تأثیر غلظت‌های مختلف اسید سیتریک بر الگوی حرکتی اسپرم‌های اپیدیدیمی گاو در محیط Hams F10

عبدی, کیوان; تاجیک, پرویز; قاسم‌زاده نوا, حمید; کاوه, امیرعلی; میرشکرایی, پژمان

همایش سردبیران نشریات علمی دانشگاه آزاد اسلامی

سامانه یکپارچه نشریات علمی دانشگاه آزاد اسلامی

تعداد نشریات	418
تعداد شماره‌ها	9,985
تعداد مقالات	83,469
تعداد مشاهده مقاله	76,601,677
تعداد دریافت فایل اصل مقاله	53,713,022

تأثیر غلظت‌های مختلف اسید سیتریک بر الگوی حرکتی اسپرم‌های اپیدیدیمی گاو در محیط Hams F10

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 6، دوره 2، 3 (7) پاییز، آذر 1387، صفحه 217-239 اصل مقاله (426.72 K)

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

کیوان عبدی^* ¹؛ پرویز تاجیک²؛ حمید قاسم‌زاده نوا²؛ امیرعلی کاوه³؛ پژمان میرشکرایی⁴

¹دانش آموخته مامایی و بیماری‌های تولید مثل دامپزشکی، دانشکدة علوم تخصصی دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، تهران، ایران

²گروه علوم درمانگاهی، دانشکدة دامپزشکی، دانشگاه تهران، تهران، ایران

³گروه علوم درمانگاهی، دانشکدة دامپزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز، تبریز، ایران

⁴گروه علوم درمانگاهی، دانشکدة دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران

چکیده

هدف از این مطالعه بررسی اثرات سه غلظت اسید سیتریک بر الگوی حرکتی اسپرم‌های اپیدیدیمی گاو بوده است. برای این‌کار 50 جفت بیضة گاو از کشتارگاه صنعتی ارومیه بلافاصله بعد از کشتار جمع‌آوری و در کنار یخ 5 درجه سانتی‌گراد به آزمایشگاه انتقال داده شد. اسپرم‌های ناحیة دم اپیدیدیم با چند برش در ناحیة بدون رگ آن جمع‌آوری و به محیط Hams F10 با 10% سرم گوسالة جنینی و دمای 37 درجة سانتی‌گراد انتقال و پس از 15 دقیقه انکوباسیون در انکوباتور CO2 شمارش گردید و رقت‌های 50 میلیون اسپرم در میلی‌لیتر آماده و در محدودة pH نرمال اسپرم (7/6 الی 4/7) سه غلظت اسید سیتریک 1/0، 2/0 و 3/0 نرمال (غلظت 1 نرمال اسید سیتریک، 7 میلی‌گرم در 1 میلی‌لیتر مایع منی گاو است) تهیّه شد و به اپندورف‌های حاوی اسپرم اضافه گردید و در دقایق 15،30، 45، 60، 90، 120، 180، 240 و360 الگوی حرکتی اسپرم‌های اپیدیدیمی با روش کاسا ارزیابی شد. داده‌هابا نرم‌افزارSPSS ویرایش 15 و آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه، آنالیز گردید. نتایج نشان‌دهندة اختلاف معنی‌دار شاخصه‌های مختلف الگوی حرکت اسپرمی (سرعت خط منحنی، سرعت خط مستقیم ، خطی بودن، درصد حرکت رو به جلو) خصوصاً در غلظت 3/0 نرمال در مقایسه با شاهد بود (05/0p<).

کلیدواژه‌ها

اسپرم اپیدیدیمی؛ گاو؛ اسید سیتریک؛ CASA؛ محیط Hams F10

اصل مقاله

مقدمه

استفاده از اسپرم‌های اپیدیدیمی در برخی موارد تنها منبع به‌دست آوردن اسپرم زنده می‌باشد، خصوصاً در مواردی که امکان تهیّة اسپرم از طریق انزال مقدور نباشد و یا در مواردی‌که دام‌های نر با ارزش، با پتانسیل ژنتیکی بالا به دلایلی کشتار شده و یا تلف می‌شوند و یا در مورد حیات وحش و دام‌های در حال انقراض، می‌توان پس از تلف شدن این دام‌ها درصورتی‌که مدت زیادی از مرگ آن‌ها نگذشته باشد، اسپرم‌های اپیدیدیمی را اخذ نمود (9، 10 و 21). البته اسپرم اپیدیدیمی قوچ بعد از کشتار تا 24 ساعت و در دمای 5+ درجه سانتی‌گراد نگه‌داری شده و در مقایسه با گروه شاهد، اختلاف معنی‌داری از نظر کاهش تحرک نداشته است (16 و 25). اسپرم‌های دم اپیدیدیم معمولاً کیفیت خوبی داشته و تا حد زیادی بالغ شده‌اند و توانایی لقاح با اووسیت را داشته و با وجود این‌که بالای 90%

