ارزیابی امکان حساس کردن لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 به شرایط اسیدی به‌وسیله عصاره پوست پرتقال

هیستو بیولوژی دامپزشکی

مقاله 7، دوره 5، شماره 2 - شماره پیاپی 8، دی 1396، صفحه 37-47   

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

لیلا نیک روان^{* 1}؛ مهدی زارعی²؛ مهدی پور مهدی برروجنی³

¹دانشگاه آزاد اسلامی واحدشوشتر

²دانشگاه اهواز

³اهواز

چکیده

توانایی باکتری‌ها در تحمل pHهای پایین از جمله خصوصیات مهمی است که به زنده‌مانی باکتری در محیط‌های مختلف کمک می‌نماید. لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 توانایی زیادی در زنده‌مانی در محیط‌های اسیدی دارد. در مطالعه حاضر توانایی عصاره پوست پرتقال جهت حساس کردن لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 به شرایط اسیدی مورد ارزیابی قرار گرفت. به این منظور سلول‌های لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 (با تعداد تقریبی 10⁵ واحد تشکیل دهنده کلنی در میلی­لیتر) به محیط‌های TSB با pH برابر با 4 و 5 ایجاد شده به‌وسیله اسیدهای استیک و لاکتیک به­طور جداگانه و حاوی  غلظت­های 5/0 و 1 درصد از عصاره پوست پرتقال تلقیح شدند. تعداد باکتری­های زنده قبل و پس از 6 ساعت مواجهه با محیط به روش کشت سطحی بر روی محیط TSA شمارش گردید. بر اساس نتایج این تحقیق غلظت 5/0 درصد عصاره پوست پرتقال تأثیری بر میزان زنده­مانی باکتری­های لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 در شرایط اسیدی مورد آزمایش نداشت (05/0<p). اما غلظت­ 1 درصد عصاره پوست پرتقال توانست که سلول­های لیستریا مونوسیتوژنز را به pHهای 4 و 5 ایجاد شده توسط اسید لاکتیک و اسید استیک حساس­تر کند(05/0>p). نتایج مشابهی در مورد اشریشیا کلای O157:H7 به­دست آمد. بنابراین غلظت­ 1 درصد عصاره پوست پرتقال می­تواند میزان غیرفعال شدن باکتری­های لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 در طی مواجهه با pHهای پایین و اسیدهای آلی را افزایش دهد.

کلیدواژه‌ها

لیستریا مونوسیتوژنز؛ اشریشیا کلای O157:H7؛ عصاره پوست پرتقال

اصل مقاله

از سال‌های دور تحقیقات بسیاری در رابطه با تحمل اسیدی باکتری‌های غذایی و تأثیر اسید‌های مختلف بر آن‌ها انجام شده است. در کتب و منابع علمی مرتبط با میکروبیولوژی مواد غذایی نیز، تقریباً در مورد اکثر پاتوژن‌های غذایی، مطالبی در رابطه با محدوده‌ی pH قابل تحمل، محدوده‌ی pH قابل رشد، تأثیر اسید‌های مختلف و مکانیسم‌های دخیل در تحمل اسیدی آن‌ها یافت می‌شود (مرتضوی و صادقی ماهونک، 1381؛ مرتضوی و همکاران، 1372؛ مرتضوی و همکاران، 1379).

لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 از جمله باکتری­های مهم پاتوژن غذایی می باشند که از طیف وسیعی از مواد غذایی نظیر شیر، محصولات لبنی، گوشت و مواد غذایی گوشتی جداسازی شده و بر اساس نتایج مطالعات مختلف از تحمل بالایی نسبت به شرایط اسیدی برخوردارند. اگر چه که میزان این تحمل اسیدی به نوع اسید به­کار رفته نیز بستگی دارد. از این رو توجه زیادی به کنترل این باکتری­ها در مواد غذایی معطوف شده است (Gandhi, 2007; and Chikindas Farrokh et al., 2013 Cheroutre-Vialette et al., 1998 ; Aygun and Pehlivanlar, 2006 ;).

