سلولها هستند. مایکوپلاسماها بهطور اولیه به غشای مخاطی دستگاه تنفس و یا ادراری- تناسلی، چشم و مفاصل تمایل دارند. بسیاری از آنها بهعنوان انگلهای سطحی شناخته میشوند و بهندرت بافتها را مورد تهاجم قرار میدهند. البته انتشار آنها به اندامهای مختلف، بیانگر حداقل یک عفونت عمومی زودگذر است. بهطور کلی، گونههای مایکوپلاسما و احتمالاً سویههای خاصی تمایل بیشتری به بعضی از بافتها یا اندامها دارند هر چند این تمایل الزاماً به معنی حذف کامل از سایر اندامها نمیباشد (3، 6 و 8). با استناد به آنالیز توالی ژن 16S rRNA تصور میشود که مایکوپلاسماها حدود 600 میلیون سال قبل با از دست دادن قسمتهای غیر ضروری از ژنوم خود از جمله ژنهای سنتز دیواره سلولی از باکتریهای گرم مثبت و مشخصاً تاکنون 23 گونه مختلف مایکوپلاسما از پرندگان جدا شده که ماکیان و بوقلمون میزبان 16 گونه از آنها میباشند. در این میان تنها چهار گونه برای طیور بیماریزا هستند که شامل مایکوپلاسما گالیسپتیکوم، مایکوپلاسما سینوویه، مایکوپلاسما مله آگریدیس و مایکوپلاسما آیوا میباشد. به دلیل اهمیت نقش بیماریزایی مایکوپلاسماهای طیور، از سالها قبل برنامه مایکوپلاسماها از کلاس Mollicutes، شاخه I یعنی Mycoplasmatales و جنس I یعنی mycoplasma هستند و بیش از 100 گونه دارند. دارای DNA بوده و برای رشد به کلسترول نیاز دارند. درجه حرارت مطلوب برای رشد 37 است. با آنالیز ژن ریبوزوم 16S rRNA میتوان ارتباط ژنتیکی بین مایکوپلاسماها را بررسی کرد. روش کشت مایکوپلاسما پرزحمت، زمان بر، گران و نیازمند شرایط استریل است. واکنش زنجیرهای پلیمراز روش جایگزین سریع و اختصاصی برای کشت میباشد. در دهه 1990 روشهای مولکولی برای شناسائی مایکوپلاسمای پرندگان توصیف شد. اساس تمام آنها مبتنی بر تکثیر یا شناسائی یک قطعه خاص از ژنوم میباشد. در این بین ژن 16S rRNA به دلیل ثبات قابل توجه در گونهها و حتی در میان جنس مورد توجه بیشتر قرار گرفته و با تکثیر، تعیین توالی و یا استفاده از پروب امکان شناسائی ارگانیسم فراهم میشود (1، 4، 12 و 14). تاکنون تلاشهای زیادی جهت شناسائی و تفریق سویههای مایکوپلاسما سینوویه صورت پذیرفته است. ژنوم مایکوپلاسماها حاوی درصد قابل ملاحظهای از توالیهای تکراری میباشد. بهطور مثال، در مایکوپلاسما ژنیتالیوم توالی MgPa حدود 7/4 درصد کل ژنوم را بهخود اختصاص میدهند، همچنین در مایکوپلاسما گالیسپتیکوم، تعداد بیشتر توالی و بزرگتر ژن VLhA (یا PMGA) حدود 4/10 درصد از کل ژنوم را به خود اختصاص داده است. این توالیها نقش خودشان را در تنوع آنتیژنیکی که در سطح سلول ایجاد میکنند، اجرا میکنند و کشف اندازه آنتیژنیکی و تنوع فاز احتمالاً بهعنوان یکی از بزرگترین پیشرفتها در تحقیقات مایکوپلاسماها بوده همچنین تنوع فازی یا اندازه میتواند نقش کلیدی در حدّت، اتصال و دفاع میزبان، برای مایکوپلاسما داشته باشد (9، 10، 11، 13 و 16). مواد و روشکار نمونه برداری و انجام RSAT 375 نمونه سرمی از 25 گله مادر گوشتی اخذ گردید و جهت انجام تست RSA به آزمایشگاه سرولوژی انتقال یافت. برای انجام تست RSA مراحل زیر انجام شد: یک حجم از سرم (تقریباً معادل ) روی یک کاشی سفید ریخته و یک حجم از آنتیژن رنگی مایکوپلاسما سینوویه به آن اضافه گردید. به منظور مخلوط نمودن آنتیژن و سرم، کاشی بهشکل دورانی تکان داده شد. در صورت وجود آنتیبادی علیه مایکوپلاسما سینوویه پدیده آگلوتیناسیون