ارزیابی خواص ضدباکتریائی عصاره الکلی بره‌موم بر جدایه‌های ورم پستان گاوی در شرایط آزمایشگاهی

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 3، دوره 9، 2 (34) تابستان، شهریور 1394، صفحه 117-129   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

یونس انزابی^{* 1}؛ صهیب شقاقی²

¹استادیار گروه پاتوبیولوژی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

²دانشجوی دکترای دانشکده دامپزشکی، واحد تبریز، دانشگاه آزاد اسلامی، تبریز، ایران.

چکیده

   مطالعه حاضر با هدف بررسی تاثیر ضد باکتریائی عصاره بره­موم بر تعدادی از جدایه­های مربوط به ورم پستان گاوی انجام گردید. بدین منظورازروش انتشار درآگار جهت انجام آزمایش حساسیت میکروبی و از روش رقت لوله­ای جهت تعیین حداقل غلظت ممانعت از رشد (MIC) و حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) به­طور جدا­گانه استفاده گردید. آزمایش حساسیت میکروبی در مورد آنتی­بیوتیک­های استاندارد تتراسایکلین و آمیکاسین و نیز دیسک آغشته به عصاره الکلی بره­موم نشان داد که قطر منطقه عدم رشد ایجاد­شده توسط این ترکیب در مورد همه جدایه­های مورد آزمایش بزرگ­تر و در مورد اشریشیا کولی و کلبسیلا نومونیا این اختلاف اندازه معنی­داری (05/0p<) بود. همچنین نتایج حاصل از آزمایشات MIC وMBCهم مشخص کرد که میزان مهار رشد باکتری توسط بره­موم با میزان بره­موم موجود در رقت­ها رابطه مستقیم دارد و با افزایش میزان بره­موم در هر رقت از تعداد کلنی­های باکتری بعد از کشت کاسته­شده و در رقتی که نشان­دهنده MBCعصاره بره­موم در مورد هریک از جدایه­ها بود،هیچ­یک از آن­ها اصلاً رشد نکرد.لذا به نظر می­رسد که می­توان از ترکیبات مربوط به این ماده طبیعی به عنوان مواد آنتی­باکتریال مناسب به طور موثر ­علیه طیف وسیعی از باکتری­های ایجاد­کننده ورم پستان گاوی به­جای آنتی­بیوتیک­های صناعی استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

بره‌موم؛ عصاره الکلی؛ اثرضد باکتریائی؛ جدایه‌های ورم پستان

اصل مقاله

مقدمه

   بره­موم (Propolis)ماده­ای چسبنده و خمیری شکلی است که توسط زنبورهای عسل کارگر برای مصارف متعدد از جمله بستن منافذ داخل کندو و جلوگیری از اثر نور و رطوبت و مقابله با عوامل خارجی و نیز ضدعفونی و تنظیم دمای محیط داخلی کندو استفاده می­شود. این ماده چسبنده غیر­سمی بر اساس ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و مکان جغرافیایی که این ماده از آنجا تهیه می­شود، به 12 نوع تقسیم می‌گردد.بره­موم حدوداً حاوی 30 درصد موم (wax)، 55 درصد رزین و بالزام (balsams)، 10 درصد روغن‌های اتری و اسید­های چرب و 5 درصد گرده گل­ها (pollen) می‌باشد (رضویان و همکاران 1391). در ارتباط با خواص فیتو­شیمیائی بره­موم زنبور­عسل با استفاده از روش­های آنالیز بیوشیمیائی بیش از 300  ترکیب مختلف شناسائی شده و مشخص کرده­اند که ماده مذکور، از ترکیبات متنوعی از جمله مقادیر بسیار بالایی از فلاونوئیدها، الکل­ها، اسیدهای آلفاتیک، آمینواسیدها، اسیدهای آروماتیک، استرهای آروماتیک، کالکون­ها، تریپنوئیدها، قندها و استروئیدها تشکیل شده­است (Marcucci, 1995؛مرادی،1388). همچنین مشخص شده که بره­موم حاوی مقادیر بالایی از ویتامین­ها به­خصوص ویتامین B­ کمپلکس، ویتامین C، ویتامینE  و پروویتامین A و مواد معدنی و عناصر کمیابی مانند کلسیم، منیزیم، آهن، روی، سیلیس، پتاسیم، فسفر، منگنز، کبالت و مس می‌باشد. (هاتفی و همکاران1387). البته بایستی توجه کرد که به­طور کلی خواص کیفی و رنگ بره­موم بستگی به منابع گیاهی دارد که توسط زنبور­های هر کندو مورد استفاده قرار می­گیرد (Isla, 2005؛ خادم حقیقیان و همکاران، 1390). همچنین نشان داده شده که ترکیبات فعال مهم موجود در بره­موم، شامل فلاوونوئیدها و اسیدهای فنولیک می‌باشند (Park et al., 2002; Almas et al., 2001; Chena et al; 2009;   ).

   از طرف دیگر از آنجایی که بره­موم دارای طیف وسیعی از فعالیت­های بیولوژیکی است، در طب سنتی هم به‌طور فراوان کاربرد دارد به‌طوری‌که عسل و بره موم قرن­هاست که در درمان زخم­ها استفاده می­شوند (خادم حقیقیان و همکاران 1390؛ 2001 etal., Banskota). هم‌چنین از این ماده در طب سنتی برای درمان بسیاری از بیماری­های سیستمیک مانند آرتریت روماتوئید، مشکلات پوستی مانند اگزما و لوپوس، مشکلات تنفسی مانند آسم و نیز بالا­بردن سلامت عمومی استفاده می­شود (رضویان و همکاران1391). در بررسی اتنوفارماکولوژی ماده مذکور در ایران نیز می‌توان به خواص درمانی این ترکیب نظیر معالجه سرفه، سرماخوردگی، دردهای قفسه سینه، سوختگی­ها، زخم­ها و مشکلات لثه ودندان به عنوان ضدعفونی­کننده و التیام­بخش اشاره کرد (سیدی و فرشینه، 1389). همچنین ویژگی­های درمانی بره­موم به عنوان ماده­ای با خواصی نظیر ضد­مسمومیت کبدی، ضدسرطان، آنتی‌اکسیدان، ضدالتهاب، ضدمیکروبی و ضدویروس و نیز افزایش­دهنده فعالیت­های ایمنی بدن گزارش گردیده است (رضویان و همکاران 1391؛ Tosi et al., 2007; Borrelli et al., 2007; Khalil et al., 2006).

