تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه در نمونه‌های بالینی با استفاده از روش VlhA-PCR

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 7، دوره 3، 4 (12) زمستان، اسفند 1388، صفحه 673-681   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

حسین انصاری¹؛ سید علی پوربخش^{* 2}؛ نریمان شیخی³؛ محمد حسن بزرگمهری فرد³؛ عباس اشتری⁴

¹دانشجوی دوره دکترای تخصصی بیماریهای طیور، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران

²گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران

³گروه علوم درمانگاهی، دانشکده علوم تخصصی دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم وتحقیقات تهران، تهران، ایران

⁴آزمایشگاه رفرانس مایکوپلاسما، مؤسسه تحقیقات واکسن و سرم سازی رازی، کرج، ایران

چکیده

مایکوپلاسما سینوویه به عنوان یکی از اصلی­ترین پاتوژن­های پرندگان، خسارات اقتصادی فراوانی را به صنعت مرغداری وارد می­کند. هدف اصلی این مطالعه شناسایی گونه مایکوپلاسما سینوویه در نمونه­های بالینی با استفاده از روش  VlhA-PCRمی­باشد. برای بررسی تیتر سرمی،  تعداد 375 نمونه سرمی از 25  گله مادر گوشتی اخذ و بر روی آن تست (Rapid Serum Agglutination) RSA انجام گردید که 143 نمونه، معادل 19 گله در آزمایش RSA مثبت گردید. جهت نمونه‌برداری برای (Polymerase Chain Reaction) PCR از 25گله­ای که 19 گله آن در تست RSA مثبت شده بودند، 20 گله انتخاب و سوآپ­های استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه از آنها تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلی­لیتر PBS انداخته شد و به آزمایشگاه منتقل گردید تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. در این مطالعه، از پرایمرهای اختصاصی برای ژن VlhA استفاده شد. محصول PCR  تولیدی توسط پرایمرهای اختصاصی، در 8 گله، باند 400-350 جفت بازی را برای همه سویه­های فیلدی بر روی ژل الکتروفورز تشکیل داد. VlhA-PCR  با حساسیت بسیار بالا می­تواند در تشخیص قطعی عفونت با مایکوپلاسما سینوویه در آزمایشگاه به کار برده شود.

کلیدواژه‌ها

مایکوپلاسما سینوویه؛ نمونه‌های بالینی؛ PCR؛ ژن VlhA

اصل مقاله

مقدمه

 

     مایکوپلاسما سینوویه یکی از عوامل بیماری­زای مهم ماکیان و بوقلمون است که همه ساله خسارت اقتصادی زیادی به صنعت طیور وارد می­­نماید. اگرچه اولین بار مایکوپلاسما سینوویه به عنوان عامل بیماری سینوویت عفونی معرفی شد، اما امروزه علاوه بر سینوویت عفونی به عنوان عامل بیماری تنفسی و عفونت کیسه‌های هوائی نیز شناخته شده است (3، 6 و 12). با وجود پیشرفت‌های ایجاد شده در روش­های کنترل و ریشه‌کنی، مایکوپلاسما سینوویه همچنان در صنعت طیور خصوصاً در گله‌های مرغ مادر از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. شکل تنفسی عفونت مایکوپلاسما سینوویه بیشتر به صورت عفونت تحت بالینی قسمت فوقانی دستگاه تنفس رخ می­دهد. حالت بالینی عفونت به شکل تنفسی، خصوصاً هنگامی که مایکوپلاسما سینوویه با بیماری­های ویروسی مانند بیماری نیوکاسل یا برونشیت عفونی و یا واکسیناسیون با ویروس­های زنده فوق همراه می‌شود، بروز می‌کند که با عفونت کیسه‌های هوایی همراه است و باعث شدیدتر شدن بیماری می‌شود. در برخی موارد، عفونت سیستمیک شده و به سینوویت عفونی منجر می‌شود که یک بیماری عفونی حاد تا مزمن ماکیان و بوقلمون‌ها است و به­طور عمده غشاء سینوویال مفاصل و غلاف تاندون‌ها را درگیر می­کند. متعاقب آن سینوویت اکسوداتیو و بورسیت ایجاد می‌گردد (3، 6 و 8).