اتفاق میافتاد که با گرد همآمدن ذرات معلق در مایع مشخص میگردید (سرم مرغ حداکثر در مدت 2 دقیقه و سرم بوقلمون در مدت 3 دقیقه با آنتی ژن آگلوتینه میشود). در خصوص تأیید تشخیص مایکوپلاسما سینوویه کلیه سرمهای مثبت مرحله قبل به مدت 30 دقیقه در بن ماری 56 درجه سانتیگراد قرار داده شد و آزمایش تکرار گردید (جهت غیرفعالسازی واکنشگرهای غیر اختصاصی). سرمهای مثبت مرحله قبل با PBS رقیق و آزمایش تکرار شد در صورتیکه سرمها در رقت یک هشتم با آنتیژن مایکوپلاسما سینوویه آگلوتینه میشدند از نظر تست سریع مثبت و در صورت عدم آگلوتیناسیون منفی قلمداد میشدند. جهت تسریع و سهولت کار مراحل 4 و 5 ادغام شده یعنی ابتدا رقت تهیه گردید و سپس بهمدت 30 دقیقه در بنماری 56 درجه سانتیگراد قرار داده شد و بعد آزمایش را تکرار گردید. نتیجه این آزمایش به صورت مثبت (+) یا منفی نمونهبرداری جهت PCR جهت نمونهبرداری برای PCR، از 20 گلهای که 19 گله آنها در تست RSA مثبت شده بودند، سوآپهای استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلیلیتر PBS انداخته و به آزمایشگاه منتقل شد تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. مراحل استخراج DNA به روش فنل کلروفورم ابتدا مقدار 500 میکرولیتر از نمونه مورد نظر بعد از قرار دادن در همزن به درون میکروتیوپ 5/1 میلیلیتری انتقال داده شد و جهت رسوبگیری به مدت 15 دقیقه در13000 دور سانتریفوژ گردید (نمونهها حاوی ذرات بزرگ بودند که ابتدا به مدت 5 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ شدند و محلول رویی به تیوب جدید منتقل گردید و تیوب حاوی مواد تهنشین شده حذف گردید. سپس مراحل بعدی روی محلول رویی انجام گردید). پس از سانتریفوژ، تیوبهای نمونهها تخلیه گردید و در حد 100 میکرولیتر در ته آن باقی ماند. سپس همحجم مقدار
در این مرحله تریس با pH برابر 8 نقش بافر، EDTA به عنوان مهارکننده آنزیمهای DNAase، SDS به عنوان حل کننده چربیهای موجود در غشاء سلول و نمونه و پروتئیناز K به عنوان هضمکننده پروتئینها و اتصالات بین سلولی عمل میکند. در این مرحله نمونهها حاوی DNA آزاد شده از مولکول پروتئین و چربی میباشند. اما هنوز مخلوطی از مواد اضافه موجود است که به آن شیره خام (crude lysate) بعد از 4 ساعت نمونهها خارج شدند و همحجم آن (100 میکرولیتر نمونه + 100 میکرولیتر بافر لیز کننده جمعاً 200 میکرولیتر) فنل اشباع شده به نمونهها اضافه گردید تا DNA از شیره خام با استفاده از حلالهای غیرقطبی استخراج گردد. نمونهها خوب تکان داد شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید ( سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). نمونهها دو فاز تشکیل دادند که به آرامی با سمپلر فاز رویی کشیده شد و به تیوپ جدید انتقال یافت و فاز زیر آن به همراه تیوب دور انداخته شد. همحجم با فاز رویی که توسط سمپلر کشیده شده بود (در حد 150 میکرولیتر)، به تیوب، مخلوط فنل- کلروفورم (که از قبل به نسبت مساوی با هم مخلوط شدهاند) اضافه شد. تیوبها به خوبی تکان داده شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید. نمونهها دو فاز تشکیل دادند که به آرامی با سمپلر فاز رویی کشیده شد و به تیوپ جدید انتقال یافت و فاز زیر آن به همراه تیوب دور انداخته شد. همحجم با فاز رویی که توسط سمپلر کشیده شده بود (در حد 150 میکرولیتر)، به تیوب، کلروفورم اضافه شد. تیوبها به خوبی تکان