بررسی ویژگی‌هایساختاری و توان آلرژی‌زایی دانه‌های گرده بلوط ایرانی (Quercus brantii L.)

زیست شناسی تکوینی

مقاله 6، دوره 8، شماره 1 - شماره پیاپی 29، اسفند 1394، صفحه 55-62   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

چکیده

مطالعاتگرده­شناختیجایگاهویژه­ایدرعلمگیاه­شناسی دارد. از آنجایی که دانه­های گرده به عنوان یک عامل حساسیت­زا برای انسان­ها مطرح هستندو بررسی آنها در زمینه آلرژی‌زایی اهمیت ویژه­ای دارد. در مطالعات مربوط به آلرژی دانه‌های گرده، درختان، علف هرز و چمن­ها به عنوان عامل موثر در افزایش حساسیت­زایی فصلی مطرح هستند. از جمله درختانی که دارای گرده­های باد دوست بوده و بسیار مورد توجه متخصصان آلرژی است، درخت بلوط استکه در نقاط مختلف کشور به صورت خودرو می­روید.کسب آگاهی­های علمی در مورد مراحل تکوینی دانه گرده گیاه بلوط و آلرژی­زایی آن هدف پژوهش حاضر است. دانه­های گرده از نقاط مختلف استان ایلام جمع­آوری شدند و بررسی‌های سلول-بافت‌شناسی برای آنها انجام شد. به منظور مشاهده اگزین دانه گرده از روش استولیز استفاده شد. آزمون­های سنجش ابتدایی برایتشخیص آلرژی روی رت­های نر با وزن متوسط 200 گرم انجام گرفت.عصاره گرده­ای پنج درصد با استفاده از بافر فسفات نمکی در pH: 7/ 4 تهیه شد. از رت­های مورد آزمایش پس از2، 8  و 24 ساعت و یک هفته از آخرین تزریق میزان IgE تام خون انجام شد. تشکیل ویل وفلر به وسیله آزمون­های پوستی نتایج مثبت را در حد منحنی P≤0.05 نسبت به نمونه کنترل نشان داد.با توجه به نتایج به دست آمده،عصاره گرده­ای بلوطآلرژی­زایی از نوع تیپ یک آلرژی را نشان می‌دهد.

کلیدواژه‌ها

آلرژی‌؛ دانه‌های گرده؛ QuercusbrantiiL؛ IgE

اصل مقاله

تیره راش(Fagaceae)با داشتنحدود900 گونه درختی و درختچه­ای خزان­کننده و همیشه سبز یکی از تیره‌های متنوع گیاهی محسوب می­شود و پراکنش وسیعی در نیمکره شمالی دارد. این تیره دارای سه زیر تیره و ده جنس است که بلوط با 300 ]18 [تا 600 ]20 [ گونه بزرگترین جنس این خانواده را تشکیل می­دهد]16[. بلوط ایرانی با نام علمیQuercusbrantiiگیاهی پایا باگل­آذین دم­گربه ای نر،پرچم‌ها 7-5 تائی، گل­های ماده منفرد یا دوتائی می‌باشد وگرده افشانی آن به وسیله باد است]11[.بلوط از جمله درختان خودروی قسمت­های مختلف ایران و بخصوص مناطق زاگرس به ویژه استان­های غرب کشور می­باشد. در استان ایلام جنگل های بلوط به دلیل موقعیت، عملکرد و تنوع زیستی حاکم بر آن از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.گذشته از نقش حیاتی، این درخت بسیار زیبا در حفظ استحکام منطقه از نظر سیلاب در پاکیزگی هوا و در تشکیل پوشش جنگلی منطقه مورد توجه می­باشد]3[.گزارش­های متعددی در زمینه­های اکولوژیکی گیاه در مناطق مختلف ایران توسط احمد حسینی و همکاران انجام شده است]10[. همچنین مطالعاتی در زمینه ضد میکروبی میوه آن]4 [و پژوهش­های هم در زمینه تاثیرات فیزیولوژیکی ]2 [و محیطی]1 [ توسط شیوا صفرپور و همکاران انجام شده ،اما تاکنون بررسی­های آلرژی زایی دانه­های گرده گیاه بلوط در کشور ما نتایجی ارائه نشده است.گزارش‌ها در ارتباط با بیماری‌های رینیت و آسم آلرژیک در ارتباط با قرار گرفتن در معرض دانه‌های گرده حال افزایش است]7و8[.در پژوهش حاضر سعی شده، پس از بررسی‌های میکروسکپی دانه های گرده گیاه و سنجش ابتدایی تشخیص آلرژی­های گرده به کمک آزمون­های پوستی میزان تام IgE به طور تجربی بررسی شود.

