تعیین جنسیت شترمرغ با استفاده از نشانگرهای ژنتیکی به روش PCR

آسیب‌شناسی درمانگاهی دامپزشکی

مقاله 8، دوره 3، 3 (11) پاییز، آذر 1388، صفحه 601-604   

نوع مقاله: مقاله علمی پژوهشی

نویسندگان

مصطفی فغانی^* ؛ عباس دوستی

مرکز تحقیقات بیوتکنولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، شهرکرد، ایران

چکیده

چکیده
پرورش شتر مرغ (Struthio camelus) از اهمیت روز افزونی در سطح جهان برخوردار است. همچنین، پرورش شترمرغ در ایران به طرز چشمگیری در حال افزایش است. در بسیاری از پرندگان، تمایز بین جنس­های نر و ماده، از روی شکل ظاهری به­خصوص در مورد پرندگان جوان بسیار مشکل است. هدف از این تحقیق، شناسایی و توسعه نشانگرهای ژنتیکی برای تعیین جنسیت شتر مرغ با استفاده از واکنش زنجیره­ای پلیمراز (PCR) می­باشد. در این بررسی، از نمونه­های خون و پر شترمرغ­های نر و ماده (20 قطعه) استخراج DNA صورت پذیرفت. برای انجام PCR از یک جفت پرایمر مخصوص شناسایی کرومزوم W بهره گرفته شد. نتایج نشان­دهنده یک قطعه 648 جفت بازی برای شترمرغ­های با جنسیت ماده بود و از طرفی پس از انجام آزمایش، هیچ باندی برای نرها مشاهده نشد. بنابراین، روش استفاده از مارکر­های مولکولی، روشی سریع، دقیق و ارزان برای تعیین جنسیت گله­های بزرگ شترمرغ می­باشد.

کلیدواژه‌ها

شترمرغ؛ تعیین جنسیت؛ نشانگرهای ژنتیکی

اصل مقاله

مقدمه

 

    پرورش شترمرغ در سال­های اخیر به­طور گسترده در دنیا و همچنین در کشور ما توسعه یافته است. علت این افزایش به دلیل قابلیت این حیوان برای تولید گوشت با چربی پائین، چرم مناسب، روغن با کیفیت بالا و حاوی اسیدهای چرب غیراشباع بالا و پرهای تزئینی می­باشد. پرورش این پرنده در نواحی گرم و خشک مانند آفریقا عمومی­تر است زیرا این پرنده به طور قابل ملاحظه­ای نسبت به گرما مقاوم بوده و نیاز به آب کمی دارد و مقاومت آن در مناطق سردسیر نیز قابل ملاحظه می­باشد (2). یکی از مشکلات اساسی در پرورش این پرنده این است که جنسیت جوجه­ها تا سن نزدیکی بلوغ یعنی در حدود 14 ماهگی مشخص نمی­باشد و بایستی از تکنیک­های تعیین جنسیت استفاده نمود. یک روش تعیین جنسیت مناسب باید دقیق، سریع و ارزان باشد. تکنیک­های مرسوم تعیین جنسیت در این دام دقت مناسبی ندارد. به عنوان مثال تکنیک مشاهده یا لمس کلواک، علاوه بر درصد اشتباه بالا ممکن است در دام نیز استرس زیادی ایجاد کند (2 و 6). در تکنیک مشاهده کاریوتیپ نیز مشکلاتی مانند جدا نشدن کرومزوم­های Z و W وجود دارد (5). امروزه از تکنیک­های مولکولی بر روی DNA در بسیاری از موجودات به­ویژه طیور برای تعیین جنسیت استفاده می­شود که از دقیق­ترین و سریع­ترین روش­های تعیین جنسیت می­باشد (1). در سال­های گذشته مطالعات مختلفی در رابطه با تعیین جنسیت در شترمرغ با استفاده از مارکرهای ژنتیکی ارائه شده است. در برخی از این مطالعات با کمک PCR و با استفاده از پرایمرهای تعیین جنسیت قطعاتی از DNA عمدتاً بر روی کرومزوم W در جنس ماده تکثیر شده و با کمک الکتروفورز بر روی ژل آگارز مورد شناسائی قرار می­گیرد (3). در بیشتر این مطالعات DNA مورد نیاز از خون استخراج گردیده است. در این مطالعه یک روش سریع، دقیق و ارزان تعیین جنسیت با کمک پرایمرهای تعیین جنسیت در جنس ماده شترمرغ و با استفاده از استخراج DNA از خون و پر ارائه شده است.