تشخیص به موقع مایکوپلاسما هم از جهت پرورش­دهندگان مادر، هم پرورش­دهندگان جوجه­های تجارتی و هم از نظر سازمان دامپزشکی حائز اهمیت می­باشد. مایکوپلاسماها پروکاریوت­های بسیار کوچکی هستند که فاقد دیواره سلولی بوده و به این دلیل در مقابل آنتی­بیوتیک­هایی که روی سنتز دیواره سلولی اثر می‌کنند، مقاوم می­باشند. شکل کلونی‌ها مثل تخم‌مرغ پخته یا تکمه‌ای شکل می‌باشد. همچنین نسبت به احتیاجات پیچیدة غذایی در صورت کمبودشان مقاوم هستند. بعضی از مایکوپلاسما فقط یک نوع حیوان را آلوده می‌کنند ولی بعضی‌ها قادرند در چندین حیوان مختلف ایجاد بیماری نمایند. مایکوپلاسماها در گیاهان، جانوران و انسان و حشرات ایجاد بیماری می‌کنند. به طور عمومی مایکوپلاسماها در سطح مخاطی کلونیزه می‌شوند و اکثراً غیرمهاجم هستند ولی بعضی گونه‌ها مثل مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم قادر به سوراخ کردن سلول‌ها هستند. مایکوپلاسماها به­طور اولیه به غشای مخاطی دستگاه تنفس و یا ادراری- تناسلی، چشم و مفاصل تمایل دارند. بسیاری از آنها به­عنوان انگل‌های سطحی شناخته می‌شوند و به­ندرت بافت­ها را مورد تهاجم قرار می‌دهند. البته انتشار آنها به اندام­های مختلف، بیانگر حداقل یک عفونت عمومی زودگذر است. به­طور کلی، گونه‌های مایکوپلاسما و احتمالاً سویه‌های خاصی تمایل بیشتری به بعضی از بافت­ها یا اندام­ها دارند هر چند این تمایل الزاماً به معنی حذف کامل از سایر اندام­ها نمی­باشد (3، 6 و 8).

با استناد به آنالیز توالی ژن 16S rRNA تصور می‌شود که مایکوپلاسماها حدود 600 میلیون سال قبل با از دست دادن قسمت­های غیر ضروری از ژنوم خود از جمله ژن­های سنتز دیواره سلولی از باکتری­های گرم مثبت و مشخصاً
کلستریدیوم­ها مشتق شده‌اند (15).

تاکنون 23 گونه مختلف مایکوپلاسما از پرندگان جدا شده که ماکیان و بوقلمون میزبان 16 گونه از آنها می‌باشند. در این میان تنها چهار گونه برای طیور بیماری­زا هستند که شامل مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم، مایکوپلاسما سینوویه، مایکوپلاسما مله آگریدیس و مایکوپلاسما آیوا می‌باشد. به دلیل اهمیت نقش بیماری­زایی مایکوپلاسماهای طیور، از سال­ها قبل برنامه
ریشه­کنی از گله‌های مولد به اجرا درآمده است. با این وجود مایکوپلاسماها در گله‌های طیور حضور داشته و عفونت مایکوپلاسمایی همچنان یک معضل بزرگ صنعت طیور محسوب شده و در صورت آلوده شدن گله‌های مولد با ارزش، ممکن است کشتار شده و یا اینکه نتاج آنها ارزش صادرات و فروش خود را از دست بدهند (3، 6 و 8).

مایکوپلاسماها از کلاس Mollicutes، شاخه I یعنی Mycoplasmatales و جنس I یعنی mycoplasma هستند و بیش از 100 گونه دارند. دارای DNA بوده و برای رشد به کلسترول نیاز دارند. درجه حرارت مطلوب برای رشد 37 است. با آنالیز ژن ریبوزوم 16S rRNA می‌توان ارتباط ژنتیکی بین مایکوپلاسماها را بررسی کرد. روش کشت مایکوپلاسما پرزحمت، زمان بر، گران و نیازمند شرایط استریل است. واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز روش جایگزین سریع و اختصاصی برای کشت می‌باشد. در دهه 1990 روش­های مولکولی برای شناسائی مایکوپلاسمای پرندگان توصیف شد. اساس تمام آنها مبتنی بر تکثیر یا شناسائی یک قطعه خاص از ژنوم می‌باشد. در این بین ژن 16S rRNA به دلیل ثبات قابل توجه در گونه‌ها و حتی در میان جنس مورد توجه بیشتر قرار گرفته و با تکثیر، تعیین توالی و یا استفاده از پروب امکان شناسائی ارگانیسم فراهم می‌شود (1، 4، 12 و 14).