 

مواد و روش­ها

جمع­آوری گرده­ها

گل آذین­های نر درخت Q.brantiiدر اوایل فروردین ماه سال 1391 و 1392 از نقاط مختلف استان ایلام جمع آوری و بساک­های رسیده آن از گل‌ها جدا و دانه­های گرده با خرد کردن بساک و غربال نمودن به کمک غربال 70 میکرون جداسازی و در ⁰C 20- نگهداری شدند]5و9 [.

 

بررسی میکروسکوپی بساک و دانه های گرده

گل­هادرمراحلمختلف نمویجهت مطالعات

بافت-سلول شناختیتثبیت کننده(Formalin Acetic acid Ethanol)FAA70%قراردادهشدند. سپسذخیره‌سازیدرالکل70 درصدانجام شد. پسازجاسازی،برش‌گیرینمونه‌هادرقالب‌هایپارافینبامیکروتومدراندازه10میکرو متر صورت گرفت]21 [واز روشرنگ‌آمیزیمضاعفهستهوسیتوپلاسمبه‌وسیله هماتوکسیلینوائوزیناستفاده شد.نمونه‌هایموردمطالعهبامیکروسکوپنوری مشاهده شدند. بهمنظورمشاهده اگزیندانه­گردهازروشاستولیزاستفادهشد.

 

عصاره­گیری ازدانه های گرده

به منظور بررسی اثرات آلرژی­زایی دانه­های گرده ابتدا عصاره­گیری از گرده­ها انجام شد. برای تهیه عصاره گرده­ای از بافر فسفات نمکی 0.1 M(PBS)،(pH: 7.2) استفاده شد. هر گرم از گرده­ها در 20 میلی لیتر بافر حل شد (1:20). مخلوط گرده­ای حاصل به مدت 24 ساعت در دمای ⁰C 4 روی شیکر به هم زده و در g10000 به مدت 40 دقیقه در ⁰C 4 سانتریفوژ شد. محلول شناور حاصل را یک شبانه روز دیالیز نموده و سپس تا زمان استفاده در دمای ⁰c 20-ذخیره گردید ]17 [.

 

حیوانات آزمایشگاهی

در این پژوهش از حیوانات آزمایشگاهی به عنوان شاخص ارزشیابی تظاهرات آلرژی­زایی استفاده شد. حیوانات مورد آزمایش 25 سر رت نر با وزن 190 تا 340 گرم و سن 4تا 5 هفته بودند که از دانشگاه علومپزشکی ایلام خریداری و در5 گروه 5 تایی دسته بندی شدند. به حیوانات به منظور حساس سازی عصاره گرده­ای تزریق و حیوانات گروه شاهد با همان مقدار PBSتیمار شدند. تزریق با سرنگ توبرکولینی یک میلی لیتر به میزان 75 میکرو لیتر در هر مرتبه بود ]19 [.پسازحساس‌سازی، بهمنظورایمن‌سازیآنهاهریکازعصاره­هایگرده­ای دردوتکرار،هرهفتهیکباربهطریقدرونصفاقیتزریقشد.

خون‌گیری از حیوانات

2 ساعت، 8 ساعت ، 24ساعت و یک هفته بعد از آخرین تزریق به ترتیب برای شمارش سلول­های خونی و اندازه­گیری IgEتام، خون‌گیری از حیوانات صورت گرفت]14[. بلافاصله بعد از خون‌گیری مقدار 1-0.5 میلی‌لیتر از خون در لوله آغشته به EDTA (برای جلوگیری از انعقاد خون) ریخته شد و از آن برای شمارش سلول­های خونی استفاده گردید]6[. برای اندازه­گیری IgE یک میلی‌لیتر از خون هر حیوان سانتریفوژ و سرم آن تفکیک شد. نمونه­های خون و سرم برای بررسی­های لازم به آزمایشگاه طبی ابن سینا برده شد.