   انواع اورام پستان در نشخوارکنندگان و مخصوصاً در گاو بدون شک از نظر اقتصادی حائز اهمیت بالائی در همه کشورها است و علی­رغم این­که در سال­های اخیر تحقیقات و اقدامات وسیعی جهت کنترل آن­ها صورت گرفته، ولی هنوز هم به­عنوان یک مشکل اصلی در خصوص بهداشت شیر و فراورده­های لبنی در بسیاری از نقاط دنیا مطرح می‌باشند. در این میان استافیلوکوکوس آرئوس و استرپتوکوکوس آگالاکتیه به عنوان مهم­ترین عوامل ایجاد­کننده ورم پستان واگیر­دار در گاو نقش مهمی در کاهش تولید شیر، افت کیفیت شیر و حذف اجباری و زود هنگام دام­ها از گله دارند. همچنین باکتری استرپتوکوکوس دیس‌گالاکتیه عامل مهمی در ایجاد ورم پستان حاد در گاو بوده و نحوه بیماری­زائی آن تقریبا مشابه باکتری استرپتوکوکوس آگالاکتیه می­باشد،اما اشاعه به­مراتب کمتری داشته و معمولاً به صورت انفرادی دیده می­شود. از طرف دیگر ورم پستان محیطی یا تورم پستان کولی­فرمی در گاو که عوامل دخیل در آن عبارتند از: اشریشیا کولای، کلبسیلا نومونیا و انتروباکتر آئروژنز، اغلب به­صورت فوق حاد بروز می­کند و معمول‌ترین فرم کشنده ورم پستان، مخصوصاً در مورد آن دسته از گاوهای شیری است که در فصول سرد سال در فضای بسته نگه‌داری می­شوند­. البته وقوع این نوع ورم پستان غالباً با سطح بهداشت و آلودگی محیط با باکتری­های ذکر­شده ارتباط دارد. در دسترس­ترین روش مبارزه با انواع اورام پستان­ در گاو تشخیص دقیق و به­موقع عامل ایجاد­کننده و در ­نهایت اقدام به درمان با استفاده از آنتی­بیوتیک­های مناسب پس از بررسی میزان حساسیت و مقاومت جدایه­ها با انجام آزمایش سنجش حساسیت میکروبی می­باشد. اهمیت این امر زمانی بیشتر مشخص می­شود که توجه گردد که مقاومت آنتی‌بیوتیکی در میان باکتری­های ذکر شده هم رو به گسترش می­باشد (طباطبائی و فیروزی1380). 

   فعالیت ضدباکتریائی بره­موم در مورد برخی از باکتری­های بیماری­زا نظیر استرپتوکوکوسسیرکوئیتس،  استرپتوکوکوسپیوژنز،استرپتوکوکوس موتانس، استرپتوکوکوسسوربینوس، استافیلوکوکوسآرئوس و سالمونلاها، هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در شرایط بالینی، به­خوبی توصیف شده است. در واقع پژوهش­ها در این زمینه نشان داده که فعالیت چند­گانه بره­موم باعث می­شود که گلیکان سنتز­شده توسط باکتری­های مذکور نامحلول شده و در نتیجه فعالیت آنزیم گلیکوزیل ترانسفراز که آنزیم مؤثر در انتقال گلوکز و رشد و تکثیر باکتری­ها می­باشد، متوقف شود (Orsi et al., 2005; Velazquez et al., 2007; Seidel et al., 2008; Chena et al., 2009؛ رضویان و همکاران 1391). البته مکانیزم عمل ضد­باکتریایی بره­موم پیچیده بوده و ظاهراً به نظر می­رسد که شباهتی با عملکرد اکثر آنتی بوتیک­های کلاسیک ندارد، اما با توجه به اینکه بره­موم از تقسیم باکتری­ها ممانعت می‌کند، لذا می­توان به این نکته اشاره کرد که احتمالاً از این نظر مانند آنتی­بیوتیک نالیدیکسیک اسید عمل می‌کند چرا که آنتی بیوتیک مذکور­هم از همانند­سازی DNA و در ­نتیجه تقسیم سلولی ممانعت به­عمل می‌آورد. همچنین بعضی از محققین معتقدند که بره­موم می‌تواند مانع از فعالیت RNA پلی­مراز وابسته بهDNA  میکروارگانیسم­ها شده و همچنین فعالیت آنزیم­های محدود­الاثر آ­نها را مهار کند. از سوی دیگر معتقدند که بره­موم از سنتز پروتئین باکتری­ها هم ممانعت به عمل آورده و باعث ایجاد تغییر در ماهیت ساختمان غشای سیتوپلاسمی و دیواره سلولی شده و در نهایت باعث لیز نسبی باکتری­ها می­گردد. از طرف دیگر نشان داده­اند که بره­موم باعث تخریب باکتری اسپورزای عامل بیماری لوک آمریکائی زنبور عسل شده و نیز مانع از تشکیل مجدد اسپور و رشد آن در محیط کشت می­گردد که این یافته نشان­دهنده وجود موادی در بره­موم با تأثیر روی اسپور باکتری­ها و از بین بردن آن­ها در محیط­های زنده می­باشد (مرادی ، 1388).

با توجه به مطالب بالا و  نظر بر این­که بررسی مشخصی در خصوص تاثیر عصاره الکلی بره­موم بر باکتری­های ایجاد کننده ورم پستان گاوها در ایران انجام نگرفته است، لذا تحقیق حاضر با هدف بررسی میزان تاثیر ماده مذکور بر تعدادی از جدایه­های مربوط به اورام پستان­ گاوی و نیز احتمال جایگزینی موفقیت­آمیز این ماده به­جای آنتی بیوتیک­های مورد استفاده در درمان این مشکل و معضل اکثر گاوداری­های کشور، انجام گردید.