 تاکنون تلاش­های زیادی جهت شناسائی و تفریق سویه‌های مایکوپلاسما سینوویه صورت پذیرفته است. ژنوم مایکوپلاسماها حاوی درصد قابل ملاحظه‌ای از توالی‌های تکراری می­باشد. به­طور مثال، در مایکوپلاسما ژنیتالیوم توالی MgPa حدود 7/4 درصد کل ژنوم را به­خود اختصاص می‌دهند، همچنین در مایکوپلاسما گالی‌سپتیکوم، تعداد بیشتر توالی و بزرگتر ژن VLhA (یا PMGA) حدود  4/10 درصد از کل ژنوم را به خود اختصاص داده است. این توالی‌ها نقش خودشان را در تنوع آنتی‌ژنیکی که در سطح سلول ایجاد می‌کنند، اجرا می­کنند و کشف اندازه‌ آنتی‌ژنیکی و تنوع فاز احتمالاً به­عنوان یکی از بزرگ­ترین پیشرفت­ها در تحقیقات مایکوپلاسما‌‌ها بوده همچنین تنوع فازی یا اندازه می‌تواند نقش کلیدی در حدّت، اتصال و دفاع میزبان، برای مایکوپلاسما داشته باشد (9، 10، 11، 13 و 16).

مواد و روش‌کار

نمونه برداری و انجام RSAT

375 نمونه سرمی از 25 گله مادر گوشتی اخذ گردید و جهت انجام تست RSA به آزمایشگاه سرولوژی انتقال یافت. برای انجام تست RSA مراحل زیر انجام شد:

یک حجم از سرم (تقریباً معادل ) روی یک کاشی سفید ریخته و یک حجم از آنتی­ژن رنگی مایکوپلاسما سینوویه به آن اضافه گردید. به منظور مخلوط نمودن آنتی­ژن و سرم، کاشی به­شکل دورانی تکان داده شد. در صورت وجود آنتی­بادی علیه مایکوپلاسما سینوویه پدیده آگلوتیناسیون اتفاق می‌افتاد که با گرد هم­آمدن ذرات معلق در مایع مشخص می­گردید (سرم مرغ حداکثر در مدت 2 دقیقه و سرم بوقلمون در مدت 3 دقیقه با آنتی ژن آگلوتینه می‌شود). در خصوص تأیید تشخیص مایکوپلاسما سینوویه کلیه سرم­های مثبت مرحله قبل به مدت 30 دقیقه در بن ماری 56 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و آزمایش تکرار گردید (جهت غیرفعال­سازی واکنشگرهای غیر اختصاصی). سرم­های مثبت مرحله قبل با PBS رقیق و آزمایش تکرار شد در صورتی­که سرم­ها در رقت یک هشتم با آنتی­ژن مایکوپلاسما سینوویه آگلوتینه می­شدند از نظر تست سریع مثبت و در صورت عدم آگلوتیناسیون منفی قلمداد می‌شدند. جهت تسریع و سهولت کار مراحل 4 و 5 ادغام شده یعنی ابتدا رقت  تهیه گردید و سپس به­مدت 30 دقیقه در بن­ماری 56 درجه سانتی­گراد قرار داده شد و بعد آزمایش را تکرار گردید. نتیجه این آزمایش به صورت مثبت (+) یا منفی
(-) گزارش شد (4).

نمونه‌برداری جهت PCR

جهت نمونه‌برداری برای PCR، از 20 گله­ای که 19 گله آنها در تست RSA مثبت شده بودند، سوآپ­های استریل از شکاف کامی، نای، کیسه هوایی و ریه تهیه گردید. سه سوآپ از سه پرنده داخل یک لوله آزمایش حاوی یک میلی­لیتر PBS انداخته و به آزمایشگاه منتقل شد تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. 