 

آزمون پوستی

در آزمون پوستی به روش خراش پوستی
(Prick test) درآخرین مرتبه تزریق ایمن‌سازی به صورت زیر پوستی در محل پوست شکم و کشاله ران انجام شد، 24 ساعت قبل از انجام آزمون سطح پوست موش‌های مورد آزمایش را با تیغ استریل تراشیده و محل تزریق را باالکل تمیز کرده، سپس دو قطره از عصاره گرده بر روی پوست گذاشته شد. در محل قطره یک خراش کوچک در پوست ایجاد کرده و واکنش‌های پوستی بین 0.5 تا 2 ساعت با فاصله زمانی نیم ساعت بررسی شدند. بعد از یک هفته تکرار، به منظور بررسی سلول‌های خونی، خون‌گیری انجام گرفت. در این روش خون‌گیری از قلب انجام شد]15 [.

 

نتایج

نتایج ریخت شناسی دانه گرده بلوط

در بررسی مورفولوژی دانه گرده به روش استولیز، دانه گرده بلوط با سه منفدمشاهده شد(تصویر1).

 

تصویر1.دانه‌های گرده استولیز شده، Ex:اگزین، (Pollen Grain Pore) PGP: منفذ دانه گرده (بزرگنمایی1000×)

 

تکوین دانه گرده

بررسی تکوینی گل­های نربلوط نشان می­دهد که بساک­ از نوع تتراسپورانژ یا چهار کیسه گرده‌ای است. یاخته­های توده هاگزا به طور معمول یک تقسیم را گذرانیده، اندازه آن افزایش یافته و یاخته­های مادر گرده چندوجهی با رنگ پذیری زیاد و هسته­های حجیم را در هر کیسه گرده ایجاد کرده‌اند(تصویر2الف و ب).هر یک از یاخته­های مادر گرده تقسیم با کاهش کروموزومی(میوز) را پشت سر گذاشته (تصویر2ج) و چهار سلول n کروموزومی (هاپلوئید) را به نام تتراسپور به وجود می­آورد. همزمان با ورود یاخته­های مادر گرده به میوز، دیوار ویژه‌ای توسط همین یاخته‌های در اطراف یاخته­ ترشح می­شود و آن را احاطه می­کند. تیپ تترادی در بلوط از نوع تتراهدرال است. لایه تاپی نیز که داخل ترین لایه بساک و مجاور تتراسپورها قرار دارد، نقش تغذیه‌ای را دارد و از نوع ترشحی است(تصویر3 الف و ب).پس از میوز دیواره ویژه اطراف تتراسپورها فرو رفته و چهار یاخته­های جوان میکروسپور را به وجود می­آورد. ضمن این مراحل عده­ای از یاخته­های لایه مغذی ترشحی در کنار بساک باقی مانده­اند و عده­ای دیگر حالت آمیبی از دیواره جدا شده­اند و در فضای درونی کیسه بساک در مجاورت دانه­های گرده قرار گرفته­اند(تصویر3 ج). در مرحله بعدی نمو میکروسپورها، اطراف هر میکروسپور را دیواره مستقل اگزینی می­پوشاند و سپس دیواره درونی در مجاورت پرتوپلاسم به وجود می­آید، در این حالت هنوز هسته هر میکروسپور مرکزی است (تصویر4الف). آرام آرام عده­ای از یاخته­های تاپی محو شده، در میکروسپورها حجم واکوئل افزایش می­یابد و میکروسپورهای بالغ تشکیل می­شوند. در مراحل پایانی تکوین میکروسپورها سلول­های لایه مغذی از محل اولیه خود جدا شده، در لابه لای میکروسپورهای در حال نمو قرار می‌گیرند(لایه مغذی پلاسمدی یا آمیبی) و مواد حاصل از تجزیه آنها در فضای کیسه گرده رها شده و مورد استفاده دانه­های گرده قرار می‌گیرند. سلول­های لایه میانی هم تحلیل می‌روند(تصویر4 ب وج). سپس دانه گرده با سه منفذ تشکیل می­شود(تصویر5 الف). در مرحله بعدی، دانه­های گرده بالغ برای تقسیم میتوزی آماده می­شوند، به طوری که هسته به مرکز آمده و میتوز اتفاق می­افتد، این تقسیم نامتقارن است و موجب تشکیل یک هسته حجیم و درشت و یک هسته متراکم و کوچک می­شود. هسته حجیم زیر بنای تشکیل یاخته­های رویشی و هسته متراکم زیر بنای تشکیل هسته زایشی است. در این مرحله هنوز سلول­های تاپی پلاسمدی یا آمیبی در لابه لای دانه­های گردهمشاهده می­شوند(تصویر 5 ب).در مرحله بعدی لایه مکانیکی به سمت بساک تحلیل رفته و لایه مکانیکی به سمت خارج بساک آرام آرام به هم می­پیوندند. لایه مکانیکی به سمت خارج شکفتگی پیدا کرده و در نهایت شکفتن بساک و آزاد شدن گرده­های بالغ را مشاهده می­شوند (تصویر 5 ج).