 

مواد و روش‌ها

   به منظور تهیه عصاره الکلی بره­موم، ابتدا مقدار 90 گرم بره­موم تازه تهیه­شده از کندو­های عسل منطقه شهرستان سراب واقع در شرق استان آذربایجان­شرقی به قطعات ریزتری تبدیل و سپس به آن 400 میلی­لیتر اتانول 96 درجه اضافه گردید و به مدت 18 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا در اتانول حل شود. البته برای تسریع در حل شدن بره­موم، چندین بار مخلوط حاصله تکان داده ­شد تا عمل انحلال به خوبی و به­سرعت انجام گیرد. بعد از حل­شدن بره­موم، مخلوط مذکور به مدت 15 دقیقه در دمای 20 درجه سلسیوس در سرعت 7000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. در ادامه محلول رویی به­دست آمده از عمل سانتریفیوژ در لوله آزمایش جمع­آوری شده و از کاغذ صافی واتمن شماره یک گذرانده ­شد تا عصاره خالص بره­موم به­دست آید. سپس رسوبات باقی­مانده مجدداً با 100 میلی­لیتر اتانول 96 درجه عصاره­گیری شد و مراحل قبل مجدداً تکرار ­گردید. به این­ترتیب عصاره غلیظ بره­موم تهیه گردید. لازم به­ذکر است که جهت حذف اتانول، سوسپانسیون مذکور به مدت 15 دقیقه در دستگاه تبخیر چرخشی در دمای کمتر از 50 درجه سانتی­گراد تکان داده می­شد (مرادی، 1388؛Najafi et al., 2007).

   در این مطالعه از 6 جدایه گرم مثبت و گرم منفی مربوط به ورم پستان گاوها شامل استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه، استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه، اشریشیا کولای،  کلبسیلا نومونیا و انتروباکتر آئروژنز که قبلاً در آزمایشگاه میکروب­شناسی گروه پاتوبیولوژی دانشکده دامپزشکی دانشگاه آزاد اسلامی واحد تبریز از شیرهای آلوده ارجاعی مربوط به تعدادی از گاوداری­های منطقه تبریز جدا­شده و بر­ اساس روش­های بیوشیمیائی و بیولوژیکی استاندارد میکروب­شناسی تشخیصی، تعیین هویت شده­ بودند، استفاده گردید (طباطبائی و فیروزی1380). البته با توجه به­ این­که برای تهیه سوسپانسیون میکروبی نیاز به کشت 24­ساعته از هر باکتری بود، بنابراین 24­ساعت قبل از انجام هر آزمایش، مقداری از کشت ذخیره هر کدام از جدایه­های مورد آزمایش را به­طور جداگانه به محیط کشت BHI agar تلقیح و به مدت 24­ ساعت در دمای 37­ درجه سلسیوس­ گرم­خانه­گذاری می­گردید. سپس کلونی­های خالص ایجاد شده مربوط به هر جدایه در سطح محیط کشت مذکور جداگانه با محلول نرمال سالین شسته­شده و سوسپانسیون میکروبی به‌دست آمده دوباره با محلول مذکور تا حدی رقیق می­گردید تا کدورت ایجاد­شده در لوله حاوی سوسپانسیون میکروبی هر یک از جدایه­ها، معادل کدورت لوله استاندارد 5/0 مک‌فارلند تنظیم گردد. یعنی سوسپانسیون میکروبی همه جدایه­های مورد استفاده در آزمایش­های مختلف انجام گرفته، حاوی CFU/ml10⁸´5/1 از جدایه­های مورد آزمایش بودند (Babayi et al., 2004).

