مطالعه تجربی آپوپتوز در لوزالمعده جوجه‌های SPF متعاقب عفونت با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 1، دوره 2، 3 (7) پاییز، آذر 1387، صفحه 181-187   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

یوسف دوستار^* ؛ داریوش مهاجری

گروه پاتوبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران

چکیده

     ویروس آنفلوانزا عامل مرگ سلولی در بافت‌های حیوانات و انسان می‌باشد. مرگ سلولی حاصله از این ویروس می‌تواند به دو صورت نکروز و آپوپتوز اتفاق بیفتد. در این تحقیق به ارزیابی نوع مرگ سلولی در بافت لوزالمعده جوجه‌های عفونی شده با ویروس آنفلوانزای طیور سروتیپ H₉N₂(A/chicken/ Iran/ 772/2000)  به‌طور تجربی پرداخته شده است. در بررسی حاضر، تعداد 20 قطعه جوجه SPF با سن 3 هفته در دو گروه برابر به‌طور تصادفی توزیع گردید. گروه اول با 2/0 میلی‌لیتر با رقت 1 به 10 و تیتر EID50 ^5/7 10 ویروس آنفلوانزا و گروه دوم نیز با حجمی برابر، توسط محلول سالین نرمال به‌روش داخل بینی تلقیح گردید. پس از 72 ساعت، از بافت لوزالمعده جوجه‌‌ها نمونه‌برداری انجام شد و از نمونه‌های پایدار شده در  فرمالین بافر 10%، مقاطع میکروسکوپی با ضخامت 5 میکرون و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین تهیّه گردید. در مطالعات ریزبینی بافت‌ لوزالمعده، اختلاف میانگین تعداد سلول‌های آپوپتوتیک و نکروتیک بین گروه‌های شاهد و تیمار معنی‌دار بود (005/0>p). نتایج این بررسی نشان داد که ویروس آنفلوانزای سروتیپ H₉N₂ توانائی القاء آپوپتوز در سلول‌های آسینار و جزائر آلفا و بتای لوزالمعده طیور را دارد.
مجله دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، 1387، دوره 2، شماره 3، 187-181.

کلیدواژه‌ها

ویروس آنفلوانزای طیور؛ آپوپتوزیس؛ لوزالمعده؛ جوجه

اصل مقاله

مقدمه

 

     بیماری آنفلوانزا به‌عنوان یک بیماری ویروسی از سال1901 میلادی شناخته شده است. در سال 1955 میلادی شکل خاصی از ویروس آنفلوانزا  به‌عنوان عامل ایجاد کننده بیماری شناخته شد که بعدها به‌علت تلفات زیاد، طاعون مرغی نامیده شد. اهمیّت ویروس‌های آنفلوانزا به‌عنوان یک پاتوژن با گستردگی جهانی در انسان‌، حیوانات خانگی و ماکیان به‌خوبی شناخته شده است. ویروس‌های آنفلوانزای پرندگان جزء اعضای خانواده ارتومیکسوویریده بوده و به جنس A تعلّق دارند. از سال 1994 میلادی سویه H9N2 ویروس A آنفلوانزا باعث طغیان بیماری در ماکیان با مرگ و میر زیاد در کره و چین شده است و از سال 2001 تا 2002  میلادی ویروس‌های H9N2 به‌طور گسترده از گوشت و مغز استخوان جوجه‌های وارداتی از چین در مرکز قرنطینه حیوانات یوکوهاما در ژاپن جدا شده است. در مارس 1999 میلادی دو مورد از ویروس آنفلوانزا از دختران یک تا چهار ساله هنگ کنگی که از بیماری شبیه آنفلوانزا بهبود یافته بودند، جدا شده است. پنج مورد جداسازی ویروس  H9N2  از انسان‌ در آگوست سال 1998 نیز گزارش شده است (8).

