مطالعه کارآیی روش تشخیصی آزمایش مستقیم میکروبی، PCR900IS و کشت میکروبی در تشخیص باکتری مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس در مدفوع گاوهای به ظاهر سالم

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 6، دوره 2، 4 (8) زمستان، اسفند 1387، صفحه 309-317   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

یونس انزابی^{* 1}؛ صمد فراشی بناب²؛ غلامعلی مقدم³

¹گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران

²گروه میکروبیولوژی و ایمونولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

³گروه علوم درمانگاهی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه تبریز، تبریز، ایران

چکیده

     بیماری یون یا پاراتوبرکلوزیس نوعی آنتریت گرانولوماتوزی مزمن در نشخوارکنندگان با عامل مسبب مایکوباکتریوم اویوم تحت گونه پاراتوبرکلوزیس (MAP) می­باشد و خسارات اقتصادی فراوانی به صنعت دامپروری به‌خصوص گاوداری شیری در سراسر دنیا وارد می­کند. تشخیص MAP در نمونه­های بالینی با روش کشت میکروبی به عنوان روش استاندارد طلایی به 16-6 هفته زمان نیاز دارد. از طرف دیگر شناسایی سریع و دقیق گاوهای دفع کننده میکروب فوق در مدفوع برای کنترل موفق بیماری در گله لازم است. در این تحقیق، بر روی مدفوع 100 رأس گاو به ظاهر سالم از گاوداری­های صنعتی تبریز با سابقه بیماری یون، آزمایش مستقیم میکروبی با رنگ­آمیزی ذیل­نلسن، کشت میکروبی در محیط زرده تخم­مرغ هرولد و دو روش  direct PCRبر پایه عنصر 900IS انجام شد. در آزمایش مستقیم میکروسکوپی 7 نمونه (7 درصد)، در کشت میکروبی 14 نمونه (14 درصد)، در PCR با جفت ­پرایمر 91F/90F 15 نمونه (15 درصد) و در PCR با جفت ­پرایمر 26FP/25FP 25 نمونه (25 درصد) مثبت ثبت شدند. این نتایج نشان داد روش PCR تعداد موارد مثبت بیشتری را شناسایی می­کند، بنابراین می­توان از آن برای شناسایی سریع و در عین حال دقیق­تر گاوهای دفع کننده MAP در مدفوع استفاده کرد. هم‌چنین نوع پرایمر در حساسیت تست PCR نقش مهمی ایفا می­کند.

کلیدواژه‌ها

یماری یون؛ آزمایش مستقیم میکروبی؛ کشت مدفوع؛ PCR؛ مایکوباکتریوم اویوم تحت‌گونه پاراتوبرکلوزیس

اصل مقاله

مقدمه

 

       بیماری یون (Johne) یا پاراتوبرکلوزیس (Paratuberculosis) نوعی آنتریت گرانولوماتوزی مزمن می­باشد که توسط باکتری مایکوباکتریوم اویوم تحت­گونه پاراتوبرکلوزیس (Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) (MAP) ایجاد می­شود (21). MAP یک باکتری اسیدفست (acid fast)، وابسته به مایکوباکتین (mycobactin) و بسیار کند رشد بوده و تمایل به تشکیل توده دارد (6 و 16). بیماری در سراسر دنیا اتفاق می­افتد و از عوامل مهم مرگ و میر در نشخوارکنندگان به‌خصوص گاو می‌باشد و خسارات اقتصادی فراوانی به صنعت دامپروری وارد می­کند. بیماری در گاو در کشورهای در حال توسعه اندمیک است (37). درایران در اکثر استان­های کشور وجود بیماری به اثبات رسیده است (1 و30).