اسپرم‌های اپیدیدیمی در گاو (5)، بز (6 و 18) و خوک (14) دارای قطرة پروتوپلاسمی‌اند، آبستنی‌های موفقیت‌آمیزی در گونه‌های مختلف دامی با استفاده از اسپرم‌های اپیدیدیمی در تلقیح مصنوعی، لقاح آزمایشگاهی و یا ریزتزریق (Microinjection) داخل سیتوپلاسم تخمک به‌دست آمده است (1 و 2). در ژاپن، اسپرم‌های اپیدیدیمی گونه‌ای از بز در حال انقراض با موفقیّت در محیطی با گلیسرول و زردة تخم مرغ منجمد گردید و زنده‌مانی اسپرم‌ها بعد از ذوب نیز ارزیابی شده ‌است (3، 11 و 24). محققینی توانسته‌اند با موفقیت اسپرم‌های اپیدیدیمی گاومیش را فریز کنند (12). در قسمت آمپول کانال دفران که به‌عنوان منبع ثانویة ذخیرة منی عمل می‌کند (اولیه در دم اپیدیدیم)، فروکتوز و اسید سیتریک به پلاسمای منی اضافه می‌شود (11، 12، 26 و 28) و غلظت آن در پلاسمای منی 720 میلی‌گرم در میلی‌لیتر است (20). در این مطالعه، تاثیر سه غلظت مختلف اسید سیتریک در محدودة pH اسپرم بر میزان زنده/ مرده و الگوی حرکتی اسپرم‌های اپیدیدیمی دم گاو با روشCASA طی 6 ساعت انکوباسیون در محیطHams F10 بررسی شد. از آن‌جایی‌که ارزیابی تحرک اسپرم در پیشگویی باروری آن نقش مهمی دارد و ارزیابی با CASA روش دقیق و قابل اعتمادی است، لذا از این‌روش در مطالعة فوق استفاده گردید (8، 9 و 17).

مواد و روش‌کار

با مراجعه به کشتارگاه صنعتی ارومیه در استان آذربایجان‌غربی از مهر 86 تا شهریور 87، در مجموع تعداد 50 جفت بیضة گاوهای بالغ در محدوده سنی 18 الی 24 ماه (بر اساس فرمول دندانی) بلافاصله بعد از کشتار جمع‌آوری شده و بیضه‌های سالم، بدون چسبندگی و با دم اپیدیدیمی برجسته، انتخاب و در مجاورت پک‌های پلاستیکی دارای یخ 5 درجه سانتی‌گراد، سریعاً (در مدت کمتر از 30 دقیقه) به آزمایشگاه منتقل می‌گردید. قبلاً محیطHams F10 و رقت‌های اسید سیتریک آماده شده و در انکوباتور CO2 در دمای 37 درجة سانتی‌گراد نگه‌داری می‌شد. بلافاصله پس از برش تونیکا آلبوژینه، ناحیة دم اپیدیدیم بیضه، بین دو انگشت تثبیت و در بخشی که کمترین عروق خونی وجود داشت، با یک برش سریع، اسپرم‌های موجود، بدون این‌که با خون آغشته شود به خانه‌های میکروپلیت 24 خانه با 1 میلی‌لیتر محیط کشت، انتقال می‌یافت (17 و 19). تمامی مراحلی که بیرون از انکوباتور انجام می‌شد، روی صفحه گرم صورت می‌گرفت تا اسپرم‌ها دچار شوک حرارتی نشوند. هر خانه از میکرو‌پلیت حاوی 1 میلی‌لیتر محلول Hams F10 با 10% FCS بود و پس از جمع‌آوری و انتقال اسپرم‌ها در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد به مدت حداقل 15 دقیقه قرار داده می‌شد تا فعالیّت اسپرم‌ها آغاز گردد. بلافاصله پس از این مرحله ضمن شمارش سریع با کمک لام هماسیتومتر نئوبار زمینه تاریک، تعداد اسپرم اپیدیدیمی موجود در هر خانه مشخص شده و سریعاً یک لام با روش رنگ‌آمیزی ائوزین- نگروزین تهیّه می‌گردید و اسپرم‌ها از نظر زنده و مرده بودن بررسی می‌شدند

در آماده‌سازی رقت‌های اسید سیتریک ذکر شده در این مطالعه، محدودة pH نرمال اسپرم گاو (5/6 الی 7)، در نظر گرفته شد و رقت‌های بالاتر به‌دلیل اسیدی کردن محیط بررسی نشد. مقدار 1 نرمال اسید سیتریک در مایع منی گاو 7 میلی‌گرم در میلی‌لیتر است (20) و بر اساس آن، رقت‌های 1/0، 2/0 و 3/0 نرمال تهیّه شد.