   به­منظور بررسی اثرات ضد­باکتریایی عصاره الکلی بره­موم مورد آزمایش ابتدا از روش انتشار در آگار  (Disk Agar Diffusion) استفاده شد. لازم به توضیح است که بدین­منظور از دیسک­های بلانک استریل ساخت شرکت پادتن طب (تهران- ایران) استفاده گردید. به­ این­ ترتیب که دیسک­های بلانک در لوله­های حاوی عصاره مذکور قرار داده شد و بعد از مدت30 تا 50 دقیقه و پس از جذب­شدن کامل آن­ها توسط دیسک­، دیسک­های مذکور در دمای حدود 45 درجة سانتی­گراد قرار داده می­شد تا کاملاً خشک شوند. سپس در مورد همه جدایه­های مورد آزمایش به­طور جداگانه، با استفاده از 100میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی که مطابق استاندارد لوله 5/0 مک فارلند تهیه شده بود، بر سطح محیط مولرهینتون آگار جداگانه کشت یکنواخت انجام و سپس دیسک­گذاری می­شد. درادامه پلیت­ها به مدت  24  الی 48 ساعت در دمای 37 درجة سلسیوس انکوبه­شده و نتایج اثر ضدباکتریایی عصاره مورد آزمایش به­طور جداگانه و با اندازه­گیری قطر هاله عدم رشد اطراف دیسک­های مذکور با استفاده از خط­کش میلی­متری ثبت می­شد. لازم به ذکر است که برای حصول اطمینان بیشتر، این آزمایش برای هر یک از جدایه­های مورد آزمایش جداگانه سه بار تکرار شده و سپس میانگین محاسبه­شده به عنوان قطر نهایی منطقه عدم رشد آن جدایه ثبت می­شد. در آزمایش مذکور از آنتی­بیوتیک­های استاندارد تتراسایکلین (30 میکروگرم بر دیسک) به­عنوان کنترل جدایه­های گرم منفی و آمیکاسین (30 میکروگرم بر دیسک) به عنوان کنترل جدایه­های گرم مثبت استفاده می­گردید (Anzabi and  Khaki, 2015). در ادامه با استفاده از روش رقت لوله‌ای حداقل غلظت ممانعت از رشد (MIC) و حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) عصاره مورد آزمایش به­طور جداگانه تعیین گردید. برای تعیین MIC عصاره، از یک سری 10تایی از لوله­های آزمایش استفاده می­شد، به این صورت که 8 لوله برای آزمایش روی رقت­های مختلف عصاره و یک لوله به عنوان کنترل مثبت و یک لوله هم به عنوان کنترل منفی به­کار رفت. روش کار به این صورت بود که لوله شماره 1حاوی mg/ml 1 از عصاره بود و سپس رقت­های سریال تهیه می­شد تا اینکه لوله شماره 8 دارای mcg/ml 8/7 از ترکیب مذکور می­شد. همچنین همه لوله­ها حاوی  ml9 از محیط کشت broth  BHIو ml 1 از سوسپانسیون میکروبی مربوط به هر یک از جدایه­های مورد آزمایش هم بودند. لازم به ذکر است که در هر سری از آزمایشات مذکور هم­زمان یک لوله حاوی ml 9 از محیط کشت یادشده به علاوه  ml1 از عصاره به عنوان کنترل عصاره و نیز یک لوله حاوی ml 9 از همان محیط کشت به علاوه ml  1 از سوسپانسیون میکروبی هم به عنوان کنترل جدایه، استفاده می­شد. در ادامه همه لوله­های آزمایش ذکر­شده در بالا به مدت 24ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس انکوبه می­شد. پس از طی زمان انکوباسیون، همه لوله­ها از نظر کدورت ناشی از رشد باکتری­های مورد آزمایش بررسی می­گردید (برای افزایش دقت کار این آزمایش برای هر یک از جدایه­ها به­طور جداگانه 3 بار تکرار می­شد). در نهایت، بالاترین رقتی از عصاره مورد آزمایش که از افزایش کدورت ناشی از رشد جدایه مورد آزمایش ممانعت کرده بود، به عنوان MIC عصاره الکلی بره­موم نسبت به آن جدایه در نظر گرفته ­می­شد. همچنین در ادامه، از لوله­هائی که در آزمایش تعیین MIC در آن­ها عدم رشد باکتری مشاهـــده میگردید، نمونــه­برداری کرده و جهت تعیین MBC عصاره مورد آزمایش، جداگانه به روش پورپلیت (Pour-plate) کشت داده می­شد. بدین منظور ml 1 از محتویات لوله­های مربوط به آزمایش MIC  هر جدایه که در آن لوله­ها رشد باکتری متوقف شده و اصطلاحاً عدم رشد باکتری مشاهده گردیده بود، برداشت کرده و با ml 20 از محیط کشت agar BHIبه صورت مخلوط کردن، کشت داده و سپس همه پلیت­ها به مـــدت 24ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری شده و از نظر رشد باکتری و ایجاد کلنی مورد ارزیابی قرار می‌گرفت. در نهایت بالاترین رقتی که در واقع حاوی کمترین غلظت عصاره مورد آزمایش بود و در پلیت مربوط به آن رقت هیچ کلنی از باکتری­های مورد نظر مشاهده نمی­گردید، به­عنوان MBC عصاره بره­موم در مورد آن جدایه در نظر گرفته می­شد (Anzabi and  Khaki, 2015).

   برای تحلیل آماری ارتباط بین حساسیت آنتی‌بیوتیکی جدایه­ها نسبت به نوع ترکیب با خاصیت ضدباکتریائی (آنتی‌بیوتیک­های استاندارد استفاده شده و عصاره بره­موم) از آزمون­ آماری تی مستقل تحت برنامه آماری Spss 18 جهت مقایسه داده‌ها استفاده شد. تفاوت‌های مشاهده شده در میزان  MICو   MBCهر یک از جدایه­ها، از آمار توصیفی استفاده گردید. مقادیر 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد.

 

یافته‌ها

   نتایج حاصله از بررسی اثرات ضد­باکتریایی عصاره الکلی بره­موم و آنتی­بیوتیک­های استاندارد تتراسایکلین و آمیکاسین با استفاده از آزمایش حساسیت آنتی­بیوتیکی به روش انتشار دیسک در آگار و همچنین نتایج مربوط به آزمایشات بررسی اثرات ممانعت از رشد و باکتری­کشی عصاره بره­موم بر جدایه­های مورد آزمایش که به­طور جداگانه انجام گرفته است، در جداول 1، 2 و 3 نشان داده شده است.

 

 

       

 

 

 

 

 

جدول 1- میانگین قطر منطقه عدم رشد جدایه­ها بر حسب میلی­متر در آزمایش حساسیت آنتی­بیوتیکی (mean ±SD)

جدایه­های مورد آزمایش	آنتی­بیوتیک آمیکاسین (30 میکروگرم در دیسک)	آنتی­بیوتیک  تتراسایکلین (30 میکروگرم در دیسک)	عصاره الکلی بره­موم (30 میکرولیتر در دیسک)
اشریشیا کولای	(---)	b2/0±13	a2/0±23
کلبسیلا نومونیا	(---)	b2/0±12	a2/0± 26
انتروباکتر آئروژنز	(---)	2/0±16	2/0±18
استافیلوکوکوس آرئوس	2/0±11	(---)	2/0±17
استرپتوکوکوس آگالاکتیه	2/0±15	(---)	2/0±22
استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه	2/0±13	(---)	2/0±16

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                حروف غیرمشابه (a,b) در هر ردیف نشانگر اختلاف معنی­دار می­باشد (05/0p<).

               علامت (---) نشان­دهنده عدم استفاده از آنتی بیوتیک مذکور در مورد جدایه آن ردیف می باشد.