مراحل استخراج DNA به روش فنل کلروفورم

ابتدا مقدار 500 میکرولیتر از نمونه مورد نظر بعد از قرار دادن در همزن به درون میکروتیوپ 5/1 میلی­لیتری انتقال داده شد و جهت رسوب‌گیری به مدت 15 دقیقه در13000 دور سانتریفوژ گردید (نمونه­ها حاوی ذرات بزرگ بودند که ابتدا به مدت 5 دقیقه در 3000 دور سانتریفوژ شدند و  محلول رویی به تیوب جدید منتقل گردید و تیوب حاوی مواد ته‌نشین شده حذف گردید. سپس مراحل بعدی روی محلول رویی انجام گردید). پس از سانتریفوژ، تیوب­های نمونه­ها تخلیه گردید و در حد 100 میکرولیتر در ته آن باقی ماند. سپس هم­حجم مقدار
باقی­مانده (100 میکرولیتر)  در تیوب، بافر لیزکننده اضافه گردید. سپس به خوبی مخلوط گردیده آنگاه در همزن، تکان داده شد و در بن‌ماری 56 درجه سانتی­گراد به مدت 4-5/3 ساعت قرار داده شد. ترکیبات تشکیل دهنده بافر لیز کننده در زیر آمده است. به ازاء هر 200 میلی­لیتر از محلول بالا، 20 میلی لیتر پروتئیناز K اضافه گردید.

 

Lysis Buffer :
50 Mm (pH=8)	Tris-Hcl
1%	SDS
100 Mm	NaCl
50 Mm	EDTA
1ml (2mg/µl)	Proteinase K

 

در این مرحله تریس با pH برابر 8 نقش بافر، EDTA به عنوان مهارکننده آنزیم­های DNAase، SDS به عنوان حل کننده چربی­های موجود در غشاء سلول و نمونه و پروتئیناز K به عنوان هضم­کننده پروتئین­ها و اتصالات بین سلولی عمل می­کند. در این مرحله نمونه­ها حاوی DNA آزاد شده از مولکول پروتئین و چربی می­باشند. اما هنوز مخلوطی از مواد اضافه موجود است که به آن شیره خام (crude lysate)
می­گویند.

بعد از 4 ساعت نمونه­ها خارج شدند  و هم­حجم آن (100 میکرولیتر نمونه + 100 میکرولیتر بافر لیز کننده جمعاً 200  میکرولیتر) فنل اشباع شده به نمونه­ها اضافه گردید تا DNA از شیره خام با استفاده از حلال­های غیرقطبی استخراج گردد. نمونه­ها خوب تکان داد شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید ( سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). نمونه­ها دو فاز تشکیل دادند که به آرامی با سمپلر فاز رویی کشیده شد و به تیوپ جدید انتقال یافت و فاز زیر آن به همراه تیوب دور انداخته شد. هم­حجم با فاز رویی که توسط سمپلر کشیده شده بود (در حد 150 میکرولیتر)، به تیوب، مخلوط فنل- کلروفورم (که از قبل به نسبت مساوی با هم مخلوط شده‌اند) اضافه شد. تیوب­ها به خوبی تکان داده شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید.

نمونه­ها دو فاز تشکیل دادند که به آرامی با سمپلر فاز رویی کشیده شد و به تیوپ جدید انتقال یافت و فاز زیر آن به همراه تیوب دور انداخته شد. هم­حجم با فاز رویی که توسط سمپلر کشیده شده بود (در حد 150 میکرولیتر)، به تیوب، کلروفورم اضافه شد. تیوب­ها به خوبی تکان داده شد و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ گردید.

محلول رویی با سمپلر کشیده شد و به تیوب­های جدید انتقال یافت. یک دهم حجم آن استات سدیم 3 مولار جهت تغلیظ و ته­نشین کردن DNA اضافه شد (محلول استات سدیم باعث یونیزه شدن DNA گشته و حل شدن آن را کاهش می­دهد) و به آرامی مخلوط گردید و دو برابر حجم نمونه، الکل مطلق 100-96 درجه سرد اضافه شد. به مدت 20- 15 دقیقه نمونه­ها در فریزر 20 درجه سانتی­گراد زیر صفر قرار داده شد. نمونه­ها از فریزر خارج گردید و به مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفوژ شد (سانتریفوژ از نوع رومیزی معمولی بدون یخچال با دمای نزدیک به دمای اتاق بود). مایع رویی تیوپ تخلیه شد و بعد از تکان دادن، جهت خشک شدن الکل موجود در تیوپ، زیر هود قرار داده شد (باید دقت گردد تا نمونه موجود در تیوپ بیش از حد خشک نگردد چون باعث شکسته شدن DNA می­گردد که برای انجام مطالعه مطلوب نمی­باشد). 50 میکرولیتر آب مقطر استریل به نمونه (DNA) اضافه شد و به یخچال انتقال یافت (در صورتی­که فاصله زمانی آزمایش طولانی باشد نمونه­ها باید در فریزر 20- درجه سانتی­گراد قرار داده شوند (3، 6، 7، 12 و 14).