مواد و روش‌کار

     در این تحقیق ابتدا 20 قطعه شترمرغ شامل 7 نر، 7 ماده و 6 جوجه نابالغ انتخاب گردید و نمونه­های خون آنها در
لوله­های حاوی ماده ضد انعقاد (EDTA) جمع­آوری و به آزمایشگاه منتقل گردید. در آزمایشگاه با استفاده از کیت استخراج DNA (ساخت شرکت سیناژن ایران)، DNA از نمونه­های خون کامل استخراج گردید. کیفیت DNA استخراج شده با استفاده از الکتروفورز بر روی ژل آگارز 1 درصد مورد ارزیابی قرار گرفت.

سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی کروموزوم W مطابق سکانس تعیین شده از روی مقالات مرتبط به شرح ذیل تکثیر قطعه مورد نظر با دستگاه PCR صورت گرفت (4). توالی پرایمرها، پس از ارائه به شرکت سیناژن ایران، در حجم 500  میلی­لیتر با OD برابر 5، تهیه شد.

Primer F: 5'-TCTACACCTAAGGAGTCCCATATT-3'

Primer R: 5'GGTCTACACCTGTTGAAAATCATT-3'

 

غلظت بهینه مواد به کار رفته در واکنش PCR، در حجم کل 25 میکرولیتر به صورت 20 نانوگرم  DNA الگو، 2 میلی­مولار MgCl₂، 25 پیکومول از هر پرایمر، 1 واحد آنزیم Taq پلیمراز و 200 میکرومولار dNTP Mix تعیین گردید. همچنین 20 میکرولیتر روغن معدنی استریل برای جلوگیری از تبخیر شدن مخلوط PCR اضافه گردید. برای کنترل آزمایشات از شاهد منفی نیز استفاده شد که شامل مخلوط واکنشگرهای PCR به­جزء DNA هدف بود که به آن، هم­حجم DNA هدف، آب مقطر اضافه گردید.

برنامه دمائی واکنش PCR به ترتیب یک مرحله به صورت 95 درجه سانتی­گراد به مدت 5 دقیقه، 30 چرخه دمائی به ترتیب 94 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، 57 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه، 72 درجه سانتی­گراد به مدت 1 دقیقه و یک مرحله نهائی 72 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه تنظیم گردید. یک میکرولیتر از محصولات  PCR به همراه 2 میکرولیتر بافر بارگذاری (Loading Buffer) روی ژل آگارز 5/1 درصد دارای رنگ اتیدیوم بروماید برده شد و پس از مشاهده با نور ماورای بنفش (UV) عکس­برداری انجام گرفت.

پس از تنظیم روش استخراج DNA و تکنیک PCR و اطمینان گرفتن از نتایج صحیح در خصوص تعیین جنسیت، در مرحله بعد استخراج DNA از کالاموس پر، مدنظر قرار گرفت و پس از تهیه نمونه­های مورد نظر کلیه مراحل و روش­های کار مشابه مراحل فوق صورت پذیرفت. این مرحله از نظر سهولت کار در مزارع پرورشی و کاهش استرس نمونه­گیری به­خصوص با توجه به مشکل خون­گیری در پرنده­های کوچک از اهمیت بالائی برخوردار می­باشد. با توجه به تعداد نمونه آزمایش شده و با توجه به قانون توزیع دو جمله­ای دقت این روش در حدود 100 درصد می­باشد.

 

نتایج

     از نمونه­های خون، DNA  ژنومی با موفقیت استخراج گردید. انجام PCR با پرایمرهای اختصاصی تعیین جنسیت در شترمرغ و مشاهده روی ژل آگارز 5/1 درصد نشان­دهنده تکثیر یک قطعه DNA به طول 648 جفت باز برای جنس ماده بود. همین نتایج در نمونه­های DNA استخراج شده از کالاموس پر حاصل گردید که در نگاره 1 برخی موارد آورده شده است.  