 

 

جدول 2- نتایج آزمایشات تعیین (MIC) عصاره الکلی بره موم در مورد هریک از جدایه­ها

	رقت­های مختلف استفاده شده از عصاره الکلی بره­موم (µg/ml)
جدایه­های مورد آزمایش	8/7	625/15	25/31	5/62	125	250	500	1000
اشریشیا کولای	+	+	+	+	-	-	-	-
کلبسیلا نومونیا	+	+	+	+	+	-	-	-
انتروباکتر آئروژنز	+	+	+	+	-	-	-	-
استافیلوکوکوس آرئوس	+	+	+	+	+	+	-	-
استرپتوکوکوس آگالاکتیه	+	+	+	+	-	-	-	-
استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه	+	+	+	+	+	-	-	-

 

 

جدول 3- نتایج آزمایشات تعیین حداقل غلظت باکتری­کشی (MBC) غلظت­های مختلف عصاره الکلی بره­موم

	رقت­های مختلف استفاده شده از عصاره الکلی بره­ موم (µg/ml)
جدایه­های مورد آزمایش	8/7	625/15	25/31	5/62	125	250	500	1000
اشریشیا کولای	+	+	+	+	+	-	-	-
کلبسیلا نومونیا	+	+	+	+	+	+	-	-
انتروباکتر آئروژنز	+	+	+	+	+	-	-	-
استافیلوکوکوس آرئوس	+	+	+	+	+	+	+	-
استرپتوکوکوس آگالاکتیه	+	+	+	+	+	-	-	-
استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه	+	+	+	+	+	+	-	-

بحث و نتیجه­گیری

   در مطالعه حاضر بررسی حساسیت آنتی­بیوتیکی به‌ روش انتشار در آگار نشان داد، علاوه بر این­که بره­موم استفاده شده به­عنوان یک ترکیب طبیعی با منشأ گیاهی قدرت انتشار خوبی در سطح محیط کشت جامد دارد، بلکه قطر منطقه عدم رشد ایجاد شده توسط این ترکیب در مورد همه جدایه­ها به مراتب بزرگتر از قطر ایجاد شده توسط آنتی­بیوتیک­های استاندارد مورد آزمایش یعنی تتراسیکلین و آمیکاسین می­باشد به­طوری­که، با توجه به جدول 1 تاثیر ضد­باکتریائی 30 میکرولیتر از عصاره الکلی بره­موم بر همه جدایه­های مورد آزمایش به­طور نسبی بیشتر از تاثیر 30 میکرولیتر از آنتی‌بیوتیک­های استاندارد تتراسیکلین و آمیکاسین بوده است. در واقع مشخص گردید که عصاره اتانولی بره­موم فعالیت ضدباکتریایی به مراتب بهتری در مقایسه با آنتی­بیوتیک­های مذکور دارد، ­طوری­که از نظر خاصیت ضد باکتریائی، بین آنتی­بیوتیک­های استاندارد استفاده شده (آمیکاسین و تتراسایکلین) و عصاره الکلی بره موم از یک طرف و مقاومت یا حساسیت جدایه‌های مورد آزمایش نسبت به ترکیبات مذکور از طرف دیگر، اختلاف مشخص وجود دارد که این تفاوت در مورد 2 جدایه گرم منفی مهم مورد آزمایش یعنی اشریشیا کولای و کلبسیلا نومونیا معنی­دار می­باشد. این یافته­ها هم‌سو با نتایج مطالعه موهان­نیر و همکاران وی در سال 2005 در مورد اثر ضد ­لیستریایی گیاه سیاه دانه در محیط کشت می­باشد، چرا که در آن تحقیق هم مشخص گردیده که عصاره­های مختلف گیاه مذکور عملکرد بهتری علیه باکتری لیستریا داشتند و در واقع اثر ضد ­لیستریائی گیاه سیاه دانه بسیار بیشتر از آنتی­بیوتیک جنتامایسین بوده است (Mohan Nair et al., 2005). البته از طرف دیگر در پژوهشی هم مشاهده شده است که آنتی­بیوتیک­های تتراسایکلین و تایلوزین دارای اثرات ضد­باکتریائی به مراتب قوی­تری نسبت به بره­موم در مورد باکتری Paenibacillus larvae   بوده­اند (Alippi et al., 2005). این درحالی است ­که، در بررسی حاضر آنتی­بیوتیک تتراسایکین (30 میکروگرم در دیسک) بر همه جدایه­های گرم منفی مورد آزمایش اثر ضدباکتریائی کمتری در مقایسه با اثر عصاره الکلی بره­موم (30 میکرولیتر در دیسک) نشان داد. به­نظر می‌رسد که عدم هم­خوانی در نتایج مشاهده شده در مطالعات مشابه در خصوص مقایسه قدرت ضدباکتریائی عصاره بره­موم نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های مختلف رایج، احتمالاً به نوع آنتی­بیوتیک­های مورد آزمایش و نیز مقادیر استفاده شده از ماده موثره آنها و نیز نوع باکتری مورد آزمایش هم ارتباط داشته باشد. در مطالعه کوجومگیف و همکاران در سال 1999 ویژگی ضد­باکتریایی بره­موم علیه استافیلوکوکوس آرئوس و اشریشیاکولای بررسی شد که نتایج‌شان نشان‌دهنده تاثیر مناسب بره­موم بر باکتری­های مذکور بوده که این یافته با نتایج بررسی حاضر کاملاً هم‌خوانی دارد. حتی ایشان اثبات کردند که کاربرد هم‌زمان بره­موم با برخی از آنتی­بیوتیک­ها اثر آن­ها را چندین برابر افزایش داده و در واقع از نظر خاصیت ضد­باکتریائی، بره­موم با آنتی­بیوتیک­های مورد آزمایش آن­ها اثر هم­افزائی نیز داشته است (Kujumgiev et al., 1999).