 تشدید بیماری‌زایی سویه H9N2 ویروس آنفلوانزا  Aجدا شده از جوجه در چین توسط عفونت هم‌زمان باکتریایی نظیر استافیلوکوک طلایی و هموفیلوس پاراگالیناروم به اثبات رسیده  است (10). با آگاهی از این‌که چگونه ویروس‌های آنفلوانزا با سلول‌های میزبان وارد عمل می‌شوند و این که چگونه و از چه مکانیسم‌ها و مسیر‌هایی مرگ سلولی را در سلول‌های میزبان القاء می‌کنند، یافتن راهکار مناسب در برخورد با این بیماری آسانتر شده است. مرگ سلول‌ها به‌صورت نکروز در موارد پاتولوژیک نظیر عفونت‌های ویروسی تخریب کننده اهمّیت دارد، لکن تحقیقات اخیر نشان داده‌اند که بسیاری از ویروس‌ها از جمله ویروس آنفلوانزا از طریق القاء آپوپتوز یا مرگ برنامه‌ریزی شده باعث مرگ سلول‌های میزبان می‌گردند (3، 5 و11). ویروس آنفلوانزا در بافت‌های مختلف موجب آسیب می‌گردد. هدف از این مطالعه بررسی تغییرات مرگ سلولی متعاقب تلقیح ویروس آنفلوانزای سروتیپ  H9N2 در بافت لوزالمعده طیور می‌باشد. با توجّه به اهمیّت بیماری آنفلوانزای طیور و گسترش روزافزون بیماری در بین جمعیّت دامی و انسانی نیاز است تا هر چه بهتر پاتوژنز بعضی از سویه‌های ویروسی نظیر سویه H9N2 از نظر آسیب‌های سلولی مورد ارزیابی قرار گیرند. لذا این مطالعه می‌تواند در راستای پاتوژنز بیماری آنفلوانزای طیور بسیار مفید واقع گردد.

مواد و روش‌کار

     در این مطالعه ویروس آنفلوانزای طیور تحت تیپ H9N2 (A/chicken/Iran/772/2000) که با دو تکرار در تخم‌مرغ‌های جنین‌دار کلون شده بود، به جوجه‌های SPF (Valo Lohman, Germany) در سن 3 هفتگی به روش قطره بینی تلقیح گردید. ابتدا جوجه‌های SPF به‌طور تصادفی به دو گروه 10 تایی تقسیم گردید که یک گروه به‌عنوان تیمار و گروه دیگر شاهد در نظر گرفته شد. گروه تیمار به‌روش قطره بینی با ویروس آنفلوانزای تحت تیپ H9N2 با دز 2/0 میلی‌لیتر و رقت 1 به 10 و تیتر EID50 ^5/10⁷ عفونی گردید. گروه شاهد نیز برابر حجم محلول تلقیحی ویروس، با همان روش و به‌طور هم‌زمان سرم نمکی نرمال دریافت نمود. سه روز پس از تلقیح، جوجه‌های مورد آزمایش (گروه تیمار و گروه شاهد) هم‌زمان کالبدگشایی و از بافت لوزالمعده آن‌ها نمونه‌برداری به‌‌عمل آمد. نمونه‌های مورد نظر در داخل فرمالین بافری 10 درصد جهت تهیّه مقاطع آسیب‌شناسی بافتی به آزمایشگاه پاتولوژی دانشکده دامپزشکی تبریز ارسال گردیدند. نمونه‌های مورد نظر پس از گذراندن مراحل آب‌گیری، شفاف‌سازی، آغشتگی با پارافین و قالب‌گیری، با ضخامت‌های 5 میکرون برش داده شده و با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شدند. سلول‌های آپوپتوتیک و نکروتیک در برش‌های تهیه شده توسط میکروسکوپ نیکون مدل E200 در 10 میدان میکروسکوپی و با بزرگنمائی 40× مورد شمارش قرار گرفتند. تجزیه وتحلیل آماری داده‌ها با استفاده از بسته نرم‌افزاری SPSS  نسخه 13 و آزمون T(t- test) انجام گردید (1، 2 و 4).

نتایج

    در مشاهدات ریزبینی بخش اگزوکرین لوزالمعده جوجه‌های تیمار شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2، سلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های آپوپتوتیک در آسینی‌ها به‌وفور قابل مشاهده بودند و تغییرات شدید حاکی از نکروز و آپوپتوز در هسته و سیتوپلاسم سلول‌های اگزوکرینی مشخص بود (نگاره‌های 1 و 2). چروکیده شدن سلول و متراکم و قطعه قطعه شدن کروماتین هسته که از اشکال نمادین آپوپتوز سلول‌ها می‌باشد، در سلول‌های اگزوکرینی آسینی‌های لوزالمعده کاملاً مشخص بود (نگاره ‌3). روند سیتولیز در یاخته‌های نکروتیک بخش اگزوکرینی و در نهایت از بین رفتن آسینی‌ها در اکثر مناطق نیز به‌وضوح قابل مشاهده بود (نگاره‌ 4). در بخش آندوکرینی لوزالمعده پرخونی جزایر لانگرهانس آلفا و آسیب سلول‌های حاشیه‌ای در مجاورت بخش اگزوکرینی آسیب دیده، در اکثر مناطق دیده می‌‌شد (نگاره ‌5). پرخونی، تخریب و تحلیل جزایر لانگرهانس بتا، متعاقب آسیب سلول‌های اگزوکرینی مجاور،  به‌وضوح قابل مشاهده بود  (نگاره ‌5).