نحوة شمارش اسپرم‌های اپیدیدمی و بررسی رقت نهایی

به‌منظور شمارش و بررسی رقت‌های نهایی، از اسپرمی که به‌عنوان استوک (Stock) تهّیه شده بود، رقت 1 به 100 با سالین نرمال فرمالینه (2/0٪) تهیه شد، سپس از محلول مورد نظر با سمپلر 20 میکرولیتر برداشت گردید و در گوشة لام و لامل قرار داده شد تا اسپرم‌ها به زیر فضای لام نئوبار زمینه تاریک و لامل کشیده شوند. بعد از مدت کمی که اسپرم‌ها ساکن شدند، عمل شمارش انجام گردید. برای انجام شمارش، اسپرم‌های 25 مربع وسط لام شمارش و حاصل در عدد یک

میلیون ضرب شد تا تعداد اسپرم در میلی‌لیتر مشخص شود و از آن برای تهیّة رقت مورد ارزیابی توسط سخت افزار کاسا استفاده شود (4، 18 و 22).

پس از شمارش اسپرم، رقت‌های 50 میلیون اسپرم در 1 میلی‌لیتر محلول هامس با 10% سرم گوسالة جنینی داخل انکوباتور 37 درجة سانتی‌گراد قرار گرفت و از طرفی رقت‌های 2/0، 4/0 و 6/0 نرمال اسید سیتریک در 1 میلی‌لیتر محلول هامس با 10% سرم گوسالة جنینی آماده شد و در انکوباتور 37 درجة سانتی‌گراد، قرار گرفت.

برای بررسی غلضت‌های 1/0، 2/0 و 3/0 نرمال اسید سیتریک از رقت‌های 2/0، 4/0 و 6/0 نرمال به میزان 5/0 میلی‌لیتر برداشته و همچنین از میکروتیوب حاوی غلظت 50 میلیون اسپرم در 1 میلی‌لیتر محلول هامس با 10% سرم گوسالة جنینی نیز 5/0 میلی‌لیتر برداشته و هر دو رقت به میکروتیوب‌های دیگری انتقال داده شد تا در نهایت رقت‌های 1/0، 2/0 و 3/0 نرمال اسید سیتریک در 1 میلی‌لیتر محلول هامس با 10% سرم گوسالة جنینی و 25 میلیون اسپرم به‌دست آید (CASA قادر به شناسایی و محاسبة الگوی حرکت رقت‌های بالای 40 میلیون نمی‌باشد). هم‌چنین در ارتباط با گروه شاهد نیز 5/0 میلی‌لیتر از رقت 50 میلیون اسپرم در میلی‌لیتر را برداشته و فقط همراه با 5/0 میلی‌لیتر محلول هامس با 10% سرم گوسالة جنینی به میکروتیوب دیگری انتقال داده‌ شد تا غلظت 25 میلیون اسپرم در 1 میلی‌لیتر محلول هامس با 10% سرم گوسالة جنینی به‌دست آید. سپس در زمان‌های 15،30، 45، 60، 90، 120، 180، 240 و360 دقیقه، به‌میزان 10 میکرولیتر از نمونة حاوی اسید سیتریک و گروه شاهد به‌طور جداگانه برداشته شد و داخل خانة 10 میکرولیتری لام ماکلر (Makler) که قبلاً روی Warm stage 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شده بود، ریخته شد و پس از قرار دادن در پوش لام، زیر میکروسکوپ متصل به دوربین و سخت افزار کامپیوتری در 5 شان میکروسکوپی، الگوی حرکتی اسپرم‌ها توسط دستگاه ثبت گردید. البته به‌منظور بررسی اسید سیتریک در رقت‌های مورد نظر روی زنده/ مرده بودن اسپرم‌ها، هم‌زمان نمونه‌هایی نیز از شاهد و رقت‌های 1/0، 2/0 و 3/0 نرمال در زمان‌های 0، 30، 60، 120، 180، 240 و360 دقیقه جهت رنگ‌آمیزی ائوزین-نگروزین تک‌مرحله‌ای گرفته می‌شد. گسترش‌های تهیّه شده سریع در مجاورت هوا خشک شده و سپس ارزیابی با بزرگ‌نمایی 1000× انجام پذیرفت و 200 عدد اسپرم در هر لام شمارش شد (6، 8 و 17).

جهت آنالیز آماری از نرم افزار آماری SPSS ویرایش 15 و آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه (One Way ANOVA) استفاده شد. داده‌ها از نظر معنی‌دار بودن تفاوت واریانس‌ها مورد بررسی قرار گرفتند و برای انجام آزمون‌های تعقیبی (Post Hoc Multiple Comparsions) آزمون توکی (Tukey) مورد استفاده قرار گرفت.