 

 

 

 

تصویر2. الف: برش عرضی بساک، E: اپیدرم، En: لایه مکانیکی،Ml:لایه میانی، Ta: لایه مغذی (تاپتوم)،PMC: یاخته­ مادر گرده(بزرگنمایی 4000×).ب-یاخته­ مادر گرده (PMC)(بزرگنمایی 400×). ج- شروع دوره گامتوفیتی(بزرگنمایی 400×)

 

 

 

تصویر3 الف- :Diسلول دیاد، SW: دیواره ویژه (بزرگنمایی 4000×) ب : Te:سلول تتراد (بزرگنمایی 4000×) ج- میکروسپور جوان ST:تاپی ترشحی، AT:تاپی آمیبی،PG: دانه گرده (بزرگنمایی 4000×).

 

 

تصویر4الف-میکروسپور بالغ(بزرگنمایی 400×). تصویرب- تکوین دانه های گرده به کمک یاخته­های تاپی. (بزرگنمایی 4000×)ب-AT:تاپی آمیبی(بزرگنمایی 1000×) ج-ST:تاپی ترشحی (1000×)

 

 

 

تصویر6 الف-منافذ دانه گرده بالغ بلوط : منفذ دانه گردهP:Pore(بزرگنمایی 4000×) ب-Gn: سلول­زایشی و Vn:سلول رویشی(بزرگنمایی 4000×). ج PG: دانه گرده بالغ، ST: محل شکفتن بساک(بزرگنمایی 400×)

 

 

نتایج حاصل از آزمون پوستی

بررسی آزمون پوستی با روش [1]SPTنشان داد که در 30 دقیقه اول ابتدا تورم (Wheal) و قرمزی (Flare) بسیار کمی ایجاد شد و 35 دقیقه بعد، خارش در ناحیه تورم مشاهده شد و در نهایت بعد از گذشت 2 ساعت پس از چکاندن عصاره این تحریکات به حداکثر مقدار خود رسید. تورم و قرمزی مشاهده شده نسبت به شاهد (بافر فسفات نمکیPBS) بیشتر بود(تصویر7). حداقل و حداکثر قطر فلر در گروه تیمار شده به ترتیب 5 و 32 میلی متر و در نمونه های کنترل به ترتیب 2.5 و 12.5 میلی متربود(جدول1(.

 

 

 

 

تصویر7. آزمون پوستی عصاره ، A: کنترل منفی (PBS)،B:تحت تیمار با عصاره 5%دانه های گرده بلوط

 

جدول 1. مقایسه قطر ویل و فلر در پنج گروه مورد آزمایش

قطر فلر بر حسب میلی متر							قطر ویل یا هاله برحسب میلی متر
گروه	گروه
		2 ساعت	1 ساعت	30 دقیقه	2 ساعت	1 ساعت	30 دقیقه	2 ساعت	1 ساعت	30 دقیقه	2 ساعت	1 ساعت	30 دقیقه
20 32 20 30 25	19 8 13 17 17	5 5 7.5 10 12.5	5 5 6.5 4.5 12	2.5 2.5 5 1.5 7	2.5 1.5 5 - 5	1 2 3 4 5	2 3 2 2 3	1 2 2 1 2	- 1 1 - 2	1 1 - - 1	1 - - - 1	- - - - -	1 2 3 4 5

 

 

بررسی میزان IgE تام

میزان IgE سرمی در خون یکی از بهترین شاخص­های واکنش آلرژیک است. بررسی میزان IgE نشان داد که بیشترین مقدار IgEبا ng/mI 16.16 در نمونه سرولوژی وng/mI8.6در نمونه کنترل تفاوت معنی داری را نشان می­دهد(P≤0.05).