 نگاره1- نمای ریزبینی از بخش اگزوکرین لوزالمعده جوجه آلوده شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2. به تغییرات هسته و سیتوپلاسم سلول‌های آسینی‌ها (فلش‌های تیره) در اثر نکروز توجه فرمائید. سلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های آپوپتوتیک (فلش‌های روشن) نیز در این قسمت به‌وفور قابل مشاهده هستند (هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 250×)

 

 

نگاره2- نمای ریزبینی با درشت‌نمایی بیشتر ازسلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های آپوپتوتیک (فلش‌های ضخیم) و نکروتیک (فلش‌های نازک) بخش اگزوکرینی لوزالمعده جوجه آلوده شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2 (هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 600×).

 

 

نگاره3-  نمای دیگر بادرشت‌نمایی بیشتر ازسلول‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌های آپوپتوتیک و نکروتیک بخش اگزوکرینی لوزالمعده جوجه آلوده شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2. متراکم و قطعه قطعه شدن کروماتین همراه با افزایش ائوزینوفیلی سیتوپلاسم (فلش‌ها) که از اشکال نمادین آپوپتوز در سلول‌ها می‌باشد، در سلول‌های اگزوکرینی کاملاً مشخص می‌باشد (هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 600×).

 

 

 

 

نگاره4- نمای ریزبینی از بخش اگزوکرینی لوزالمعده جوجه  آلوده  شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2. تجزیه سلول‌های نکروتیک  (فلش‌ها) بخش اگزوکرینی و از بین رفتن آسینی‌ها مشخص می‌باشد (هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 600×).

 

 

 

 

 

نگاره5- نمای ریزبینی از بخش آندوکرینی لوزالمعده (قسمتی از یک جزیره آلفا) در جوجه آلوده شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2. آسیب در سلول‌های حاشیه‌ای (فلش‌ها) که در مجاورت بخش اگزوکرینی تخریب شده قرار دارند، قابل مشاهده است (هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 600×).

 

 

 

 

نگاره6- نمای ریزبینی از بخش آندوکرینی لوزالمعده  (قسمتی از یک جزیره بتا) در جوجه آلوده شده با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2 . پرخونی و تحلیل جزیره لانگرهانس بتا، متعاقب بروز آسیب در سلول‌های اگزوکرینی مجاور،  قابل ملاحظه است. به سلول‌های بتا (فلش‌های ضخیم) که دچار نکروز شده‌اند، توجه شود (هماتوکسیلین- ائوزین، بزرگنمایی 600×).

 

 

آنالیز آماری داده‌ها

آنالیز آماری داده با آزمون T(t- test) نشان داد که میانگین تعداد سلول‌های آپوپتوتیک و نکروتیک گروه تیمار با گروه شاهد، اختلاف معنی‌دار ( 005/0>p) دارد (نمودارهای 1 و 2).

 

نمودار1-  مقایسه میانگین تعداد سلول‌های آپوپتوتیک در بافت لوزالمعده گروه‌های شاهد و تیمار. داده‌ها به‌صورت mean±SEM ارائه شده است. ^***: P<0.005

 

 

 

نمودار2-  مقایسه میانگین تعداد سلول‌های نکروتیک در بافت لوزالمعده گروه‌های شاهد و تیمار. داده‌ها به‌صورت mean±SEM ارائه شده است. ^***: P<0.005

 

بحث و نتیجه‌گیری

Mehranpour و همکاران  در سال 2007 مطالعه‌ای بر روی تأثیر ویروسH5N1 در بوقلمون‌ها انجام داده و به این نتیجه رسیدند که بیشترین ضایعات در مغز، لوزالمعده و لوزه‌های سکوم رخ داده است (10)، هم‌چنین Kwon و همکاران در سال 2005 به تأثیر این سروتیپ ویروس آنفلوانزا در بافت‌های قلب و لوزالمعده اشاره نموده و به آسیب سلولی در بافت لوزالمعده اشاره و نتایج معنی‌داری را در مطالعات خودشان به‌دست آوردند (6).

در مطالعه حاضر نیز اختلاف معنی‌داری از نظر آسیب سلولی بافت لوزالمعده وجود داشته است که در واحد‌های آسینی و جزائر آلفا و بتا مشاهده گردیده است. در سایر پرندگان نظیر Zebra Finches وHouse Finchesنیز با تلقیح سروتیپA/chicken/Hong Kong/220/97/H5N1به شیوه داخل بینی ایجاد واگیری و تلفات بعد از 10 روز با ضایعات بافتی به شکل نکروز منتشر و پانکراتیت چرکی گزارش شده است، که این حالت از نظر نکروز منتشر بافتی با نتایج بررسی حاضر مشابه می‌باشد (12).