  فرم بالینی بیماری با اسهال پایدار، کاهش وزن، کاهش تولید شیر و در نهایت مرگ یا حذف زودرس دام از گله مشخص می­شود (37). در گاو با توجه به طولانی بودن دوره کمون بیماری معمولاً علائم درمانگاهی تا قبل از دو سالگی ظاهر نمی‌شود و بروز علائم در سنین 6-2 سالگی معمول است. دوره بیماری از هفته‌ها تا ماه­ها متغیر است ولی همیشه منجر به دهیدراتاسیون، لاغری و ضعف می‌شود (1). علاوه بر زیان­های اقتصادی (در اثر کاهش وزن، کاهش تولید شیر، کاهش بازده تولید مثلی و افزایش مرگ و میر) (21)، برخی از محققین معتقدند ارتباط احتمالی بین باکتری عامل بیماری یون و بیماری کرون (Crohn) انسان وجود دارد (15، 29 و 32).

 اکثر حیوانات در اوایل زندگی آلوده می­شوند و راه انتقال عفونت عمدتاً راه مدفوعی-دهانی (faecal-oral) است (23). باکتری در مدفوع و شیر گاوهای آلوده دفع می‌شود. حتی گاوهای آلوده ممکن است از 18 ماه قبل از بروز علایم بالینی باکتری را دفع کنند و گاوهای مبتلا به فرم بالینی می­توانند تا 10¹²×5 سلولMAP  را در مدفوع دفع کنند (3، 5 و 7). بنابراین شناسایی گاوهای دفع کننده عامل یون در مدفوع برای جلوگیری از گسترش عفونت در گله لازم و ضروری می‌باشد. در گذشته کشت مدفوع را حساس­ترین، اختصاصی­ترین و معمول­ترین روش برای تشخیص فرم بالینی و تحت­بالینی بیماری گاو در نظر می­گرفتند. اگرچه هنوز هم این روش ابزار قدرتمندی برای کنترل بیماری در این حیوان محسوب می­شود، استفاده گسترده از آن به دلیل پرهزینه و وقت­گیر بودن محدود شده است (11 و 27). تشخیص سریع MAP با روش آزمایش مستقیم میکروسکپی (Direct micriscopic test) قابل انجام است (13، 21 و 38). در سال­های اخیر PCR هم برای تشخیص باکتری مذکور توسعه یافته است (33 و 36). در این مطالعه کارآیی سه روش کشت میکروبی، آزمایش مستقیم میکروسکپی و PCR در تشخیص MAP در مدفوع گاو بررسی شده است. برای انجام PCR از دو روشdirect PCR (PCR مستقیم) بر پایه عنصر 900IS استفاده شد. 900IS قطعه­ نوکلئوتیدی به طول 1451 جفت­باز است که تصور می­شود برای MAP اختصاصی باشد (10).

 مواد و روش‌کار

     نمونه مدفوع 100 رأس گاو به ظاهر سالم از تعدادی گاوداری­ صنعتی تبریز که سابقه بیماری یون در پرونده بهداشتی آن گاوداری­ها در 3-2 سال گذشته ثبت شده بود، جمع­آوری و به آزمایشگاه ارسال شد. جمع­آوری نمونه­ها از رکتوم انجام می­شد.

رنگ­آمیزی ذیل­نلسن: گسترش­های میکروبی تهیه شده از مدفوع با تکنیک ذیل­نلسن رنگ­آمیزی شدند و از نظر وجود باکتری‌های اسیدفست با عدسی 100 میکروسکوپ نوری بررسی شدند. وجود باسیل­های اسیدفست که به تعداد زیاد و به صورت کلامپ (مجتمع) مشاهده می‌شدند نشانه مثبت بودن آزمایش بود (38).

کشت میکروبی: 1 گرم مدفوع با 20 میلی­لیتر هگزادسیل پریدنیوم­کلراید (Hexadecyl Pridnium Chloride) 75/0 درصد آلوده­زدایی می­شد (در دمای آزمایشگاه و به مدت 18 ساعت). محلول آلوده­زدایی شده را به مدت 15 دقیقه در g3000 سانتریفوژ‍‍ کرده و 1/0 میلی­لیتر رسوب حاصله جهت کشت در محیط زرده تخم­مرغ هرولد (Herrolds’ egg yolk media) به کار می­رفت. از هر نمونه مدفوع در چهار محیط کشت مذکور کشت داده شد که سه تا از محیط­های کشت واجد مایکوباکتین J (ml 1000/mg2) یا چند برابر عصاره کشت خالص مایکوباکتریوم فلئی (M. phelei) و لوله چهارم فاقد آن بود. لوله­ها به مدت 16 هفته در Cº 37  انکوبه شدند. پس از اتمام دوره رشد و تشکیل پرگنه­های باکتری­ها، پرگنه­های MAP با بررسی مشخصات پرگنه­ها، رشد باکتری فقط در محیط­های واجد مایکوباکتین و تهیه گسترش میکروبی و رنگ­آمیزی ذیل­نلسن تأیید می­شدند (14).