VlhA-PCR و تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه

به منظور تأیید نمونه­ها از روش واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز استفاده شد. پرایمرهای استفاده شده اختصاصی ژن VlhA-PCR در مایکوپلاسما سینوویه بودند و این پرایمرها جهت شناسائی MS در کشت خالص و یا نمونه بالینی استفاده شده‌اند (5، 10 و 13). پرایمرها عبارت بودند از:

 

توالی نوکلئوتیدی	نام پرایمر
TACTATTAGCAG CTAGTGC	MScons-F
AGTAACCGATCCGCTTAAT’	MScons-R

 

واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر انجام شد و در تمامی موارد کنترل‌های مثبت و منفی هم­زمان استفاده شد و اجزاء آن عبارت بودند از:

Water                                                  17.36µl

PCR Buffer (10X)                              2.50 µl

dNTP (10mM)                                    0.75 µl

F primer (20 pmole/ µl)                       0.15 µl

R primer (20 pmole/ µl)                       0.15 µl

Taq DNA polymerase (5U/ µl)           0.10 µl

MgC12 (50mM)                                  2.00 µl

Template DNA                                  1.94 µl

 

تمامی راکسیون­ها در ترموسایکر Gradient Mastercycler (Eppendroff، آلمان) انجام گرفت و برنامه آن به­صورت زیر بود:

 

نام مرحله	درجه حرارت	مدت زمان	تعداد چرخه
دناتوراسیون اولیه	94	‘2	1
دناتوراسیون ثانویه	96	“15	35
اتصال پرایمر	54	“15	35
گسترش اولیه	72	“20	35
گسترش نهایی	72	‘5	1

 

 

الکتروفورز

قالب ژل آگاروز

صفحات شیشه‌ای، شانه و تیغه‌های کناری را با استفاده از یک ماده شوینده کاملاً تمیز شد (ضخامت شانه و تیغه کناری باید یکسان باشد) و با استفاده از آب مقطر دیونیزه آبکشی گردید. صفحات شیشه‌ای با استفاده از اتانول 95 درجه کاملاً آبگیری شد و در مجاورت هوا خشک شد. قالب ژل از طریق قرار دادن تیغه‌های کناری در سطح داخلی صفحه پشتی و سپس قرار دادن صفحة رویی بر روی تیغه‌ها بسته شد. به­طوری­که تیغه‌ها کمی خارج‌تر از لبه پلیت‌های شیشه‌ای قرار داده شد به­طوری­که پس از قرار دادن صفحة شیشه‌ای روبی تیغه‌ها به آرامی فشار داده شد تا در جای خود بین دو صفحه قرار گیرند. اطراف و


زیر قالب با استفاده از یک نوار چسب با کیفیت خوب آب‌بندی شد. (1).

آماده کردن مخلوط ژل آگارز

ژل مورد استفاده در این تحقیق آگارز 2 درصد بود که با توجه به درصد مورد نظر پودر آگارز توزین شده و به آن بافر TBE (Tris base, boric acid and ETDA) اضافه شد (2 گرم پودر آگارز در 100 میلی­لیتر محلول آگارز).

برای تهیه TBE 2 % از TBE 25% استفاده شد به­طوری­که 20 میلی­لیتر از این محلول با 480 میلی­لیتر آب مقطر مخلوط گردید. برای آماده کردن ژل  ابتدا 35/0 گرم از ژل آگارز (Roche،Agarose MP) در 35 میلی‌لیتر از بافر TBE 2% در یک ارلن ریخته شد و با استفاده از حمام آب­جوش حرارت داده شد. حرارت دادن تا حل شدن کامل آگارز ادامه یافت. پس از سرد شدن دمای آن به حدود 50 درجه، 7/1 لاندا اتیدیوم بروماید (ETBr) به آن اضافه شد (این نسبت­ها برای یک کیت حاوی ژل 15 گودی کافی می­باشد). سپس محلول با دقت و به آرامی  بدون ایجاد حباب هوا در قالب ژل ریخته شد. برای این منظور از حذف کننده حباب­های هوا (Air bubble remover) استفاده گردید. از تراز سنج جهت یکنواخت پخش شدن ژل در تمام سطوح تانک الکتروفورز استفاده گردید. سپس در ژل و در محل خود قرار داده شد و تا جامد شدن کامل، ژل در دمای اتاق قرار گرفت. پس از آن شانه خارج و ژل در دستگاه الکتروفورز قرار گرفت و محلول 2% TBE تا پوشاندن کامل سطح ژل در تانک ریخته شد. µl 10 از محصول PCR با دو میکرولیتر از بافر بارگذاری (Loading buffer) مخلوط (محلول x1) و در گوده‌های ژل قرار داده شد. پس از اتمام بارگذاری نمونه‌ها، الکترودها به منبع تغذیه متصل شده، ژل در جریان ثابت 100 ولت به مدت 45 دقیقه قرار گرفت. ژل روی دستگاه UV (BioRAD, Bio-Rad Lab.- California, USA) قرار گرفته و از آن عکس تهیه شد.