   در مطالعه ما نتایج حاصل از آزمایش­های MIC و MBC به­روش رقت لوله­ای نشان داده است که میزان مهار رشد جدایه­های مورد آزمایش توسط بره­موم با مقدار آن در رقت‌های استفاده شده رابطه مستقیم دارد، به­طوری­که با افزایش میزان بره­موم در هر رقت، از رشد جدایه­ها ممانعت به­عمل آمده و در نهایت در رقتی که نشان­دهنده MBC عصاره بره­موم در مورد هریک از جدایه­ها بود، رشد باکتریائی متوقف شده و در واقع هیچ کلنی هم تشکیل نشد. نتایج ثبت شده نشان می‌دهد که حداقل غلظت مهار­کنندگی عصاره الکلی بره‌موم برای جدایه­های گرم منفی یعنی اشریشیاکولای­، کلبسیلا نومونیا و انتروباکتر آئروژنز در مطالعه حاضر به ترتیب 125، 250 و 125 میکروگرم بر میلی­لیتر و همچنین حداقل غلظت باکتری­کشی این عصاره برای جدایه­های مذکور نیز به ترتیب برابر با 250، 500 و 250 میکروگرم بر میلی­لیتر بود. این در حالی­ است که حداقل غلظت مهارکنندگی عصاره مذکور برای جدایه‌های گرم مثبت مورد آزمایش یعنی استافیلوکوکوس آرئوس، استرپتوکوکوس آگالاکتیه و استرپتوکوکوس دیسگالاکتیه به ترتیب 500، 125 و250 میکروگرم بر میلی­لیتر ثبت شده است. همچنین حداقل غلظت باکتری­کشی این عصاره برای جدایه­های مذکور نیز به‌ترتیب برابر با 1000­، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. در واقع به­طور کلی، نتایج حاصل از آزمایشات مربوط به تعیین MIC وMBC  عصاره بره‌موم هم در بررسی حاضر نشان داد که این عصاره بر همه جدایه­های مورد آزمایش دارای اثر ممانعت­ از رشد و باکتری­کشی نسبتاً خوبی می­باشد. البته همان‌طور که نتایج جدول 1 هم مشخص می‌کند، علی‌الخصوص این خواص در مورد جدایه­های گرم منفی به مراتب بیشتر و موثرتر بوده است. این در حالی­ است که بررسی­های مختلف نشان داده است که بره­موم بر باکتری­های گرم مثبت موثرتر از باکتری­های گرم منفی می­باشد که این تفاوت در تأثیر را غالباً ناشی از متفاوت بودن ساختمان دیواره سلولی باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی اعلام کرده‌اند (مرادی، 1388). در توجیه این عدم هم­خوانی می­توان به این نکته اشاره کرد که حساسیت باکتری­های گرم منفی در مقابل ترکیبات ضد میکروبی در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت کمتر است. این خود به دلیل نوع ترکیبات موجود در دیواره سلولی این دسته از باکتری‌ها می‌باشد، که فقط دارای لایه نازکی از موکوپپتید بوده و قسمت اعظم ساختار دیواره سلولی آنها را لایه خارجی (outer membrane) تشکیل می‌دهد که عمدتاً از جنس لیپوپلی­ساکارید می­باشد این در حالی است ­که باکتری­های گرم مثبت در دیواره سلولی خود دارای مقدار زیادی ترکیب پیچیده و نسبتاً مقاوم موکوپپتیدی هستند و به همین علت در مقابل مواد ضد­باکتریایی مقاوم­تر هستند (Schaechter et al., 1989).

   از طرف دیگر با مقایسه نتایج بررسی حاضر با یافته­های مطالعات مشابه، شاهد برخی تشابهات و اختلافات دیگری هم هستیم به طوری­که،  برومفیت وهمکارانش در سال 1990 با بررسی اثرات ضد­باکتریایی بره­موم روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس قطر منطقه ممانعت از رشد را در آزمایش آنتی­بیوگرام 14 میلی­متر به­دست آورده­اند (Brumfitt et al., 1990). در حالی­که، نتایج ثبت شده در جدول 1 مطالعه حاضر این مقدار را در مورد جدایه­های استافیلوکوکوس آرئوس حدود 17 میلی­متر نشان می­دهد. همچنین طی مطالعه­ای، ولازگوئز و همکارانش در سال 2007 مقدار MIC عصاره اتانولی بره­موم را روی باکتری استافیلوکوکوس آرئوس 1/0 میلی­گرم در میلی­لیتر به­دست آورده­اند (Velazquez et al., 2007). همچنین در یک بررسی در سال 1985 مشخص شده است که بره­موم بر 209 سویه استافیلوکوکوس آرئوس موثر بوده و MIC آن در حد 1 میلی­گرم در میلی­لیتر و MBC آن نیز 12 میلی‌گرم در میلی­لیتر بوده است (Meresta and Meresta, 1988). این در حالی است کهMIC عصاره اتانولی بره­موم در مطالعه ما، در خصوص جدایه­های استافیلوکوکوس آرئوس، معادل 500 میکروگرم در میلی­لیتر و MBC مربوطه هم معادل 1000 میکروگرم در میلی­لیتر بوده است. در توجیه این عدم هم­خوانی­ها، می­توان به نوع ترکیبات موجود در عصاره که در مناطق مختلف می­تواند متفاوت باشد، اشاره کرد. در این خصوص اعلام شده است که منبع گیاهی و فصل تولید بره­موم و نیز نوع حلال استفاده شده در عمل عصاره‌گیری بر اثرات ضد­باکتریائی بره­موم تأثیر چشم‌گیری دارد و حلال­های آلی ترکیبات بیشتری از بره موم را آزاد کرده و لذا اثرات ضد­باکتریائی بیشتری حاصل می­شود (مرادی، 1388). در تأیید این موضوع حتی برخی از محققین اعلام نموده­اند که مقایسه نتایج مشاهده شده در مورد خواص ضد­باکتریائی ترکیبات گیاهی مختلف بسیار دشوار می­باشد که از دلایل این موضوع به تفاوت در روش­های مختلف آزمایشگاهی به هنگام بررسی خواص ضد باکتریائی عصاره­ها، نوع ترکیبات گیاهی و منابع تهیه آن­ها، مرحله رشد گیاه و نیز سویه­های باکتریائی مورد آزمایش­، اشاره نموده­اند. از طرف دیگر، در برخی از مطالعات انجام گرفته در گذشته، اعلام شده است که عصاره­های الکلی و اتری و نیز دیگر حلال­های آلی تاثیر مشخصی بر خواص ضد­باکتریائی داشته است. بنابر­این، از جمله دلایل مشاهده اختلاف چشمگیر در اثرات ضدباکتریائی بره­موم روی برخی از جدایه­های مورد آزمایش در مطالعه حاضر را می­توان به نوع مواد موثره موجود در عصاره و همچنین روش عصاره گیری و نیز نوع حلال  مرتبط دانست (Singh et al., 2003; Moreno et al., 2006). مخصوصاً این مطلب زمانی اهمیت بیشتری پیدا می­کند که بدانیم ساختار و ترکیبات موجود در بره­موم یک منطقه با منطقه دیگر متفاوت است وحتی بره­موم تولید شده در فصول مختلف یک منطقه نیز با فصول دیگر تفاوت دارد (Sforcin and Bankova,2011). البته لازم به­ ذکر است که در مطالعات متعددی گزارش نموده­اند که عصاره الکلی بره­موم اثرات ضدباکتریائی به مراتب بهتری دارد، که علت آن را آزاد شدن و تخلیص بهتر فلاونوئیدها که در واقع  مهمترین جز فعال بره­موم می­باشد، اعلام کرده اند (Viuda Martos et al., 2008) و حتی در این ارتباط نشان داده شده است که عصاره اتانولی بره­موم دارای ویژگی­های متعددی از جمله خواص ضد­باکتریایی، ضد­ویروسی، ضد­التهابی بوده و حتی محرک سیستم ایمنی هم می‌باشد (Kim et al., 2005).