 

جدول2.مقایسه میانگین گروه‌ها برای صفات ارزیابی شده به روش آزمونt-test

گروه	نمونه کنترل	نمونه تحت تیمار با عصاره 5% گرده
IgEng/ml	16.16	8.60

 

بحث

گیاه بلوط،به عنوان یک گونه گیاهی با ارزش در جهان مطرح است. این گیاه در اقلیم‌های مختلف از نواحی زاگرس یکی از مهم‌ترین درختان فضای سبز است. در اروپا و آمریکا، گزارش­های متعددی در ارتباط با حساست­زایی دانه­های گرده این گیاه گزارش شده است. از طرفی مطالعات سلول-بافت شناختی بساک و دانه­های گرده، می­توانند یک کمک موثر بر تشخیص دقیق­تر آلرژن­های گرده گیاه بلوط داشته باشد.مطالعات نمو بساک در بلوط نشان داد کهدر این گیاه لایه میانی، یک لایه موقت یا ناپایدار است و در مرحله جدا شدن تتراسپورها از یکدیگر تجزیه می‌شوند، که نتایج مشاهدات ما بااکثر دانه­های گرده گیاهان نهاندانه دولپه­ای هم­سویی دارد.آرایش میکروسپورهای داخل دیواره در گیاه Q. brantiiاز نوع تتراهدرال (چهار وجهی) است. در گزارش‌های چهرگانی راد و همکاران در سال 1389اعلام شده است که آرایش تتراسپورها در گیاه CentaureaIberica L. از نوع تتراهدرال است و Gotelli et al. 2008 و Coleman 2005 گزارش کردند که در گیاه Eupatorium laevigatumL. آرایش میکروسپور از نوع تتراهدرال است، که با نتایج ما هم‌سویی دارد ]12و13[.دانه­گرده بلوطدوهسته­ای است این مدل دانه گرده را در اغلب دولپه­ای­ها گزارش کرده­اند و همین طور سه منفذی است شبیه به دانه­های گرده خانواده Asteraceae است که با گزارش­های امجد-مجد برای گرده‌های بومادران و شریف شوشتری-مجد در ارتباط با گرده‌های گیاه مارگریت هم­سویی دارد.

بررسی­های نتایج پوستی و IgE تام نشان می‌دهد،که دانه­های گرده بالغ گیاه بلوط آلرژی­زایی قابل توجهی دارند، اما باید روند مطالعات در آینده ادامه داشته باشدبابررسی کمی و کیفی پروتئین­های دانه­گرده با انجام آزمون سنجش پروتئین برادفورد و الکتروفورز SDS-PAGE و انجام آزمون­های تکمیلی از جمله وسترن ایمونوبلاتینگ و توالی یابی اسیدهای آمینه و تشخیص نوع آلرژن های اصلی دانه­های گرده این گیاه به جزئیات دقیق­تری پرداخته و گزارش­های مفصلی به متخصصان آسم وآلرژی داده شود، تا با شناخت هر چه دقیق­تر ،بتوان برای بیماران مبتلا به حساسیت فصلی در استان ایلام با توجه توری بودن بلوط در پوشش گیاهی اقدامات لازم را به عمل آورد.

مراجع

 

[1]     پناهی، پ پورمجیدیان،م. جم زاده، ز فلاح، ا 1390. ارزش ریز ریخت شناسی صفات برگ و دانه گرده برای تفکیک گونه­های جنس بلوط در جمگ­های ایران. فصلنامه علمی پژوهشی تحقیقات جنگل و صنوبر ایران. جلد 19، شماره 1، صفحه 179-163

[2]      پناهی، پ. پورهاشم، م. حسینی­نژاد، م. 1393. آلومتریزیتودهوذخیرةکربنبرگبلوط‌هایباغگیاه‌شناسیملیایران. مجلهزیست‌شناسیایران (مجلهپژوهش‌هایگیاهی). جلد27،شماره1.

[3]      حسنی، ا. حسینی، م. رحمانی، ا. آذرفر، د. 1391. تأثیرمرگومیردرختیبرساختارجنگل‌هایبلوطایرانیدراستانایلام. فصلنامةعلمی–پژوهشیتحقیقاتجنگلوصنوبرایران،جلد20شماره4،صفحه577-565.