استخراج DNA: با استفاده از لیزوزیم، SDS، پروتئیناز K و CTAB (N-cetyl-N, N, N- trimethyl ammonium bromide) مطابق پروتکل اقدام به استخراج DNA از رسوب شد (34).

PCR: دو روش direct PCR با دو جفت­پرایمر 91F/90F و 26FP/25FP (ساخت شرکت طوبی­نگین-تهران) بر روی هر نمونه انجام شد. توالی نوکلئوتیدی پرایمرها به شرح زیر می‌باشد (24):

P90: 5'-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3'/

P91: 5'-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3'

FP25:5'-CCAGGGACGTCGGGTATGGC-3'/

FP26: 5'-GGTCGGCCTTACCGGCGTCC-3' 

PCR mix (حجم µl 50) برای جفت­پرایمر 91F/90F عبارت بود از: µM 200 dNTP mix، mM 5/2 MgCl₂، Mm 50 KCl، mM 20 Tris-Cl (4/8=PH)،  µl1 از هر پرایمر، 2 واحد DNA پلیمراز Taq (شرکت طوبی نگین، تهران) و ng 100 DNA الگو و برنامه PCR عبارت بود از: ´5/˚C94 (مرحله واسرشتگی اولیه)، 35 چرخه: ً40/˚C94، ´1/˚C65 و ´1/˚C72 و در نهایت´7/˚C72 (مرحله گسترش نهایی).      

PCR mix (حجم µl 50) برای جفت ­پرایمر 26FP/25FP شامل µM 200 dNTP mix، mM 2 MgCl₂، Mm 50 KCl، mM 20 Tris-Cl (4/8=PH)،  µl1 از هر پرایمر، 2 واحد DNA پلیمراز Taq (شرکت طوبی نگین، تهران) و ng 100 DNA الگو بود. برنامه PCR به قرار زیر بود: ´4/˚C94 (مرحله واسرشتگی اولیه)، 35 چرخه:  ً30/˚C94، ً30/˚C70 و ً40/˚C72 و در نهایت´7/˚C72 (مرحله گسترش نهایی). 

پس از اتمام PCR، محصولات PCR در ژل 1 درصد آگار الکتروفورز شد و پس از رنگ­آمیزی با اتیدیوم بروماید (Ethidium bromide) (µg/ml0/5) ژل­ زیر اشعه UV بررسی می­شد. اندازه محصول PCR با جفت ­پرایمر 91F/90F 400 جفت­باز (bp) و اندازه محصول PCR با جفت­پرایمر 26FP/25FP 228 جفت­باز می­باشد. به عنوان کنترل منفی از آب مقطر استریل و به عنوان کنترل مثبت از MAP تأیید شده استفاده شد. 

آنالیز آماری: جهت مشخص کردن میزان توافق (agreement) تست­های مورد استفاده در این تحقیق از تست Kappa استفاده شد.

نتایج

    در آزمایش مستقیم میکروسکوپی 7 نمونه، در کشت میکروبی 14 نمونه، در PCR با جفت­پرایمر 91F/90F 15 نمونه و در PCR با جفت ­پرایمر 26FP/25FP 25 نمونه مثبت ثبت شدند (نمودار 1). تصاویری از آزمایش مستقیم میکروسکوپی مثبت و کشت میکروبی مثبت (نگاره‌های1-الف و 1-ب) و الکتروفورز مربوط به هر دو جفت­ پرایمر (نگاره 2) نشان داده شده است.