   نتایج مطالعه ما نشان داد که بره­موم مورد آزمایش که از کندوهای زنبور­عسل منطقه سراب استان آذربایجان‌شرقی تهیه شده بود­، دارای اثرات ضدباکتریائی خوبی بر همه جدایه­ها بوده و از طرف دیگر نتایج آزمایشات حساسیت آنتی­بیوتیکی انجام گرفته هم نشان داد که قطر منطقه عدم رشدی که توسط آنتی­بیوتیک­های استاندارد در قبال اکثر جدایه­های مذکور ایجاد شده بود، به مراتب کوچکتر از قطر منطقه عدم رشد ایجاد شده توسط عصاره اتانولی بره­موم بود. اهمیت این موضوع زمانی بیشتر مشخص می­شود که بدانیم ترکیبات طبیعی انواع گیاهان بومی موجود در بیشتر مناطق جغرافیائی کشور پهناور ایران (مخصوصاً در منطقه استان آذربایجان­شرقی)، غالباً عوارض جانبی احتمالی آنتی‌بیوتیک­های ساختگی دست بشر را نداشته و همچنین از نظر اقتصادی هزینه به مراتب کمتری را به مصرف‌کنندگان تحمیل می­کند. از طرف دیگر بسیاری از ترکیبات طبیعی معمولاً اثرات مفید دیگری نظیر خاصیت آنتی­اکسیدانی و تقویت­کننده سیستم ایمنی را، علاوه بر خواص ضد­میکروبی، دارا هستند. ضمن اینکه بره­موم ماده­ای ایمن و در عین حال غیرسمی بوده که از جمله خواص  جالب آن اثرات ضدباکتریائی در مقابل  باکتری‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک­های رایج می­باشد (مرادی ، 1388).

   در نهایت، نتایج مطالعه حاضر نشان داد که استفاده از بره­موم می­تواند به عنوان جایگزینی مناسب برای آنتی‌بیوتیک‌های صناعی جهت مقابله با جدایه­های مورد آزمایش مخصوصاً انواع گرم منفی در نظر گرفته شود. البته، در این خصوص مطالعات بیشتری نیاز است تا بتوان اثرات ضد باکتریائی بره­موم و ترکیبات آن را دقیق­تر بررسی کرد. به­نظر می­رسد استفاده از سایر روش­های عصاره­گیری و یا استفاده از غلظت­های دیگری به غیر از غلظت­های به­کار برده شده در این بررسی و نیز مطالعه روی حیوانات آزمایشگاهی مناسب، می­تواند اثرات ضد باکتریائی بره­موم را بیشتر از این روشن نماید. همچنین با توجه به ویژگی‌های بسیار مفید ثابت شده در مورد بره­موم از یک­طرف و نتایج ضدباکتریائی نسبتاً مناسب به­دست آمده در مورد این ترکیب در مطالعه حاضر و اکثر پژوهش­های مشابه، به­نظر می­رسد که این ماده و ترکیبات مختلف آن می­توانند جایگاه ویژه­ای را جهت استفاده در علوم پزشکی و دامپزشکی داشته باشند.

مراجع

طباطبائی، ع.ح. و فیروزی، ر. (1380). بیماری­های باکتریائی دام. انتشارات دانشگاه تهران، صفحات: 24-20، 43-37 و 227-223.

• • خادم حقیقیان، ح.، علی­عسگرزاده ، ا. و کوشان، ی. (1390). گزارش یک مورد درمان زخم پای دیابتی با استفاده از بره­موم حرارت­دیده در داخل روغن زیتون. فصلنامه دانش و تندرستی دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی شاهرود، دوره 6، شماره 4، صفحات: 38-35.

• رضویان، ح.، خزاعی، ص.، کاظمی، ش. و سیدی، س.م. (1391). بره­موم زنبور­عسل و کاربرد آن برای سلامت دهان و دندان. مجله دانشکده دندان پزشکی اصفهان، دوره 8، شماره 5، صفحات: 11-1.

• سیدی، س.م و فرشینه عدل، م.ب. (1389). بره­موم­: داروئی طبیعی از کندوی زنبور­عسل­. ترجمه نشر نصوح اصفهان، ایران، چاپ سوم، صفحات: 148-107.

• مرادی، م. (1388). بررسی اثر ضد­باکتریائی بره­موم زنبورعسل روی باکتری Paenibacillus larvae عامل بیماری لوک آمریکائی زنبور­عسل. نشریه دامپزشکی (پژوهش و سازندگی)، شماره 83، صفحات: 62-57.

• هاتفی، م.،  محرابیان، ص.، نوحی، ا. و رفیعی طباطبایی، ر. (1387 ). بررسی خواص ضد جهش­زایی عصاره الکلی بره­موم به وسیله سالمونلا تیفی­موریوم و میکروزوم. مجله علمی پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اراک، سال 11، شماره 2، صفحات: 110-102.