در پاره­ای از تحقیقات صورت گرفته بر روی آن دسته از پاتوژن‌های غذایی که به طور طبیعی مقاومت اسیدی بالایی دارند، روش‌های افزایش حساسیت آن‌ها نسبت به شرایط اسیدی نیز مورد مطالعه قرار گرفته است. به عنوان مثال از اتانول جهت افزایش حساسیت اشریشیا کلای O157:H7 و  لیستریا مونوسیتوژنز به شرایط اسیدی استفاده شده است (Jordan et al., 1999; Park and Barker, 2001).

 افزایش حساسیت نسبت به شرایط اسیدی از نقطه نظر کنترل باکتری‌های مقاوم به شرایط اسیدی در مواد غذایی با توجه به دامنه pH مواد غذایی حائز اهمیت فراوانی است اما از طرف دیگر عدم تمایل مصرف کنندگان به استفاده از غذاهای حاوی نگهدارنده­های شیمیایی و نگرانی­های آنان در مورد اثرات وجود این نگهدارنده­ها در مواد غذایی روز به روز در حال افزایش است. این مسأله محققین علوم و صنایع غذایی را به سوی یافتن و استفاده از مواد با منشأ طبیعی به عنوان نگهدارنده یا تقویت کننده اثر نگهدارنده در مواد غذایی ترغیب نموده است. به همین دلیل در سال­های اخیر استفاده از ترکیبات به­دست آمده از گیاهان و میوه­ها جهت بهبود کیفیت و افزایش مدت زمان نگه­داری مواد غذایی بسیار مورد توجه قرار گرفته است.

بدین جهت تحقیق حاضر با هدف ارزیابی امکان حساس کردن لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 به شرایط اسیدی به­وسیله عصاره پوست پرتقال ، طراحی گردید.

 

 

 

روش کار

 میکروارگانیسم­ها

باکتری­های لیستریا مونوسیتوژنز(ATCC 7644)  و اشریشیا کلای O157:H7 (ATCC 43895)که به صورت کشت ذخیره حاوی گلیسرول در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگه­داری می‌شد، جهت فعال­سازی به محیط TSB منتقل و به مدت 24 ساعت در انکوباتور با دمای 35 درجه­ سانتی­گراد نگه­داری شد.

 

آماده کردن مایه‌ی تلقیح

میزان 100 میکرولیتر از محیط کشت حاوی میکروارگانیسم­های فعال شده مورد آزمایش به 5 میلی­لیتر محیطTSB  تلقیح شد و در دمای 35 درجه سانتی­گراد انکوبه شد و بعد از گذشت 24 ساعت، اقدام به رقیق­سازی متوالی و کشت سطحی بر روی محیط کشت TSA گردید. پلیت­ها در دمای 35 درجه­ سانتی­گراد به مدت 36-24 ساعت انکوبه شدند و سپس تعداد باکتری­های زنده در هر میلی­لیتر محیط کشت شمارش و محاسبه گردید. این آزمایش در سه تکرار انجام گردید. با این عمل تعداد باکتری­های لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 پس از 24 ساعت مشخص گردید. جهت انجام آزمایشات بعدی با رقیق سازی کشت 24 ساعته به­وسیله محیط TSB استریل، دوز مورد نظر تلقیح یعنی 10⁵ واحد تشکیل دهنده­ی کلنی در میلی­لیتر تهیه شد.

تهیه‌ی محیط کشت TSB با pH برابر با 4 و5 به­وسیله اسیدهای لاکتیک و استیک

بدین منظور ابتدا محلول­های ذخیره غلیظ اسید لاکتیک (12 مولار) و اسید استیک (4/17 مولار) تهیه و به کمک فیلتر سرنگی استریل گردید. پس از تهیه TSB استریل، اسید‌های تهیه شده به میزانی به محیط‌ها اضافه گردید که pHهای مورد نظر یعنی 4 و 5 به دست آید.

بررسی تأثیر عصاره پوست پرتقال در افزایش حساسیت لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 نسبت به شرایط اسیدی