 

 

 

نگاره 1-الف: آزمایش مستقیم میکروسکپی مثبت مدفوع با رنگ­آمیزی ذیل‌نلسن

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نگاره 1-ب: کشت مثبت در محیط زرده تخم‌مرغ هرولد حاوی مایکوباکتین

14

13

12

11

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

 

 

 

 

 

 

نگاره 2- عکسی از ژل الکتروفورز مربوط به PCR با جفت­پرایمرهای 91F/90F و 26FP/25  FP دراین شکل ردیف 1 (از چپ به راست) سایز مارکر bp100 Plus شرکت Fermentas (به ترتیب از بالا به پایین شامل باندهای با اندازه 3000، 2000، 1500، 1200، 1031، 900، 800، 700، 600، 500، 400، 300، 200 و 100 جفت باز)، ردیف 14 سایز مارکر bp100 شرکت Fermentas  (به ترتیب از بالا به پایین شامل باندهای با انـدازه 1031، 900، 800، 700 ،500، 400، 300.،200، 100 و 80 جفت باز) و در ردیف­های 6-2، 8 و11 محصـول bp400 مربوط به جفت­پرایمر 91F/90F و در ردیف­های 9 و 10 محصـول  bp228 مربوط به جفت­پرایمر 26FP/25FP و در ردیف­های 7، 12 و 13 جواب منفی مشاهده می‌شود.

 

 

 

 

نمودار 1- نتایج به دست آمده از آزمایش مستقیم میکروسکپی، کشت میکروبی و PCR در تشخیص MAP در  مدفوع گاوهای به ظاهر سالم (100=n)

 

 

 

توافق آزمایش مستقیم میکروسکپی با کشت میکروبی متوسط، با PCR با جفت پرایمر 91F/90F متوسط و با PCR با جفت پرایمر 26FP/25FP نسبی بود. توافق کشت میکروبی با PCR با جفت پرایمر 91F/90F کامل و با PCR با جفت پرایمر 26FP/25FP متوسط بود. توافق دو روش PCR هم متوسط بود (جدول 1).      

 

 

 

دو روش  PCR	کشت میکروبی با PCR با جفت­پرایمر 26FP/25FP	کشت میکروبی با PCR با جفت­پرایمر 91F/90F	آزمایش مستقیم میکروسکپی با PCR با جفت­پرایمر 26FP/25FP	آزمایش مستقیم میکروسکپی با PCR با جفت­پرایمر 91F/90F	آزمایش مستقیم میکروسکپی با کشت میکروبی	آزمایش­ها
69/0	65/0	96/0	36/0	59/0	63/0	توافق (K)

جدول 1- توافق آزمایش مستقیم میکروسکپی، کشت میکروبی و PCR در تشخیص MAP در مدفوع گاوهای به ظاهر سالم

 

بحث و نتیجه‌گیری

     کنترل بیماری یون به علت فقدان یک روش تشخیصی مناسب که قادر به شناسایی هم حیوانات مبتلا به فرم بالینی و هم حیوانات مبتلا به فرم تحت بالینی بیماری باشد دشوار است (35) و حساسیت پایین تست­های تشخیصی از مهم­ترین موانع در کنترل بیماری یون محسوب می­شود (20). تست استاندارد طلایی (Golden standard) برای بیماری یون کشت مدفوع بر روی محیط کشت زرده تخم­مرغ هرولد است ولی به علت کند رشد بودن MAP کشت مدفوع فرآیندی وقت­گیر است به طوری ­که جداسازی این باکتری از مدفوع با روش‌های متداول کشت 16-6 هفته طول می­کشد (27). هم‌چنین علی­رغم اعمال روش­های آلوده­زدایی، اغلب کشت­ها به دلیل آلودگی از دست می­روند (19 و 36) و حتی به کار بردن روش های آلوده­زدایی قبل از کشت به خاطر تأثیر روی سلول­های MAP می­تواند به کسب نتایج منفی کاذب منجر شود (28). در تعدادی از مطالعات حساسیت پایین کشت مدفوع مشخص شده و این روش قادر به شناسایی همه حیوانات مبتلا به فرم تحت­بالینی بیماری که از منابع مهم عفونت گله و آلودگی محیط هستند نبوده است (22، 25 و 27). در این مطالعه هم حساسیت کشت مدفوع پایین بود (در مقایسه با PCR) و در ضمن به علت طولانی‌شدن انکوباسیون محیط­های کشت گاهی آلودگی ثانویه و حتی خشک شدن و ناکارآمد شدن محیط کشت رخ می­داد که احتمالاً در ثبت نتایج واقعی تأثیر گذاشته است.