• Alippi, A.M., Albo, G.N., Reynaldi, F.J. and De Giusti, M.R. (2005). In vitro and in vivo susceptibility of the honeybee bacterial pathogen Paenibacillus larvae subsp. Larvae to the antibiotic Tylosin. Veterinary Microbiology, 109(12): 47-55.

 •Almas, K., Mahmoud, A. and Dahlan, A. (2001). A comparative study of propolis and saline application on human dentin. A SEM study. Indian Journal of Dental Research, 12(1): 21-27.

• Anzabi, Y. and Khaki, A. (2015). Antibacterial Effects of the Essential Oils and Ethanol Extracts of the Native Plants; Ziziphora Clinopodioides on 3 Species of Urinary Tract Isolated Bacteria in Rats’ Experimental Model. Medical Journal of Tabriz University of Medical Sciences and Health Services, 37(3): 18-25.

 •Babayi, L., Kolo, J.I. and Ijah, U.J. (2004). The antimicrobial activities of methanolic extracts of Eucalyptus camaldulensis and Terminalia catappa against some pathogenic microorganisms. Biochemistry, 16(2): 106-110.

 •Banskota, A.H., Tezuka, Y.T. and Kadota, S. (2001) Recent-progress-in pharmacological research of propolis. Phytotherapy Research, 15(7): 561-571.

•Borrelli, F., Maffia, P., Pinto, L., Ianaro, A., Russo, A. and Capasso, F. (2002). Phytochemical compounds involved in the anti-inflammatory effect of propolis extract. Fitoterapia, 73(Suppl 1): S53-S63.

 •Brumfitt, W., Hamilton Miller, J.M. and Franklin, I. (1990). Antibiotic activity of natural products: propolis. Microbios, 62(250): 19- 22.

 •Chena, Ch.R., Shena, C.T., Wu, J.J., Yangb, H.L., Hsu, S.L. and Chang, C.M.J. (2009). Precipitation of sub-micron particles of 3, 5-diprenyl- 4hydroxycinnamic acid in Brazilian propolis from supercritical carbon dioxide anti-solvent solutions. The Journal of Supercritical Fluids, 50(2): 176-182.

• Isla, M.I. ( 2005). Study on propolis quality from Argentina. Biocell, 29(1): 60.

• Najafi, M.F., Vhedi, F., Seyyedin, M., Jomehzadeh, H.R. and Bozary, K. (2007). Effect of the water extracts of propolis on stimulation and inhibition of different celss. Cytotechnology, 54: 49-56.

•Marcucci, M.C. (1995). Propolis: Chemical composition, biological propertis and therapeutic activity. Apidologie, 26: 83-99.

• Meresta, T. and Meresta, L. (1988). Sensivity of Bacillus larvae to propolis extract in vitro. Medycyna Veterynaryina, 44(3): 169-170.

• Park, Y.K.,  Koo, M.H.,  Abreu,  J.A.,  Ikegaki, M., Cury, J.A. and Rosalen, P.L. (1998). Antimicrobal Activity of propolis on oral microorganisms. Current Microbiology, 3(1): 24-28.

• Mohan Nair, M.K., Vasudevan, P. and Venkitanarayanan, K. (2005). Antibacterial effect of black seed oils on Listeria monocytogenes. Journal of Food Control, 16(5): 395-398.

 •Kim, K.T., Yeo, E.J., Han, Y.S., Nah, S.Y. and Paik, H.D. (2005). Antimicrobial, anti-inflammatory, and anti-oxidative effect of water and ethanol-extracted Brazilian propolis. Food Science and Biotechnology, 14:474-478.

• Tosi, E.A., Re, E., Ortega, M.E. and Cazzoli, A.F. (2007). Food preservative based on propolis: bacteriostatic activity of propolis polyphenols and flavonoids up on Escherichia coli. Food Chemistry, 104(3): 1025-1029.

• Khalil, M.L. (2006). Biological activity of bee propolis in health and disease. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, 7(1): 22-31.

• Velazquez, C., Narvarro, M., Acosta, A., Angulo, A., Dominguez, Z., Robles, R., et al. (2007). Antibacterial and free-radical scavenging activities of sonoran propolis. Journal of Applied Microbiology, 103(5): 1747-1756.

• Park, Y.K., Alencar, S.M. and Aguiar, C.L.(2002). Botanical origin and chemical composition of Brazilian propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50(9): 2502-2506.

 •Seidel, V., Peyfoon, E., Watson, D.G. and Fearnley, J. (2008). Comparative study of the antibacterial activity of propolis from different geographical and climatic zones. Phytotherapy Research, 22(9): 1256-1263.

• Orsi, R., Sforcin, J., Rall, V., Funari, S., Barbosa, L. and Fernandes, J. (2005). Susceptibility profile of Salmonella against the antibacterial activity of propolis produced in two regions of Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases, 11(2): 109.

• Kujumgiev, A., Tsvetkova, I., Serkedjieva, Y., Bankova, V., Christov, R. and Popov, S. (1999). Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. Journal of Ethnopharmacology, 64(3): 235-240.

• Viuda Martos, M., Ruiz Navajas, Y., Fernandez Lopez, J. and Perez Alvarez, J.A. (2008). Functional properties of honey, propolis, and royal jelly. Journal of Food Science, 73(9): 117-124.

• Sforcin, J.M. and  Bankova, V. (2011). Propolis: is there a potential for the development of new drugs? Journal of Ethnopharmacology, 133(2): 253-260.

• Schaechter, M., Medoff, G. and Fchlessinger, D. (1989). Mechanisms of Microbial Disease. International Edition (Williams and Wilkins): 17-50.

 •Moreno, S., Scheyer, T., Romano, C.S. and Vojnov, A.A. (2006). Antioxidant and antimicrobial activities of rosemary extracts linked to their polyphenol composition. Free Radical Research, 40(2): 223-231.

• Singh, A., Singh, R.K., Bhunia, A.K. and Singh, N. (2003). Efficacy of plant essential oils as antimicrobial agents against Listeria monocytogenes in hotdogs. Food Science & Technology, 36(8):787-794.