نتایج

نتایج حاصل از تست RSA :

از 375 نمونه سرمی اخذ شده از 25 فارم، 19 فارم در تست RSA مثبت شدند. به­طور کلی از  375 نمونه اخذ شده، 143 نمونه در تست RSA مثبت، 203 نمونه منفی و از 29 نمونه سرمی مشکوک، 10 نمونه در رقت یک هشتم مثبت اعلام گردیدند.

نتایج حاصل از VlhA-PCR و تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه:

به منظور تأیید نمونه­ها از روش PCR استفاده گردید. در این تحقیق تعداد 240 نمونه اخذ گردید که از این تعداد 48 نمونه (8 فارم) معادل 20 درصد در  PCRباند 400-350 را بر روی ژل آگارز نشان دادند که نشان دهنده حضور مایکوپلاسما سینوویه است وMS-H  نیز در این بازه قرار دارد. (نگاره­های   1 و 2)

 

 

 

350

 

 

400

 

 

L  1  2  3   4    5  6  7  8   9  10  11 12

 

 

 

 

نگاره 1- محصول PCR ژن VLhA با استفاده از پرایمرهای خارجی MSConsR و MSConsF

L: Gene Ruler 100 bp plus DNA ladder, Lane 1: Positive control (MS-H), Lane 2: Negative control, Lane 3-12: Field Isolated

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

350

 

 

400

 

 

L  1  2  3   4    5  6  7  8   9  10  11 12

 

 

 

 

نگاره 2- محصول PCR ژن VLhA با استفاده از پرایمرهای خارجی MSConsR و MSConsF

L: Gene Ruler 100 bp plus DNA ladder, Lane 1: Positive control (MS-H), Lane 2: Negative control, Lane 3-12: Field Isolated

 

 

بحث و نتیجه­گیری

     با توجه به اهمیت بیماری مایکوپلاسما سینوویه از جنبه اقتصادی و با توجه به ایجاد بیماری­های تنفسی و مفصلی و با در نظر گرفتن تحمیل هزینه­های درمانی دو چندان و عدم پاسخ­دهی مناسب و عدم بروز حداکثر عملکرد پرندگان آلوده به این باکتری، استفاده از روش­های مبتنی بر شناسایی DNA برای تشخیص مایکوپلاسما سینوویه به­طور مستقیم از بافت یا جدایه‌های آزمایشگاهی ضروری به نظر می­رسد (1). اگرچه می‌توان از پروب برای شناسائی مایکوپلاسما سینوویه استفاده نمود اما روش بسیار معمول، تکثیر قطعه اختصاصی از ژنوم باکتری است. برای این منظور کیت‌های تجاری نیز در دسترس هستند (1). روش­هایی برای تشخیص همزمان انواع  مایکوپلاسما در نمونه‌های بالینی ابداع شده است که از آن جمله می‌توان به PCR چندگانه و PCR-RLFP اشاره کرد. نتایج PCR ظرف یک تا دو روز مشخص می‌شود  در حالی­که برای کشت و تعیین هویت ارگانیسم یک تا سه هفته زمان نیاز است. همچنین PCR  قادر است نتایج دقیقی در حضور عفونت‌های مخلوط با چندین مایکوپلاسما، آلودگی با عفونت‌های باکتریایی ثانویه، مهارکننده‌های رشد مایکوپلاسما مثل آنتی بادی، آنتی بیوتیک، یا سایر عوامل میزبانی ارائه دهد (1 و 12). به­ویژه رشد مایکوپلاسماهای ساپروفیت که رشد سریع­تری در محیط غنی شده نسبت به مایکوپلاسما سینوویه دارند از مهم­ترین مشکلات کشت می‌باشد.