پارامترهائی‌که توسط سیستمCASA ارزیابی می‌شود شامل:

ClassA: درصد اسپرم‌های متحرک با سرعت بالا.

ClassB: درصد اسپرم‌های متحرک با سرعت پائین (حرکت آهسته).

ClassC: درصداسپرم‌هایی که حرکت درجا دارند.

ClassD: درصد اسپرم‌هایی که ساکن بوده واحتمالاً مرده‌اند.

A+B : مجموع درصد اسپرم‌هایی‌ که حرکت سریع و آهسته دارند.

A+B+C: درصد اسپرم‌های زنده که شامل مجموع درصد اسپرم‌هایی که حرکت سریع و آهسته داشته همراه با درصد اسپرم‌های بدون حرکت پیش‌رونده و با حرکت درجا هستند.

در ارتباط با سرعت حرکت اسپرمی داده‌های زیر توسط CASA محاسبه می‌شود:

VCL (Curvilinear Velocity): میانگین سرعت اسپرم در مسیر واقعی که به‌صورت منحنی است و بر حسب میکرومتر بر ثانیه محاسبه می‌شود.

VSL (Straight-line Velocity): به‌صورت میانگین سرعت حرکت اسپرمی در خط مستقیم و بر حسب میکرومتر در ثانیه محاسبه می‌شود.

VAP (Average Path Velocity): میانگین سرعت اسپرم در میانگین مسیر واقعی است و برحسب میکرومتر در ثانیه محاسبه می‌شود.

در ارتباط با بقیه داده‌ها نیز:

MAD (Mean Angel Degree): مجموع زوایایی که میانگین سرعت حرکت اسپرم در مسیر منحنی، متوسط سرعت مسیر را قطع می‌کند.

ALH (Amplitude of Lateral Head Displacement): پهنا یا عرض حرکت جانبی سر اسپرم برحسب میکرومتر است.

BCF (Beat-Cross Frequency): فرکانس ضربان عرضی یا تعداد دفعات عبور سر اسپرم از مسیر حرکت و بر حسب هرتز می‌باشد.

LIN (Linearity): یا خطی بودن مشخص می‌کند که چقدر مسیر حرکت اسپرم در مسیر واقعی به خط مستقیم نزدیک است.

WOB (Wobble): یا لرزش و درصد مستقیم بودن یا STR (Straightness) به‌صورت زیر محاسبه می‌شود (17 و 23).

نتایج

در ارتباط با تغییر الگوی حرکتی اسپرم‌های اپیدیدیمی، موارد معنی‌دار در زیر جداول مربوط به هر الگوی حرکتی، توضیح داده شده است (جداول 1 الی 13).

همان‌طور که در جدول 1 مشاهده می‌شود، در گروه شاهد دقیقة 15، میزان 78/46% اسپرم‌ها دارای حرکت رو به جلو هستند و در اسیدسیتریک 1/0 و 2/0 و 3/0 نرمال این میزان به‌ترتیب 36/48، 85/45 و 62/47 می‌باشد. با گذشت زمان تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری در گروه‌ها و زمان‌های مختلف مشاهده نمی‌شود، ولی از دقیقة 90 تا 180 بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و درصد حرکت رو به جلوی اسپرم‌ها در گروه اسیدسیتریک در مقایسه با شاهد بیشتر است (05/0p<). از دقیقة 240 تا 360 باز هم بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده (05/0p<) و از طرفی اسید سیتریک 2/0 نرمال نیز دارای اختلاف معنی‌داری با گروه شاهد می‌باشد (05/0p<).

همین‌طور اسید سیتریک 3/0 نرمال با اسید سیتریک 1/0 نرمال دارای اتلاف معنی‌داری می‌باشد (05/0p<).

همان‌طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود، تا دقیقة 180 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف، وجود ندارد. در دقیقة 240، بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در گروه شاهد، درصد اسپرم‌های ساکن بیشتر است (05/0p<). همین‌طور بین اسید سیتریک 1/0 نرمال و اسید سیتریک 3/0 نرمال، باز اختلاف معنی‌دار بوده و درصد اسپرم‌های ساکن در اسید سیتریک 1/0 نرمال بیشتر است(05/0p<). در دقیقة 360، فقط گروه اسید سیتریک 3/0 نرمال و شاهد، دارای اختلاف معنی‌داری هستند و درصد اسپرم‌های ساکن در گروه شاهد بیشتر است (05/0p<).