  تشخیص MAP به روش آزمایش مستقیم میکروسکپی هم انجام می­شود ولی در مورد حساسیت و ویژگی روش مستقیم تردید وجود دارد و تفریق عامل بیماری یون از سایر اجرام اسیدفست موجود در مدفوع مشکل می‌باشد (21 و 38). تعدادی از گزارشات نشان داده­اند آزمایش مستقیم گسترش­های مدفوعی پس از رنگ­آمیزی ذیل­نلسون ابزار تشخیصی قابل اطمینانی نیست (18). در مطالعه انجام شده توسط Glanemann (2003) حساسیت و ویژگی روش آزمایش مستقیم میکروسکپی در مدفوع در مقایسه با کشت به ترتیب 4/54 و 73 درصد بود (13). در این مطالعه هم که کمترین تعداد موارد مثبت در آزمایش مستقیم میکروسکپی به دست آمد حساسیت پایین این روش تأیید شد. به این دلایل این روش اگرچه ارزان است ولی به تنهایی برای تشخیص دقیق توصیه نمی­شود.

  برای تشخیص MAP تست­های سرولوژیکی مختلفی از قبیل ایمونودیفوزیون در ژل آگار (AGID)، تثبیت کمپلمان (CFT)، تست جلدی با یونین، اندازه­گیری اینترفرون گاما و الایزا (ELISA) ابداع شده­اند ولی حساسیت و ویژگی این تست­ها متفاوت گزارش شده و حساسیت یا وی‍‍‍ژگی پایینی داشته­اند و حتی در مواردی گزارش شده از کشت مدفوع حساسیت کمتری داشتند (25، 27، 31 و 36).

در سال­های اخیر روش­های مختلف PCR بر پایه 900IS برای تشخیص MAP در نمونه­های بالینی (مدفوع، نمونه‌های بافتی، بافی­کت و شیر) استفاده شده­ است (2، 7، 12، 24 و 36). Huntley و همکاران (2005) از کشت مدفوع، کشت بافت­ها (مقاطع ایلئوم و ژوژنوم، عقده­های لنفاوی ایلئوسکال و مزانتریک)، PCR بافت­ها بر پایه عنصر 900IS، رنگ­آمیزی ذیل­نلسن، رنگ­آمیزی فلورسنت اورامین O/آکریدین اُرانژ و رنگ­آمیزی ایمونوهیستوشیمی بافت­ها برای تشخیص MAP در 14 گاومیش آمریکایی (American bison) مشکوک به بیماری یون استفاده کردند که داده­ها نشان داد تشخیص MAP بر پایه DNA (PCR) حساس­تر از کشت مدفوع، کشت بافت و رنگ­آمیزی بافت در تشخیص عفونت در گاومیش آمریکایی بود (16).