 

 

نگاره 1- نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR که شماره­های 1 و 2 پرندگان ماده بالغ، شماره­های 3 و 4 پرندگان بالغ نر و شماره­های 5 و 6 پرندگان نابالغ بوده­اند که 5 ماده و 6 نر تشخیص داده شد. شماره 7 هم شاهد منفی می­باشد و مارکر مورد استفاده 1Kb است.

 

همان­طور که در تصویر نیز مشخص می­باشد، پس از الکتروفورز محصولات PCR در جنس ماده یک باند مشخص گردید که جنس نر فاقد این باند بود. این نتایج حاکی از وجه تمایز جنسیت نمونه­های مورد بررسی و وجود توالی ژن W در جنس ماده می­باشد. با توجه به تعداد نمونه آزمایش شده و با توجه به قانون توزیع دو جمله­ای دقت این روش در حدود 100 درصد می­باشد.

بحث و نتیجه‌گیری  

     در پرندگان  کروموزوم­های جنسی در جنس­های نر و ماده به ترتیب ZZ و ZW  می­باشند. یعنی در جنس ماده کروموزوم W وجود دارد که جنس نر فاقد این کروموزوم
می­باشد. اکثر روش­های تعیین جنسیت با استفاده از مارکرهای DNA در پرندگان نیز از مارکرهای متصل به کروموزوم W (W-linked marker) استفاده کرده­اند (3). شترمرغ نیز از این قاعده مستثنی نبوده و بنابراین مارکر شناسائی شده در این مطالعه یک مارکر متصل به کروموزوم W می­باشد.

از تکنیک­های مختلفی نیز برای شناسائی این مارکرها استفاده می­شود مانندRAPD ،PCR ، RFLP و غیره. تکنیک RAPD از جهاتی ارزان­تر و راحت­تر می­باشد، اما در این تکنیک از آغازگرهای کوتاه­تر استفاده می­شود و احتمال مشاهده باندهای اضافی وجود دارد و همچنین تکرار­پذیری پائینی دارد. بنابراین در این مطالعه از تکنیک PCR  استفاده شد که در نتیجه یک روش با دقت بالا و قابل استفاده در اکثر
آزمایشگاه­های مولکولی کشور طراحی گردید.

در این مطالعه همچنین جهت استخراج DNA از نمونه­های کالاموس پر نیز استفاده گردید، که این روش نیز کمک زیادی به سهولت نمونه­گیری و کاهش استرس دام هنگام نمونه­گیری می­نماید. نمونه­های DNA استخراج شده از پر نیز از کیفیت بالائی برخوردار بوده و به راحتی در آزمایشات قابل استفاده می­باشند. نتیجه حاصله از این مطالعه با نتایج تحقیقات Malago و همکاران (2002) در این رابطه تطابق داشت (4). بنابراین، استفاده از مارکرهای ژنتیکی به روش PCR یک روش سریع، دقیق و ارزان برای تعیین جنسیت در شترمرغ
می­باشد که می­توان از آن برای انجام دیگر تحقیقات در این دام مانند مقایسه عملکرد رشد جنس­های نر و ماده در سنین پروار یا انتخاب پرنده­های برتر اصلاح نژادی جهت جایگزینی در مزارع پرورشی به منظور تولید بیشتر استفاده­های فراوان نمود.

مراجع

1. Feridolfsson, A. and Ellegren, H. (1999): A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds. Journal of Avian Biology, 30: 116-121.
2. Hinckley, D., Park, R., Xiong, S., Andersen, W. and Kooyman, D. (2005): Identification and development of sex specific DNA markers in the Ostrich using polymerase chain reaction. International journal of Poultry Science, 4(9): 663-669.
3. Leon, H., Craig, M. and David, L. (2002): A DNA test to sex ratite birds. Molecular Ecology, 11: 851-856.
4. MalagΌ, W., Heito, R.M., Euclides, M., Adriana, M. and Flavio, H. (2002): Large scale sex typing of ostriches using DNA extracted from feathers. BMC Biotechnology, 2: 19.
5. Ogawa, A., Murata, K. and Mizuno, S. (1998): The location of Z and W-linked marker genes and sequence on the homomorphic sex chromosomes of the ostrich and the emu. Proceedings of the national academy of science of the USA, 95: 4415-4418.
6. Samour, J., Markham, J. and Neiva, O. (1984): Sexing ratite birds by cloacal examination. Veterinary Research, 5: 167-169.