همان‌طور که در جدول 3 مشاهده می‌شود، تا دقیقة 180 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندارد. در دقیقة 240 و 360 بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، درصد الگوی A+B بیشتر است (05/0p<). از طرفی در دقیقة 360، بین گروه شاهد و اسید سیتریک 2/0 نرمال باز اختلاف معنی‌دار بوده و درصد الگوی A+B در اسید سیتریک 2/0 نرمال بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 4، تا دقیقة 180 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌ها وجود ندارد. در دقیقة 240 و 360 بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، درصد اسپرم‌های زنده بیشتر است (05/0p<). در دقیقة 240 اسید سیتریک 2/0 و 3/0 نرمال دارای اختلاف معنی‌دار بوده و درصد اسپرم‌های زنده در اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 5، از نظر الگوی سرعت خط منحنی تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری بین گروه‌های مختلف وجود ندارد. از دقیقة 90 اختلاف معنی‌دار شروع می‌شود. در دقیقة 90، 120، 180، 240 و 360 بین شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، سرعت خط منحنی حرکت اسپرمی که بر حسب میکرومتر بر ثانیه بیان می‌شود، بیشتر است (05/0p<). البته در دقیقة 240 و 360 نیز بین اسید سیتریک 2/0 نرمال و گروه شاهد، اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 2/0 نرمال، سرعت حرکت خط منحنی اسپرمی بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 6، از نظر الگوی متوسط سرعت مسیر تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری بین گروه‌های مختلف وجود ندارد. از دقیقة 90 اختلاف معنی‌دار شروع می‌شود. در دقایق 90، 120، 180، 240 و 360 بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، متوسط سرعت مسیر که بر حسب میکرومتر بر ثانیه بیان می‌شود، بیشتر است (05/0p<). در دقیقة 360 باز بین گروه شاهد و اسید سیتریک 2/0 نرمال، اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 2/0 نرمال، متوسط سرعت مسیر بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 7، از نظر سرعت خط مستقیم تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندارد. از دقیقة 90 اختلاف معنی‌دار شروع می‌شود. در دقایق 90، 120، 180، 240 و 360 مابین شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، سرعت خط مستقیم که بر حسب میکرومتر بر ثانیه بیان می‌شود، بیشتر است (05/0p<). در دقیقة 120، بین اسید سیتریک 2/0 نرمال و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و سرعت خط مستقیم در اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر است (05/0p<). در دقیقة 240 و 360 نیز شاهد با اسید سیتریک 2/0 نرمال اختلاف معنی‌دار داشته و از گروه شاهد بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 8، از نظر الگوی دامنة حرکت جانبی سر اسپرم تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندارد. از دقیقة 90 اختلاف معنی‌دار شروع می‌شود. در دقایق 90، 120، 180، 240 و 360 مابین شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، دامنة حرکت جانبی سر اسپرم که برحسب میکرومتر بیان می‌شود، بیشتر است (05/0p<). در دقیقة 240 گروه شاهد با اسید سیتریک 1/0 و 2/0 نرمال اختلاف معنی‌دار داشته و کمتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 9، از نظر الگوی فرکانس ضربان عرضی تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندارد. در دقایق 90، 180 و240 بین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 اختلاف معنی‌دار بوده و فرکانس ضربان عرضی که بر حسب هرتز بیان می‌شود، در شاهد بیشتر از اسید سیتریک 3/0 نرمال است (05/0p<). از طرفی در دقیقة 240 بین گروه شاهد و اسید سیتریک 2/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و فرکانس ضربان عرضی شاهد بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 10، از نظر الگوی خطی بودن تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندارد. از دقیقة 90 اختلاف معنی‌دار شروع می‌شود. در دقایق 90، 120، 180، 240 و 360 گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، درصد خطی بودن حرکت اسپرم، بیشتر است (05/0p<). هم‌چنین بین اسید سیتریک 1/0 و 3/0 نرمال در دقایق 90، 120 و 240 اختلاف معنی‌دار بوده و درصد خطی بودن اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 11، از نظر درصد لرزش، تا دقیقة 60 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندشت. از دقیقة 90، اختلاف معنی‌دار شروع می‌شود. در دقیقة 90، 120، 180، 240 و 360 مابین گروه شاهد و اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و در اسید سیتریک 3/0 نرمال، درصد لرزش اسپرم بیشتر است (05/0p<). بین اسید سیتریک 1/0 و 3/0 نرمال در دقیقة 90، 120، 240 و 360 اختلاف معنی‌دار بوده و درصد لرزش در اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر است (05/0p<). هم‌چنین بین اسید سیتریک 2/0 و 3/0 نرمال در دقیقة 90 و 120 نیز اختلاف معنی‌دار بوده و درصد لرزش اسپرم‌ها در اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر است (05/0p<).