[4]      حیدری، م. پوربابایی، ح. عطار روشن، س. 1389. وضعیتزادآوریطبیعیبلوطایرانیدربینگروه‌هایبوم‌شناختیدرناحیهرویشیکردو - زاگرس. مجلهزیست‌شناسی‌ ایران. جلد24، شماره4.

[5]      رضانژاد، ف.1282. بررسی نمو دیواره بساک، میکروسپورزایی، ساختار، پروتئین‌ها و آلرژی­زایی دانه­های گرده برخی گیاهان پارک­های شهر تهران.پایان نامه دکتری. دانشگاه تربیت معلم، 117-.112

[6]      شریف­شوشتری،م. مجد، ا. پورپارک، ز. معین، م. 1386. بررسی ویژگی­های ­ساختاری و توان آلرژی‌زاییگرده­های بالغ گیاه مارگریت (Chrysanthemum maximum L)

[7]      صفرپور کپورچالی،ش. علیزاده­علی­آبادی، ع. قاسمی، ا. صادقی، ا. 1392. مقایسه اثرات ضدباکتریایی عصاره گال بلوط ایرانی روی چند باکتری گرم مثبت و گرم منفی بیماری­زای گیاهی. مهار زیستی در گیاه‌پزشکی، جلد1، شماره2.

[8]      علیجان­پور، ا. شفیعی، ع. اسحاقی­زاد، ج.  1389. بررسیوضعیتتجدیدحیاتطبیعیجنگل‌هایبلوطغربدررابطهباعوامظلرویشگاهی (مطالعهموردی:منطقةپیردانهپیرانشهر). مجله جنگلایران،انجمنجنگلبانیایران،سالدوم،شمارة3،صفحة219-209.

[9]      قناتی، ف.1384. زیست‌شناسی دانه­های گرده. انتشارات آرموس 75-73.

[10]   نجفی­فر، ع. 1390. بررسی فراوانی زادآوری جنسی گونه­های جنگلی در ارتباط با برخی عوامل اکولوژیکی در جنگل­های بلوط غرب استان ایلام. فصلنامةعلمیپژوهشیتحقیقاتجنگلوصنوبرایران. جلد19شماره2،صفحه290-279.

[11]   Chengjiu Huang, Yongtian  Zhang& Bruce Bartholomew .1987."Fagaceae". in Flora of China Vol. 4 Page 314. Published by Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press.

[12]   Coleman, J. R. 2005. Embryology ancytogenetic of Eupatorium laevigatum (Asteraceae). Genetics and Biology 28: 123-128.

 

[13]  Gotelli, M. M., Galati, B. G. and Medan, D. 2008. Embryology of Helianthus annuus (Asteraceae). AnnalesBotaniciFennici 45:81-96

[14]  Gronelberg D A, Bielory L, Fischer S,Bonini, Wahn U. (2003)Animal models of allergic and inflammatory. Conjeuctivitis Allergy. 58:1101-1113.

[15]  Hiyoshi K, Takano H, Tomura S, Kumagais y. (2005) Effects of phenanthraquinone on allergic airway inflammation in mice.ClinExp Allergy.35:1243-1248.

[16]  Jones, J.H., 1986. Evolution of the Fagaceae: the implications of foliar features. Annals of the Missouri Botanical Garden, 73: 228-275.

[17]  Kuldeeps Jaggi, and sharad V. Ganga. (1987) Isolation and identification of pollen allergens of Artemisia. Scoparia J. Allergy clinImmunol. 80:562-72.

[18]  Lawrence, G.H.M., 1951. Taxonomy of vascular MacMillan co,. New York, 823 P

[19]  Majd A, Ghanati F. (1995) The effect of airpollution on the allergenicity of pinuselderica (pinaceae) pollen. Grana.34: 208-211.

[20]  Soepadmo, E., 1972. Fagaceae. Flora Malesiana, Series I, 7 (2): 265-403.

[21]  Xue, C. Y., Li, D. Z. (2005) Embryology of Megacodonstylophorusand Veratrillabaillonii(Gentianaceae): description and systematic implication. Botanical Journal oftheLinnean Society 147: 317-331.