 Dieguez و همکاران (2007) از کشت مدفوع، چهار نوع کیت الایزایِ سرم در دسترس (تجاری) و PCR بر پایه 900IS برای تشخیص عفونت MAP در 396 گاو از چهار گله گاو شیری با سابقه بیماری بالینی یون استفاده نمودند. نتایج نشان داد هیچ­یک از روش­های الایزای سرم، کشت مدفوع و PCR توانایی تشخیص زودهنگام MAP در گاوهای شیری را ندارند (7). Singha و همکاران (2007) از کشت مدفوع، الایزای شیر، کشت شیر و PCR مدفوع برای تشخیص بیماری یون در 26 گاو شیری استفاده نمودند. حساس­ترین روش به ترتیب کشت شیر (15/96%)، کشت مدفوع (6/86%)، الایزای شیر (9/76%) و PCR 900IS (23%) بود. در بین چهار روش، PCR کم حساس­ترین ولی 100% اختصاصی بود. علت پایین بودن حساسیت PCR در این مطالعه می­تواند به علت عدم تهیه DNA الگوی مناسب باشد (33). Clark و همکاران (2008) از کشت مدفوع، الیزای سرم و  PCRمدفوع برای تشخیص MAP در 250 گاو که وضعیت آن‌ها از نظر بیماری یون نامشخص بود استفاده کردند. با کشت مدفوع 8/26%، با الایزای سرم 10%  و با PCR مدفوع 6/29% مثبت تشخیص داده شد (4).Irenge  و همکاران (2008) از آزمایش مستقیم میکروسکپی، کشت میکروبی و real time PCR برای تشخیص MAP در نمونه­های مدفوعی گوساله­های آلوده شده به صورت تجربی با MAP استفاده کردند و real time PCR حساسیت بالاتری از آزمایش مستقیم میکروسکپی و کشت میکروبی نشان داد (18).

 Pinedo و همکاران (2008) ارتباط بین نتایج به دست آمده از کشت مدفوع، الایزای سرم و PCR آشیانه­ای را در تشخیص MAP در شیر، خون و مدفوع گاوهای شیری (328=n) بررسی نمودند. بیشترین توافق برای کشت مدفوع و PCR مدفوع و کمترین توافق برای PCR خون و الایزا به دست آمد (26). در تحقیق حاضر هم که از روش کشت میکروبی، آزمایش مستقیم میکروسکپی و دو روش PCR بر پایه 900IS برای تشخیص MAP در مدفوع گاوهای به ظاهر سالم استفاده شد، PCR (مخصوصاً با جفت ­پرایمر 26FP/25FP) نسبت به آزمایش مستقیم میکروسکپی و کشت میکروبی موارد مثبت بیشتری را نشان داد. با توجه به این نتایج و توافق بین تست­ها؛ PCR می­تواند به عنوان یک روش سریع ودقیق­تر، جایگزینی برای روش­های متداول تشخیص MAP در مدفوع گاوها باشد. اگرچه توافق بین هر دو روش PCR مناسب بود (69/0=K) ولی PCR با جفت ­پرایمر 91F/90F نتیجه­ای شبیه به کشت و کمی بهتر از آزمایش مستقیم میکروسکپی نشان داد، بنابراین PCR با این جفت­پرایمر جایگزین مناسبی برای روش­های متداول تشخیص MAP در مدفوع گاوها نیست و انتخاب نوع پرایمر در افزایش حساسیت تست PCR اهمیت زیادی دارد.

 