با توجه به جدول 12، از نظر درصد مستقیم بودن تا دقیقة 90 اختلاف معنی‌داری مابین گروه‌های مختلف وجود ندشت. در دقایق 120، 240 و 360 بین گروه شاهد و گروه اسید سیتریک 3/0 نرمال اختلاف معنی‌دار بوده و درصد مستقیم بودن در گروه اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر بوده (05/0p<). هم‌چنین در دقایق 120 و 360 بین اسید سیتریک 1/0 و 3/0 نرمال، اختلاف معنی‌دار و درصد مستقیم بودن در اسید سیتریک 3/0 نرمال بیشتر است (05/0p<).

در تمامی گروه‌ها، شمارش اسپرم‌های زنده یا مرده با ارزیابی چشمی (شمارش 200 اسپرم با بزرگ نمایی1000× در هر لام با میکروسکوپ نوری) در مقایسه با ارزیابی توسط کاسا معنی‌دار نبود (جدول 13). بنابراین، می‌توان در ارزیابی اسپرم‌های زنده یا مرده به سیستم کاسا اعتماد کرد. البته کاسا همواره اسپرم بیشتری را به‌عنوان مرده ارزیابی خواهد کرد، چراکه اسپرم قبل از این‌که غشاء آن به رنگ ائوزین نفوذ پذیر شود، ممکن است تحرک خود را از دست بدهد و توسط کاسا به‌عنوان اسپرم مرده تلقی شود ولی این میزان از نظر آماری معنی دار نیست (05/0p<).

بحث و نتیجه‌گیری

تحرک اسپرم، برای عبور از مجاری تناسلی ماده و نفوذ به‌داخل اووسیت طی لقاح ضروری است و عموماً عقیده بر این است که تحرک اسپرم از شاخصه‌های ضروری است که نشان‌دهندة توانایی لقاح اسپرم و زنده بودن و طبیعی بودن ساختارهای اسپرم است (17). بررسی میزان باروری اووسیت انسان و حیوانات در آزمایشگاه (In Vitro) بیانگر ارتباط معنی‌دار تحرک اسپرم با باروری است و اختلاف آماری معنی‌دار و مهمی در شاخصه‌های تحرک اسپرمی مابین اسپرم‌هائی‌که درصد باروری بالایی دارند با آن‌هائی‌که درصد باروری پائینی داشته و سبب آبستنی ناموفقی می‌شوند، وجود دارد (1 و 3). ارزیابی کیفیت منی بر اساس ارزیابی‌های چشمی و فردی مثل حرکت کلی و انفرادی اسپرم‌ها و بررسی‌های عملی‌تر مثل غلظت منی و اختلالات مورفولوژیکی اسپرم انسان و حیوانات، وقتی با میکروسکوپ نوری صورت می‌گیرد، تفاوت‌های 60-30 درصدی مثلاً در ارزیابی یک نمونة انزالی دیده می‌شود (27).