داده شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید. محلول رویی با سمپلر کشیده شد و به تیوبهای جدید انتقال یافت. یک دهم حجم آن استات سدیم 3 مولار جهت تغلیظ و تهنشین کردن DNA اضافه شد (محلول استات سدیم باعث یونیزه شدن DNA گشته و حل شدن آن را کاهش میدهد) و به آرامی مخلوط گردید و دو برابر حجم نمونه، الکل مطلق 100-96 درجه سرد اضافه شد. به مدت 20- 15 دقیقه نمونهها در فریزر 20 درجه سانتیگراد زیر صفر قرار داده شد. نمونهها از فریزر خارج گردید و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ شد (سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). مایع رویی تیوپ تخلیه شد و بعد از تکان دادن، جهت خشک شدن الکل موجود در تیوپ، زیر هود قرار داده شد (باید دقت گردد تا نمونه موجود در تیوپ بیش از حد خشک نگردد چون باعث شکسته شدن DNA میگردد که برای انجام مطالعه مطلوب نمیباشد). 50 میکرولیتر آب مقطر استریل به نمونه (DNA) اضافه شد و به یخچال انتقال یافت (در صورتیکه فاصله زمانی آزمایش طولانی باشد نمونهها باید در فریزر 20- درجه سانتیگراد قرار داده شوند (3، 6، 7، 12 و 14). VlhA-PCR و تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه به منظور تأیید نمونهها از روش واکنش زنجیرهای پلیمراز استفاده شد. پرایمرهای استفاده شده اختصاصی ژن VlhA-PCR در مایکوپلاسما سینوویه بودند و این پرایمرها جهت شناسائی MS در کشت خالص و یا نمونه بالینی استفاده شدهاند (5، 10 و 13). پرایمرها عبارت بودند از:
واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد و در تمامی موارد کنترلهای مثبت و منفی همزمان استفاده شد و اجزاء آن عبارت بودند از: Water 17.36µl PCR Buffer (10X) 2.50 µl dNTP (10mM) 0.75 µl F primer (20 pmole/ µl) 0.15 µl R primer (20 pmole/ µl) 0.15 µl Taq DNA polymerase (5U/ µl) 0.10 µl MgC12 (50mM) 2.00 µl Template DNA 1.94 µl
تمامی راکسیونها در ترموسایکر Gradient Mastercycler (Eppendroff، آلمان) انجام گرفت و برنامه آن بهصورت زیر بود:
الکتروفورز قالب ژل آگاروز صفحات شیشهای، شانه و تیغههای کناری را با استفاده از یک ماده شوینده کاملاً تمیز شد (ضخامت شانه و تیغه کناری باید یکسان باشد) و با استفاده از آب مقطر دیونیزه آبکشی گردید. صفحات شیشهای با استفاده از اتانول 95 درجه کاملاً آبگیری شد و در مجاورت هوا خشک شد. قالب ژل از طریق قرار دادن تیغههای کناری در سطح داخلی صفحه پشتی و سپس قرار دادن صفحة رویی بر روی تیغهها بسته شد. بهطوریکه تیغهها کمی خارجتر از لبه پلیتهای شیشهای قرار داده شد بهطوریکه پس از قرار دادن صفحة شیشهای روبی تیغهها به آرامی فشار داده شد تا در جای خود بین دو صفحه قرار گیرند. اطراف و آماده کردن مخلوط ژل آگارز ژل مورد استفاده در این تحقیق آگارز 2 درصد بود که با توجه به درصد مورد نظر پودر آگارز توزین شده و به آن بافر TBE (Tris base, boric acid and ETDA) اضافه شد (2 گرم پودر آگارز در 100 میلیلیتر محلول آگارز). برای تهیه TBE 2 % از TBE 25% استفاده شد بهطوریکه 20 میلیلیتر از این محلول با 480 میلیلیتر آب مقطر مخلوط گردید. برای آماده کردن ژل ابتدا 35/0 گرم از ژل آگارز (Roche،Agarose MP) در 35 میلیلیتر از بافر TBE 2% در یک ارلن ریخته شد و با استفاده از حمام آبجوش حرارت داده شد. حرارت دادن تا حل شدن کامل آگارز ادامه یافت. پس از سرد شدن دمای آن به