مراجع

1.    1.   طباطبائی، ع.ح. و فیروزی، ر. (1380): بیماری­های باکتریائی دام. انتشارات دانشگاه تهران- صفحات: 423- 414.
2. Bhide, M., Chakurkar, E., Tkacikova, L., Barbuddhe, S., Novak, M., and Mikula, I. (2006). IS900 PCR-based detection          and characterization of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from buffy coat of cattle and sheep. Veterinary Microbiology. 112: 33–41.
3. Clarke, C.J. (1997). The pathology and pathogenesis of paratuberculosis in ruminants and other species. J. Comp. Pathol. 116: 217–261.
4.  Clark, D.L.Jr., Koziczkowski, J.J., Radcliff, R.P., Carlson, R.A., and Ellingson, J.L.E. (2008). Detection of Mycobacterium avium Subspecies paratuberculosis: Comparing Fecal Culture Versus Serum Enzyme-Linked Immunosorbent Assay and Direct Fecal Polymerase Chain Reaction. J. Dairy Sci. 91: 2620-2627.
5. Cocito, C., Gilot, P., Coene, M., de Kesel, M., Poupart, P., and Vannuffel, P. (1994). Paratuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 7: 328–345.
6. Corti, S., and Stephan, R. (2002). Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis specific IS900 insertion sequences in bulk-tank milk samples obtained from different regions throughout Switzerland. BMC Microbiol. 2: 15.
7. Crossley, B.M., Zagmutt-Vergara, F.J.,  Fyock, T.L., Whitlock, R.H., and Gardner, I.A. (2005): Fecal shedding of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis by dairy cows. Veterinary Microbiology. 107: 257–263.
8. Dieguez, F.G., Gonzalez, A.M., Menendez, S., Vilar, M.J., Sanjuan, M.L., Yus, E., and Arnaiz, I. (2007). Evaluation of four commercial serum ELISAs for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in dairy cows. The Veterinary Journal. 56: 243-252.
9. Englund, S., Bolske, G., Ballagi-Pordany, A., and Johansson, K.E. (2001). Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in tissue samples by single, fluorescent and nested PCR based on the IS900 gene. Veterinary Microbiology. 81:  257–271.
10. Englund, S., Bolske, G., and Johansson, K.E. (2002). An IS900-like sequence found in a Mycobacterium sp. other than Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 209: 267-271.           
11. Garrido, J.M., Cortabarria, N., Oguiza, J.A., Aduriz, G., and Juste, R.A. (2000). Use of a PCR method on fecal samples for diagnosis of sheep paratuberculosis. Veterinary Microbiology. 77: 379-386.
12. Giese, S.B., and Ahrens, P. (2000). Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk from clinically affected cows by PCR and culture. Veterinary Microbiology. 77: 291-297.
13. Glanemann, B. (2003). Detection of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Swiss Dairy Cattle by Culture and Serology. internete, xxxxx, 1-20.
14. Greenstein, R.J. (2003). Is Crohn’s disease caused by a mycobacterium? Comparisons with leprosy, tuberculosis, and Johne’s disease. THE LANCET Infectious Diseases. 3: 507-514.
15. Greenstein, R.J.; Collins, M.T. (2004). Emerging pathogens: is Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis zoonotic? Lancet. 31 (364): 396–397.
16. Harris, N.B. and Barletta, R.G. (2001). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in veterinary medicine. Clin. Microbiol. Rev. 14: 489-512.
17. Huntley, J.F.J., Whitlock, R.H., Bannantine, J.P., and Stabel, J.R. (2005): Comparison of Diagnostic Detection Methods for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in North American Bison. Vet Pathol. 42: 42–51.
18. Irenge, L.M., Walravens, K., Govaerts, M., Godfroid, J., Rosseels, V., Huygen, K., and Gala, J. (2008): Development and validation of a triplex real-time PCR for rapid detection and specific identification of M. avium sub sp. paratuberculosis in faecal samples. Veterinary Microbiology. xxx: xxx–xxx.
19. Klausen, J., Huda, A., Ekeroth , L., and Ahrens, P. (2003). Evaluation of serum and milk ELISAs for paratuberculosis in Danish dairy cattle. Preventive Veterinary Medicine. 58: 171–178.
20. Kudahl, A.B., Sorensen, J.T., Nielsen, S.S., and Ostergaard, O. (2007). Simulated economic effects of improving the sensitivity of a diagnostic test in paratuberculosis control. Preventive Veterinary Medicine. 78: 118–129.
21. Lilenbaum, W., Marassi, C.D., and Oelemann, W.M.R. (2007). Paratuberculosis: an update. Braz. J. Microbiol. 38: 580-590.
22. Nielsen, S.S., and Toft, N. (2008). Ante mortem diagnosis of paratuberculosis: A review of accuracies of ELISA, interferon-γ assay and faecal culture techniques. Veterinary Microbiology. 129:  217–235.