آپوپتوز از دیگر یافته‌ها در مطالعه حاضر می‌باشد که شاید با مکانیسم‌های متعددی همراه بوده است. Kunio و همکاران (2003)، در مطالعه خود به نقش القاگر هماگلوتینین ویروس آنفلوانزا اشاره نموده و الحاق این عامل ویروسی به سیالوگلیکوپروتئین سطح سلولی و بیان سیتوکین‌های آماسی نظیرIL-1β ، IL-6، TNF-α(Tumor Necrotizing Factor α)،INF-γ ، INF-β  و  GM(Granulocyte Monocyte-Colony Stimulating Factor) رااز عوامل مؤثر در القاء آپوپتوز دانسته‌اند (16)، اما امروزه مهمترین مکانیسم پذیرفته شده، نقش عامل نورآمینیداز با واسطه TGF-β(Trnasforming Growth Factor-β) می‌باشد. رادیکال‌های آزاد حاصله از استرس‌های اکسیداتیو نیز احتمالاً در بروز مرگ سلولی لوزالمعده مؤثر بوده است، زیرا در عفونت‌های ویروس آنفلوانزا میزان بیان  mRNAوابسته بهGST-д (Glutatione S-Transferase-д) وMN-SOD (Mn-Superoxide Dismotase) کاهش یافته و بنابراین با افزایش استرس‌های اکسیداتیو سلولی و رادیکال‌های آزاد اکسیژن، کاسپاز‌های8 و 9 و به‌دنبال آن‌ها کاسپاز‌های 3، 6 و 7 نیز فعال و مسیر آپوپتوزیس راه‌اندازی می‌گردد (7، 15 و 16).

با توجه به مطالب ارائه شده توجیح تغییرات مرگ سلولی متعاقب عفونت با ویروس آنفلوانزای سروتیپ H9N2  احتمالاً از این مسیر می‌باشد. بیان مکانیسم‌های دقیق ملکولی در مورد عملکرد سروتیپ H9N2 نیاز به مطالعات تکمیلی دارد، اما در مطالعات مقایسه‌ای که  Mo و همکاران در سال 1997 با سایر سروتیپ‌های مختلف ویروس آنفلوانزا (H5N9،H5N2،H4N8،H7N7) انجام داده‌اند، ضایعات ایجاد شده توسط سروتیپ‌های H5N2وH7N7 در حد متوسطی بوده و 52% ضایعات در بافت لوزالمعده جوجه‌ها ایجاد شده است که به‌صورت نکروز انعقادی و واکوئله شدن آسینی‌ها بوده است (11)، درحالی‌که در مطالعه ما علاوه بر نکروز سلولی، آپوپتوزیس نیز در سلول‌های آسینی و سلول‌های جزائر آلفا و بتا مشاهده شده است. با این اوصاف می‌توان به این نتیجه رسید که سروتیپ‌‌های متعدد ویروس آنفلوانزا در مرگ سلولی نقش داشته و سروتیپ H9N2 نیز از این قاعده مستثنی نیست (9).

نتایج بررسی Ito و همکاران در سال 2002 و Schultz و همکاران در سال 2002 نشان داده است که رپلیکاسیون سروتیپH7N7 در بافت لوزالمعده نسبت به سایر سروتیپ‌های H5N3و H5N1 بیشتر بوده و ایشان به نقش پروتئین غیرساختاری ویروس آنفلوانزا یا NS1 در القاء آپوپتوزیس اشاره نموده‌اند (5 و 13).

محققان دریافته‌اند که ویروس آنفلوانزای سویه H₉N₂ شاید با فعال‌سازی تأخیری TGF-β توسط NA باعث فعال شدن مسیرهای مرگ سلولی می‌گردد، آن‌ها با بیان مکانیسم‌های درون‌زاد آپوپتوزیس متعاقب عفونت ویروسی، ارتباط مشخصی را بین ویروس آنفلوانزا و آپوپتوزیس یافتند که در بیان مسیرهای القاء آپوپتوزیس سلول‌های بافت پانکراس در جوجه‌ها می‌توان به نقش مؤثر این موارد در بیان ‌تغییرات مرگ سلولی و اختلاف معنی‌دار نتایج به‌دست آمده اشاره نمود (9، 14 و 17)، در مجموع بایستی اذعان داشت که هر دو الگوی مرگ سلولی (نکروز و آپوپتوزیس) متعاقب عفونت با ویروس آنفلوانزا در بافت لوزالمعده جوجه‌ها قابل رؤیت بوده و بایستی در مورد سروتیپ H9N2 برای روشن‌تر شدن مکانیسم‌های مرگ سلولی مطالعات ملکولی بیشتری انجام گردد.