حدود 50 درجه، 7/1 لاندا اتیدیوم بروماید (ETBr) به آن اضافه شد (این نسبتها برای یک کیت حاوی ژل 15 گودی کافی میباشد). سپس محلول با دقت و به آرامی بدون ایجاد حباب هوا در قالب ژل ریخته شد. برای این منظور از حذف کننده حبابهای هوا (Air bubble remover) استفاده گردید. از تراز سنج جهت یکنواخت پخش شدن ژل در تمام سطوح تانک الکتروفورز استفاده گردید. سپس در ژل و در محل خود قرار داده شد و تا جامد شدن کامل، ژل در دمای اتاق قرار گرفت. پس از آن شانه خارج و ژل در دستگاه الکتروفورز قرار گرفت و محلول 2% TBE تا پوشاندن کامل سطح ژل در تانک ریخته شد. µl 10 از محصول PCR با دو میکرولیتر از بافر بارگذاری (Loading buffer) مخلوط (محلول x1) و در گودههای ژل قرار داده شد. پس از اتمام بارگذاری نمونهها، الکترودها به منبع تغذیه متصل شده، ژل در جریان ثابت 100 ولت به مدت 45 دقیقه قرار گرفت. ژل روی دستگاه UV (BioRAD, Bio-Rad Lab.- California, USA) قرار گرفته و از آن عکس تهیه شد. نتایج نتایج حاصل از تست RSA : از 375 نمونه سرمی اخذ شده از 25 فارم، 19 فارم در تست RSA مثبت شدند. بهطور کلی از 375 نمونه اخذ شده، 143 نمونه در تست RSA مثبت، 203 نمونه منفی و از 29 نمونه سرمی مشکوک، 10 نمونه در رقت یک هشتم مثبت اعلام گردیدند. نتایج حاصل از VlhA-PCR و تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه: به منظور تأیید نمونهها از روش PCR استفاده گردید. در این تحقیق تعداد 240 نمونه اخذ گردید که از این تعداد 48 نمونه (8 فارم) معادل 20 درصد در PCRباند 400-350 را بر روی ژل آگارز نشان دادند که نشان دهنده حضور مایکوپلاسما سینوویه است وMS-H نیز در این بازه قرار دارد. (نگارههای 1 و 2)
نگاره 1- محصول PCR ژن VLhA با استفاده از پرایمرهای خارجی MSConsR و MSConsF L: Gene Ruler 100 bp plus DNA ladder, Lane 1: Positive control (MS-H), Lane 2: Negative control, Lane 3-12: Field Isolated
نگاره 2- محصول PCR ژن VLhA با استفاده از پرایمرهای خارجی MSConsR و MSConsF L: Gene Ruler 100 bp plus DNA ladder, Lane 1: Positive control (MS-H), Lane 2: Negative control, Lane 3-12: Field Isolated
بحث و نتیجهگیری با توجه به اهمیت بیماری مایکوپلاسما سینوویه از جنبه اقتصادی و با توجه به ایجاد بیماریهای تنفسی و مفصلی و با در نظر گرفتن تحمیل هزینههای درمانی دو چندان و عدم پاسخدهی مناسب و عدم بروز حداکثر عملکرد پرندگان آلوده به این باکتری، استفاده از روشهای مبتنی بر شناسایی DNA برای تشخیص مایکوپلاسما سینوویه بهطور مستقیم از بافت یا جدایههای آزمایشگاهی ضروری به نظر میرسد (1). اگرچه میتوان از پروب برای شناسائی مایکوپلاسما سینوویه استفاده نمود اما روش بسیار معمول، تکثیر قطعه اختصاصی از ژنوم باکتری است. برای این منظور کیتهای تجاری نیز در دسترس هستند (1). روشهایی برای تشخیص همزمان انواع مایکوپلاسما در نمونههای بالینی ابداع شده است که از آن جمله میتوان به PCR چندگانه و PCR-RLFP اشاره کرد. نتایج PCR ظرف یک تا دو روز مشخص میشود در حالیکه برای کشت و تعیین هویت ارگانیسم یک تا سه هفته زمان نیاز است. همچنین PCR قادر است نتایج دقیقی در حضور عفونتهای مخلوط با چندین مایکوپلاسما، آلودگی با عفونتهای باکتریایی ثانویه، مهارکنندههای رشد مایکوپلاسما مثل آنتی بادی، آنتی بیوتیک، یا سایر عوامل میزبانی ارائه دهد (1 و 12). بهویژه رشد