23. Manning, E.J.B., and Collins, M.T. (2001). Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: pathogen, pathogenesis and diagnosis. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 20: 133–150.
24. Millar, D., Ford, J., Sanderson, J., Withey, S., Tizard, M., Doran, T., and Hermon-Taylor, J. (1996). IS900 PCR to detect Mycobacterium paratuberculosis in retail supplies of whole pasteurized cow' milk in England and Wales. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3446-3452.
25. Pillai, S.R., and Jayarao, B.M. (2002). Application of IS900 PCR for Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Directly from Raw Milk. J. Dairy Sci. 85: 1052–1057.
26. Pinedo, P.J., Rae, D.O., Williams, JE., Donovan, G.A., Melendez, P.  and Buergelt, CD. (2008). Association among Results of Serum ELISA, Faecal Culture and Nested PCR on Milk, Blood and Faeces for the Detection of Paratuberculosis in Dairy Cows. Transboundary and Emerging Diseases. 55 (2): 125–133.
27. Rajeev, S., Zhang, Y., Sreevatsan, S., Motiwala, A.S., and Byrum, B. (2005). Evaluation of multiple genomic targets for identification and confirmation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolates using real-time PCR. Veterinary Microbiology. 105: 215–221.
28. Reddacliff, L.A., Vadali, A., and Whittington, R.J. (2003). The effect of decontamination protocols on the numbers of sheep strain Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis isolated from tissues and faeces. Vet. Microbiol. 95: 271-282.
29. Romero, C., Hamdi, A., Valentine, J.F. and Naser, S.A. (2005). Evaluation of surgical tissue from patients with Crohn’s disease for the presence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis DNA by in situ hybridization and nested polymerase chain reaction. Inflamm. Bowel. Dis. 11: 116–125.
30. Shamoradi, A.H., Arefpajohi, R., Tadayon, K., and Mosavari, N. (2008). Paratuberculosis in Holstein-Friesian cattle farms in Central Iran. Trop. Anim. Health Prod. 40: 169–17.
31. Sharma, G., Singh, S.V., Sevilla, I., Singh, A.V., Whittington, R.G., Juste, R.A., et al. (2008). Evaluation of indigenous milk ELISA with m-culture and m-PCR for the diagnosis of Bovine Johne’s disease (BJD) in lactating Indian dairy cattle. Research in Veterinary Science. 84: 30–37.
32. Singh, A.V., Singh, S.V., Makharia, G.K., Singh, P.K., and Sohal, J.S. (2007). Presence and characterization of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from clinical and suspected cases of Crohn’s disease and in the healthy human population in India. Int. J. Infect. Dis. 18: 254-258.
33. Singha, S.V., Singha, A.V. Singhb, R., Sandhub, K.S., Singha, P.K.,  Sohala, J.S., et al. (2007). Evaluation of highly sensitive indigenous milk ELISA kit with fecal culture, milk culture and fecal-PCR for the diagnosis of bovine Johne’s disease (BJD) in India. Comparative Immunology, Microbiology & Infectious Diseases. 30: 175–186.
34. Sola, C., Filliol, I., Legrand, E., Lesjean, S., Locht, C., Supply, P., Rastogi, N. (2003). Genotyping of the Mycobacterium tuberculosis complex using MIRUs: association with VNTR and spoligotyping for molecular epidemiology and evolutionary genetics. Infection, genetics and evolution. 3: 125-133.
35. Stabel, J.R., Bosworth, T.L., Kirkbride, T.A., Forde, R.L., and Whitlock, R.H. (2004). A simple, rapid, and effective method for the extraction of Mycobacterium paratuberculosis DNA from fecal samples for polymerase chain reaction. J Vet Diagn Invest. 16: 22–30.
36. Taddei, S., Robbi, C., Cesena, C., Rossi, I., Schiano, E., Arrigoni, N., Vicenzoni, G. and Cavirani, S. (2004). Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in bovine fecal samples: comparison of three polymerase chain reaction–based diagnostic tests with a conventional culture method. J Vet Diagn Invest. 16: 503–508.
37. Wells, S.J., Collins, M.T., Faaberg, K.S., Wees, K., Tavornpanich, S., Petrini, K.R., Collins, J.E., Cernicchiaro, N., and Whitlock, R.H. (2006). Evaluation of a Rapid Fecal PCR Test for Detection of Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis in Dairy Cattle. Clinical and Vaccine Immunology. 13 (10): 1125–1130.
38. Zimmer, K., Drager, K., Klawonn, W., and Hess, R. (1996). Contribution to the diagnosis of Johne’s disease in cattle. Comparative studies on the validity of Ziehl– Neelsen staining, faecal culture and a commercially available DNA-probe test in detecting Mycobacterium paratuberculosis in faeces from cattle. Zentralbl. Veterinarmed. [B]. 46 (2): 137–140.