تحقیقات زیادی درباره تشخیص مایکوپلاسما سینوویه صورت گرفته و روش­های مختلفی نیز ارائه شده، به­طوری که Ricardo و همکاران، روش­های مختلفی همچون SPA, HI, ELISA و PCR را بررسی نمود و در این میان     PCR را سریع­تر و بهتر معرفی نمودند و در میان روش­های PCR، بهترین نتیجه با سواب­های تیمار شده با PBS به­دست آمد و اعلام کردند روش استفاده از فنول برای استخراج DNA با روش غیر فنولی یکسان است (15).

در سال 1993Lauerman  و همکاران از روی توالی S,rRNA16 پرایمرهای اختصاصی گونه مایکوپلاسما را با نام­های MS-1 و MS-2 طراحی کردند و بیان نمودند حساسیت تست PCR با استفاده از این دو پرایمر 82 درصد و اختصاصی بودن آن در مقایسه با تست­های دیگر همچون روش کشت مایکوپلاسماSPA HI ,Elisa  100 درصد می­باشد (10).

در سال 2004  Yang Hong و همکاران انتهای N ترمینال، ژن  VlhA را که هماگلوتینین را کد می­کند، به­عنوان قسمت  آلترناتیو مایکوپلاسما سینوویه در نظر گرفتند و از آن به­عنوان نشخیص و شروعی برای تایپینگ نمونه فیلدی مایکوپلاسما سینوویه در طیور تجاری استفاده نمودند (17).

Nathan Jeffery  و همکاران در سال 2007 با استفاده از پرایمرهای اختصاصی ژن VlhA و همچنین با استفاده از آزمون SSCP در میان 35 جدایه­های مختلف مایکوپلاسما سینوویه توانستند این جدایه­ها را در 10 پروفایل A تا J قرار دهند که باند حاصله از این پرایمرها 400 جفت بازی است و جدایه­های استرالیا در پروفایل A تا D قرار گرفتند در صورتی که جدایه­های آمریکا در یکی از پروفایل­های I، H، G، F، E و  J قرار گرفتند.

آنها از روش آنالیزی HRM استفاده نمودند و اظهار داشتند که استفاده از PCR بر پایه SSCP یا HRM ژن VlhA بیشترین جهش­ها را در میان جدایه­های مایکوپلاسما سینوویه مشخص می­کند. طبق نظر ایشان آنالیز HRM روشی سریع و مؤثر است که می­توان در یک لوله در عرض کمتر از یک ساعت آن را انجام داد (5).

Ben Abdelmoumen Mardasi و همکاران در سال 2005 با تأکید بر روی ژن VlhA و با استفاده از PCR  دوبل  از پرایمرهای  MS1.2F0 MS1.2R0و MS1-2R1i MS1-2F1i  برای تشخیص  مایکوپلاسما سینوویه استفاده کردند و بیان نمودند که این روش به حد کافی حساس و اختصاصی است که بتوان با استفاده از این پرایمرها در
عفونت­های توأم، مایکوپلاسما سینوویه را از مایکوپلاسما گالی­سپتیکوم تفریق نمود (2).

در این مطالعه، به منظور تأیید نمونه­ها از روش واکنش زنجیره‌ای پلی­مراز استفاده شد. پرایمرهای استفاده شده اختصاصی ژن VlhA در مایکوپلاسما سینوویه بودند و این پرایمرها جهت شناسائی مایکوپلاسما سینوویه در کشت خالص و یا نمونه بالینی استفاده شده‌اند. با استفاده از این پرایمرها تمام سویه­های فیلدی، محصولPCR  400-350 جفت بازی را تشکیل دادند (13).

آزمون VlhA-PCR جهت تشخیص گونه مایکوپلاسما سینوویه با حساسیت 98 درصد با پرایمرهای اختصاصی MScons-F و MScons-R با توجه به تشکیل باند 400-350 جفت بازی برای تمامی جدایه­های فیلدی در این مطالعه و سویه واکسینال MSH، با توجه به مطالعه Jeffery و همکاران در 2007 و نتایج حاصل از این مطالعه، می­تواند با حساسیت بالا مورد استفاده قرار گیرد (5).