ارتباط مابین معیارهای کاسا و باروری پستانداران در بیشتر گونه‌ها دارای ارزش تشخیصی است و در گونه‌های مختلفی از قبیل موش، گاونر، خوک نر، خرگوش، بوقلمون، نریان و انسان، جهت تجزیه تحلیل الگوی حرکتی اسپرم، به‌کار رفته است و اختلافات معنی‌داری در شاخصه‌های الگوی حرکت اسپرمی مابین اسپرم‌هایی که توانایی لقاح بالاتری دارند در مقایسه با اسپرم‌هایی که توانایی لقاح آن‌ها پائین است وجود دارد (17). Holt و همکاران در سال 1994 گزارش کرده‌اند که سرعت خط منحنی اسپرم انزالی، قویاً با میزان لقاح آزمایشگاهی ارتباط دارد (13). Janulisو همکاران در سال 1996 مشاهده کردند که دامنة حرکت جانبی سر اسپرم‌های متحرکی که با روش "جداسازی اسپرم طبیعی با حرکت مناسب" انتخاب شده‌اند، با میزان لقاح آزمایشگاهی ارتباط معنی‌داری دارد (15). Chan و همکاران در سال 1990 گزارش کرده‌اند که سرعت خط منحنی اسپرم‌هائی ‌که جدا سازی و انتخاب شده‌اند، عامل مهمی در لقاح آزمایشگاهی می‌باشد (5). اسپرم گاوهای نر با قدرت باروری بالا (Superior Fertility)، تحرک بالایی داشته و از نظر میزان زنده بودن و سرعت خط مستقیم و همچنین اختلالات مورفولوژیکی کمتر و نیز قابلیت بالا در ِسویم آپ (Swim up) و میزان نفوذ زیاد در ترشحات مخاطی گردن رحم، با اسپرم گاوهای نر دیگر متفاوتند (15). اهمّیت سرعت خط مستقیم با ظرفیت باروری دام در گونه‌های زیادی از جمله گاو نر و خوک مشاهده شده است. در بررسی Gillan و همکاران در سال2007، پس از سویم آپ ، درصد اسپرم‌های زنده با حرکت پیش‌رونده و سرعت بیشتر (سرعت خط منحنی، سرعت خط مستقیم و متوسط سرعت مسیر) و معیارهای دامنة حرکت جانبی سر، ضربان عرضی سر و خطی بودن مسیر حرکت، در گاوهای نر اصیل، خیلی بیشتر بوده، اختلالات مورفولوژیکی اسپرم این گاوها کمتر بوده و نفوذپذیری اسپرم در ترشّحات مخاطی گردن رحم، در گاوهائی‌که قابلیت باروری بالایی داشته و شاخصه‌های الگوی حرکتی (سرعت خط منحنی، خط مستقیم و متوسط سرعت مسیر و دامنة حرکت جانبی سر) بالاتری داشته‌اند، بیشتر بوده است (8). بنابراین سیستم کاسا هم می‌تواند درصد اسپرم‌های متحرک و هم شاخصه‌های حرکت اسپرمی را مثل سرعت شنای اسپرم و الگوی شنای اسپرم در نمونه را بررسی کند (8). در بررسی Kathiravan و همکاران در سال 2007 روی الگوی حرکتی اسپرم‌های گاوهای دو رگه و ارتباط آن با باروری اووسیت بدون زونای هامستر، ارتباط مؤثر و مثبتی مابین حرکت پیش رونده و درصد لقاح و باروری مشاهده شده است. هم‌چنین ارتباط معنی‌داری مابین شاخصه‌های سرعت حرکت اسپرمی (متوسط سرعت مسیر و سرعت خط مستقیم) و درصد باروری در این مطالعه به‌دست آمده است که با نتایج به‌دست آمده در پژوهش‌های پزشکی هم‌خوانی دارد (17). در مطالعة Cox و همکاران در سال 2006 روی الگوی حرکتی اسپرم بز و ارتباط آن با حرکت در ترشّحات مخاطی گردن رحم، مشخص شده است که ارتباط معنی‌داری مابین سرعت خط منحنی و متوسط سرعت مسیر، با قابلیت نفوذ در موکوس سرویکس بز ماده وجود دارد. البته شاخص حرکت جانبی سر اسپرم چندان ارتباط معنی‌داری با نفوذ به‌داخل موکوس نداشته است، چرا که اسپرم بزهای نری که سرعت حرکت یکسانی در مقایسه با اسپرم بزهای دیگر داشته اند، ولی دامنة حرکت جانبی سر آن‌ها بالاتر بوده است، قابلیت نفوذ داخل موکوس سرویکس کمتری داشته‌اند و ارتباط مابین حرکت جانبی سر و قابلیت نفوذ داخل موکوس سرویکس چندان معنی‌دار نبوده است. لکن مشخص گردیده است که شاخصه‌هائی که در بررسی الگوی حرکت اسپرمی با سیستم کاسا به‌دست می‌آید می‌تواند پیشگویی کنندة پتانسیل اسپرم در رسیدن به ناحیة اتصالی رحم و اویداکت (Uterotubal Junction) و به‌دنبال آن لقاح اووسیت باشد (6). در بررسی Elzanaty و همکاران در سال 2005 روی دورة استراحت جنسی و ترشّحات اپیدیدمی و غدد ضمیمه و نقش آن‌ها در تحرک اسپرم انسان، مشخص شده است که 5-4 روز پس از استراحت جنسی، دامنة حرکت جانبی سر اسپرم افزایش یافته، به‌علاوه سرعت خط مستقیم و خطی بودن مسیر حرکت اسپرم در نمونه‌هائی‌که 3-2 روز پس از استراحت جنسی تهیه می‌شوند، بالاتر بوده و این نشانگر این مطلب است که دورة استراحت جنسی روی درصد اسپرم‌های متحرک و شاخصه‌های الگوی حرکتی آن‌ها که ناشی از ترشّحات اپیدیدم و پروستات می‌باشد، نقش داشته و برای بررسی این ارتباط می‌توان از روش کاسا کمک گرفت (7). در بررسی کیفیت اسپرم اپیدیدمی بیضه‌های راست و چپ و بررسی الگوی حرکتی آن که توسط Goovaerts و همکاران در سال 2006 صورت گرفته است، نتایج کاسا نشان‌دهندة تفاوت بین الگوی حرکت اسپرم‌های اپیدیدمی و انزالی بوده و در یک دورة زمانی مشخص، اسپرم‌های اپیدیدمی سرعت خط مستقیم و متوسط سرعت مسیر کمتری از اسپرم‌های انزالی داشته‌اند و در عین حال سرعت خط منحنی اسپرم‌های اپیدیدمی بیشتر بوده و همچنین فرکانس ضربان عرضی کمتر و دامنة جابجایی سر اسپرمی بیشتری در مقایسه با اسپرم‌های انزالی داشته‌اند. از طرفی درصد اسپرم‌های با حرکت پیش‌رونده، در اسپرم انزالی بالاتر بود و این به‌دلیل کاهش فعالیت‌های متابولیکی ناشی از اثرات اپیدیدیم (و احتمالاً حضور قطرة پروتوپلاسمی دور) بوده است. به‌هرحال، اسپرم‌های انزالی در مقایسه با اسپرم‌های اپیدیدیمی شاخصه‌های حرکتی بهتری داشته و در طی کردن مجاری دستگاه تناسلی دام ماده سریع‌تر و بهتر از اسپرم‌های اپیدیدیمی عمل می‌نمایند (9).