مایکوپلاسماهای ساپروفیت که رشد سریعتری در محیط غنی شده نسبت به مایکوپلاسما سینوویه دارند از مهمترین مشکلات کشت میباشد. تحقیقات زیادی درباره تشخیص مایکوپلاسما سینوویه صورت گرفته و روشهای مختلفی نیز ارائه شده، بهطوری که Ricardo و همکاران، روشهای مختلفی همچون SPA, HI, ELISA و PCR را بررسی نمود و در این میان PCR را سریعتر و بهتر معرفی نمودند و در میان روشهای PCR، بهترین نتیجه با سوابهای تیمار شده با PBS بهدست آمد و اعلام کردند روش استفاده از فنول برای استخراج DNA با روش غیر فنولی یکسان است (15). در سال 1993Lauerman و همکاران از روی توالی S,rRNA16 پرایمرهای اختصاصی گونه مایکوپلاسما را با نامهای MS-1 و MS-2 طراحی کردند و بیان نمودند حساسیت تست PCR با استفاده از این دو پرایمر 82 درصد و اختصاصی بودن آن در مقایسه با تستهای دیگر همچون روش کشت مایکوپلاسماSPA HI ,Elisa 100 درصد میباشد (10). در سال 2004 Yang Hong و همکاران انتهای N ترمینال، ژن VlhA را که هماگلوتینین را کد میکند، بهعنوان قسمت آلترناتیو مایکوپلاسما سینوویه در نظر گرفتند و از آن بهعنوان نشخیص و شروعی برای تایپینگ نمونه فیلدی مایکوپلاسما سینوویه در طیور تجاری استفاده نمودند (17). Nathan Jeffery و همکاران در سال 2007 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن VlhA و همچنین با استفاده از آزمون SSCP در میان 35 جدایههای مختلف مایکوپلاسما سینوویه توانستند این جدایهها را در 10 پروفایل A تا J قرار دهند که باند حاصله از این پرایمرها 400 جفت بازی است و جدایههای استرالیا در پروفایل A تا D قرار گرفتند در صورتی که جدایههای آمریکا در یکی از پروفایلهای I، H، G، F، E و J قرار گرفتند. آنها از روش آنالیزی HRM استفاده نمودند و اظهار داشتند که استفاده از PCR بر پایه SSCP یا HRM ژن VlhA بیشترین جهشها را در میان جدایههای مایکوپلاسما سینوویه مشخص میکند. طبق نظر ایشان آنالیز HRM روشی سریع و مؤثر است که میتوان در یک لوله در عرض کمتر از یک ساعت آن را انجام داد (5). Ben Abdelmoumen Mardasi و همکاران در سال 2005 با تأکید بر روی ژن VlhA و با استفاده از PCR دوبل از پرایمرهای MS1.2F0 MS1.2R0و MS1-2R1i MS1-2F1i برای تشخیص مایکوپلاسما سینوویه استفاده کردند و بیان نمودند که این روش به حد کافی حساس و اختصاصی است که بتوان با استفاده از این پرایمرها در در این مطالعه، به منظور تأیید نمونهها از روش واکنش زنجیرهای پلیمراز استفاده شد. پرایمرهای استفاده شده اختصاصی ژن VlhA در مایکوپلاسما سینوویه بودند و این پرایمرها جهت شناسائی مایکوپلاسما سینوویه در کشت خالص و یا نمونه بالینی استفاده شدهاند. با استفاده از این پرایمرها تمام سویههای فیلدی، محصولPCR 400-350 جفت بازی را تشکیل دادند (13). آزمون VlhA-PCR جهت تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه با حساسیت 98 درصد با پرایمرهای اختصاصی MScons-F و MScons-R با توجه به تشکیل باند 400-350 جفت بازی برای تمامی جدایههای فیلدی در این مطالعه و سویه واکسینال MSH، با توجه به مطالعه Jeffery و همکاران در 2007 و نتایج حاصل از این مطالعه، میتواند با حساسیت بالا مورد استفاده قرار گیرد (5). | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
مراجع | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
آمار تعداد مشاهده مقاله: 6,403 تعداد دریافت فایل اصل مقاله: 708 |