مراجع

1. حسینی، ا. (1386): تعیین هویت مولکولی مایکوپلاسما سینوویه جدا شده از مرغداری­های صنعتی استان مازندران، رساله دکترای تخصصی بیماری­های طیور، دانشکده دامپزشکی دانشگاه علوم تحقیقات تهران، صفحات: 89-1.
2. Ben, B., Abdelmoumen Mardassi, R., Ben Mohamed, I., Gueriri, S. and Boughattasand B. (2005): Duplex PCR  to differentiate between mycoplasma synoviae  and mycoplasma gallisepticum on the basis of conserved species-specific sequence of their hemagglutinin gene,journal of clinical microbiology, pp: 48-958.
3. Bradbury, Y. (2001): Avian Mycoplasma. Work shop of European Mycoplasma specialist. World poultry Sci.J., 61: 355-357.
4. Fiorentin, L., Mores M., Trevison, I.M. and Antunes, S.C. (2003): Test profiles of broiler breeder flocks housed in farms with endemic Mycoplasma synoviae infection. Brazilian journal of poultry science, pp: 38-49.
5. Nathan, J. and Gasser, R. (2007): Classification of mycoplasma synoviae strains using single-strand conformation polymorphism and high-resolution melting-curve andlysis of the VlhA gene single-copy region, Microbiology, 153: 2679-2688.
6. Jordan, F., Mark, P., Denis A. and Trevor, F. (2002): Poultry Disease, fifth Edition, p: 178-193
7. Kiss, I., Matiz, K., Kaszanitsky, E., Chavez, Y. and Johnsson, K.E. (1997): Detection and identification of avian mycoplasma by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism  assay. Vet. Microbial. pp
8. Kleven, S.H. (2008): Mycoplasmosis.In: Saif, Y.M., Barnes, H.J., Gilsson, J.R., Fadly, A.M., Mc Dongald, L.R. and swayne, D.E. Diseases of Poultry. 12th.ed. Iowa state university press (A Blackwell Publishing Company). pp: 719-722.
9. Lockaby, S.B., Hoerr, F.J., Lauerman, L.H., Smith, B.F., Samoylov, A.M., Toivio-Kinnucan, M.A.and et al (1999): Factors associated with virulence of Mycoplasma synoviae. Avian Dis. Apr-Jun, 43(2): 251-256.
10. Lauerman, H., Sharpton, A. (1993): Development and application of a polymerase chain reaction assay for mycoplasma synoviae, avian disease, vol. 37: 829-834.
11. Noormohamadi, A.H., Markham, P.F., Kanci, A., Whither, K.G. and Browing, G.F. (2002): A novel mechanism for control of antigenic variation in the hemagglutining gene family of Mycoplasma synoviae. Mol. Microbial. 35: 911-923.
12. Noormohamadi, A.H., Hemmatzadeh, F. and Whither, K.G. (2007): Safety and Efficacy of the Mycoplasma Synoviae MS-H Vaccine in Turkeys. Avian Disease Preprint; N/A-N/A.
13. OIE terrestrial manual. (2008): Avian mycoplasmosis, chapter 3.5.6. pp: 482-512.
14. Ramirez, A., clive J., Naylor, P., Hammond, j. and Bradbury, M. (2006): Development and evaluation of a diagnostic PCR for Mycoplasma synoviae using primers located in The intergenic spacer region dna 23s rRNA gene. Veterinary Microbiology, 118: 76-82.
15. Ricardo, M. and Silveria, L.F. (1996): polymerase chain reaction  optimization for mycoplasma  synoviae  diagnosis,avian disease , vol 40:218-222.
16. Senties-Cue, G., Shivaprasad, H.L., Chin, R.P. (2005): Systemic Mycoplasma synoviae infection in broiler chickens. Avian Pathol. Apr; 34(2): 137-42.s
17. Yang Hong ,Marcarmen Garcia, (2004): Specific Detection and typing of mycoplasma synoviae strains in poultry with pcr and DNA sequence analysiss targeting the Hemagglutinin encoding Gene VlhA, Avian Disease, vol, 48:606-616.
18. Yogev, D., Levision, S., Kleven, S.H., Halachmi, D. and Razhn, S. (1998): Ribosomal RNA gene probes to detect intraspecies heterogenecity hn Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae. Avian Disease; 32: 220-231.