در این مطالعه، اسید سیتریک 3/0 نرمال از دقیقة 90 به بعد الگوی حرکتی اسپرم‌ها را تغییر داده (05/0p<) و در‌صد اسپرم‌های با حرکت سریع (Class A) در مقایسه با گروه شاهد به‌طور معنی‌داری بیشتر شده است. همراه با این شاخص، میزان سرعت خط منحنی، سرعت خط مستقیم، متوسط سرعت مسیر، دامنة حرکت جانبی سر و لرزش نیز از دقیقة 90 به بعد بیشتر از گروه شاهد شده است. در گروه اسید سیتریک 2/0 نرمال از دقیقة 240 به بعد، در مقایسه با گروه شاهد درصد اسپرم‌های با حرکت سریع افزایش یافته است. گروه اسید سیتریک 1/0 نرمال در دقایق 240 و 360 در مقایسه با اسید سیتریک 3/0 نرمال تفاوت معنی‌داری نشان داده و درصد اسپرم‌های با حرکت سریع آن کمتر بوده است.

جدول 1- میانگین و خطای معیار میانگین (SEM) الگوی CLASS A (اسپرم‌های با حرکت سریع) در هر گروه زمانی به تفکیک گروه مورد آزمایش

زمان(دقیقه)	15	30	45	60	90	120	180	240	360
گروه‌ها	15	30	45	60	90	120	180	240	360
^شاهد	^a5/2±87/46	^a73/2±58/56	^a8/2±65/57	^a69/2±71/54	^a8/1±66/48	^a06/2±98/46	^a51/2±14/46	^c93/2±39/44	^c13/2±35/43
^{اسید سیتریک 1/0 نرمال}	^a89/3±36/48	^a1/2±02/51	^a4/3±54/57	^a77/3±08/55	^ab48/1±69/51	^ab25/3±66/50	^ab55/2±81/48	^bc25/2±08/47	^bc 34/2±74/45
^{اسید سیتریک 2/0 نرمال}	^a41/3±85/45	^a68/2±9/51	^a07/3±1/52	^a24/3±4/55	^ab72/2±45/54	^ab99/2±78/53	^ab67/2±52	^ab92/2±17/57	^ab21/2±66/53
^{اسید سیتریک 3/0 نرمال}	^a95/2±62/47	^a53/3±24/53	^a74/2±52/54	^a76/2±73/55	^b96/2±73/60	^b75/2±14/60	^b9/3±21/60	^a41/2±28/59	^a5/2±93/55

در هر گروه زمانی (در هر ستون)، حروف لاتین غیر مشترک یا غیر یکسان، دارای اختلاف معنی‌دار هستند.

جدول 2- میانگین و خطای معیار میانگین الگوی CLASS D (اسپرم‌های ساکن یا بدون حرکت) در هر گروه زمانی به تفکیک گروه مورد آزمایش

زمان (دقیقه)	15	30	45	60	90	120	180	240	360
گروه‌ها	15	30	45	60	90	120	180	240	360
^شاهد	6 /1±33/22^a	/4±61/1876^a	^a 17/2±25/14	^a 16/3±45/18	^a 25/2±27/22	^a 31/3±83/25	^a 39/2±98/26	^a73/1±27	^a24/1±88/29
^{اسید سیتریک 1/0نرمال}	^a 04/4±05/23	^a 31/3±67/21	^a 56/3±07/17	^a 11/3±27/18	^a 07/3±19/22	^a 99/2±5/21	^a 17/3±19/26	^ac81/2±9/25	^ab95/1±20/27
^{اسید سیتریک 3/0نرمال}	^a 06/2±5/26	^a 66/2±76/20	^a 15/4±06/21	^a 78/2±75/19	^a 52/1±89/18	^a 10/2±25/22	^a 25/3±75/22	^ab10/2±09/21	^ab63/1±84/23
^{اسید سیتریک 3/0نرمال}	^a 85/1±79/20	^a 48/3±15/21	^a 15/3±6/18	^a 01/4±06/20	^a 14/2±25/13	^a 93/2±19/17	^a 89/3±67/16	^b35/1±7/15	^b25/2±01/20