مراجع

1. دوستار، ی. (1383): مطالعه آزمایشی آپوپتوزیس القاء شده توسط ویروس عامل بیماری بورس عفونی جوجه‌ها با استفاده از متد تشخیصی TUNEL و میکروسکوپ الکترونی. پایان‌نامه جهت دریافت دکترای تخصصی دانشگاه تهران، دانشکده دامپزشکی، صفحات: 184-180.
2. حبل‌الورید، م.، سهرابی حقدوست، ا.، پوربخش، س.ا. و غلامی، م.ر. (1382): مطالعه هیستوپاتولوژیک ضایعات ناشی از تزریق داخل وریدی تحت تیپ ₂N₉H ویروس آنفلوانزای تیپ A در جوجه، مجله علمی- پژوهشی انیستیتو تحقیقاتی واکسن و سرم‌سازی رازی، شماره 55، صفحات:51-41.
3. Barber, G.N. (2001): Host defense viruses and apoptosis. Cell Death Differ., 8: 113-26.
4. Frankfurt, O.S. and Krishan, A. (2001): Identification of apoptotic cells by formaldehyde–induced DNA denaturation in condensed chromatin. Histochem Cytochem., 49: 369-78.
5. Ito, T., Kobayashi, Y., Morita, T., Horimoto, G. and Kawaoka, Y. (2002): Virulent influenza a viruses induces apoptosis in chickens. Virus Res., 84: 27-35.
6. Kwon, Y.K., Joh, S.J. and Kim, M.C. (200): Highly pathogenic avian influenza (H5N1) in the commercial domestic ducks of South Korea. Avian Pathol., 34(5): 367-370.
7. Kunio, O., Manabu, N., Bo, Y., Toshio, B. and Toshio, Y. (2003): Apoptosis induced by influenza virus-hemagglutinin stimulation may be related to fluctuations of cellular oxidative condition. Biol. Pharma. Bull., 26: 141-147.
8. Liu, J., et al. (2003): H₉N₂ influenza viruses prevalent in poultry in china is phylogenetically distinct from A/quail/ Hong kong/G1/97prsumed to be the donor of the internal protein genes of the H₅N₁ Hong Kong/ 97virus. Avian Pathology, 32: 552-560.
9. Morris, J., Nightingale, S., Harry, S. and Clive, S. (2005): Influenza, A. Virus induced apoptosis is a multifactorial process: Explanting reverse genetics to elucidate the role of influenza A virus proteins in virus–induced apoptosis. Virol., 335: 198-211.
10. Mehranpour, M.J., Dadras, H., Khodakaram-Tafti, A., Rahimian, A. and Toffan, A. (2007): Pathological finding of highly pathogenic avian influenza virus A/Duck/Vietnam/12/2005(H5N1) in turkey. International Journal of Poultry Science, 9: 679-683.
11. Mo, O.I., Brugh, M., Fletcher, J., Rowland, G.N. and Swayne, H. (1997): Comparative pathology of chickens experimentally inoculated with avian influenza virus of low and high pathogenicity. Avian Disease, 41:125-136.
12. Perkins, L.E.L. and Swayne, D. (2003): Varied pathogenecity of a hong kong-origin H5N1 avian influenza virus in four passé ring species and budgerigars. Vet. Pathol., 40: 14-24.
13. Schultuz, C., Stacey, D.S., Neumann, N., Kawaoka, G. and Shaw, H. (2002): Influenza Virus NS1 protein Induces Apoptosis in cultured cells. Virginia, 75: 17-22.
14. Schultz, C., Koci, M., Thompson, E. and Tumpey, T.M. (2003): Examining the cellular pathways involved in influenza virus induced apoptosis. Avian Diseases, 968-71.
15. Schultz, R., Harrington, J. and William, J.R. (2003): Apoptosis: Programmed cell death at a molecular level. Semin. Arthritis Rheum., 32:345-369.
16. Suarez, D.L. and Schultz-Cherry, S. (2000): Immunology of avian influenza Virus. A review of avian influenza virus, 24: 269-283.
17. Zambon, M.C. and Meduiro, R. (2001): Pathogenesis of influenza A and B in humans. Rev. Med. Viro., 11: 227-41.