جهت بررسی تأثیر یا عدم تأثیر غلظت­های غیر کشنده عصاره پوست پرتقال در افزایش حساسیت لیستریا مونوسیتوژنز و اشریشیا کلای O157:H7 نسبت به شرایط اسیدی، هر کدام از باکتری­های مذکور به­طور جداگانه و با دوز تلقیح حدود CFU/ml 10⁵ به 10 میلی‌لیتر محیط TSB با pHهای برابر با 4 و 5 که به­وسیله اسیدهای استیک یا لاکتیک ایجاد شده بود (گروه کنترل) تلقیح گردید. همچنین هر کدام از باکتری­های مذکور به­طور جداگانه به محیط‌هایی با شرایط مشابه اما حاوی غلظت­های غیر کشنده عصاره پوست پرتقال (5/0 و 1 درصد) تلقیح گردید. قبل از تلقیح به منظور تعیین تعداد اولیه‌ی باکتری‌های تلقیح شده، مایه‌ی تلقیح پس از رقیق‌سازی متوالی بر روی محیط TSA کشت گردید. محیط‌های TSB تلقیح شده به مدت 6 ساعت در انکوباتور با دمای 35 درجه سانتی­گراد قرار داده شدند و سپس به منظور تعیین تعداد باکتری‌های زنده باقی­مانده اقدام به رقیق سازی متوالی و کشت بر روی محیط TSA گردید. همه‌ی آزمایش­ها در سه تکرار صورت گرفت.

آنالیز آماری

داده­های جمع­آوری شده با استفاده از نرم­افزار SPSS نسخه 16 به­ طور توصیفی و تحلیلی بررسی شدند. تحلیل داده­ها با آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون تکمیلی LSD و آزمون t برای دو نمونه مستقل انجام گرفت.

مراجع

1. زارعی، مهدی.، پورمهدی بروجنی، مهدی.، جزایری، سید علی. (1393). ارزیابی امکان حساس کردن مرگانلا مرگانی به شرایط اسیدی به وسیله اتانول و  EDTA، مجله دامپزشکی ایران، دوره دهم، شماره2، صفحه 28-19.
2. 2. مرتضوی، سیدعلی.، حدادخداپرست، محمدحسین.، فرهوش، رضا.، رضائی‌مکرم، رضا.، ناصحی، بهزاد. (1372). میکروبیولوژی غذایی مدرن، تألیف: جی جیمز ام، جلد اول، چاپ اول، انتشارات نشر مشهد، مشهد مقدس،صفحه 105 -73. 
3. 3. مرتضوی، سیدعلی.، صادقی ماهونک، علیرضا. (1381). میکروبیولوژی غذایی، تألیف: ادمز ام آر و موس ام آ، چاپ چهارم، ویرایش دوم، انتشارات دانشگاه فردوسی، مشهد مقدس، صفحه 62-29، 140-131.
4.  4. مرتضوی، سیدعلی.، کاشانی‌نژاد، مهدی.، ضیاءالحق، حمیدرضا. (1379). میکروبیولوژی مواد غذایی، تألیف: فریزیر ویلیام سی و وستهوف دنیس سی، چاپ سوم، انتشارات دانشگاه فردوسی، مشهد مقدس، صفحه31-16، 418.                                                                                                              

5. Alakomi, HL., Saarela, M. and Helander, IM. (2003). Effect of EDTA on Salmonella enterica serovar Typhimurium involves a component not assignable to lipopolysaccharide release. Microbiology. 149: 2015–2021.

6. Aygun, O. and Pehlivanlar, S. (2006). Listeria spp. in the raw milk and dairy products in Antakya, Turkey. Food Control. 17: 676–679.

7. Barker, C. and Park, S. (2001). Sensitization of Listeria monocytogenes to low pH, organic acids, and osmotic stress by Ethanol, Applied and Environmental Microbiology. 67: 1594-1600.

8. Bruno-Barcena, JM., Andrea Azcarate-peril, M. and Hasan, HM. (2010). Applied and Environmental Microbiology. 76(9): 2747.

9. Cheroutre-Vialette, M., Lebert, I., Hebraud, M., Labadie, JC. and Lebert, A. (1998). Effects of pH or astress on growth of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology. 42: 71-77.

10. Farrokh, C., Jordan, K., Auvray, F., Glass, K., Oppegaard, H., Raynaud, S., Thevenot, D., Condron, R.., Reu, KD., Govaris, A., Heggum, K., Heyndrickxi, M., Hummerjohann, J., Lindsay, D., Miszczycha, S., Moussiegt, S., Verstraete, K. and Cerf, O. (2013). Review of Shiga-toxin-producing Escherichia coli (STEC) and their significance in dairy production. International Journal of Food Microbiology. 162 (2): 190-212.

11. Gandhi, M., Chikindas, ML. (2007). Listeria: A foodborne pathogen that knows how to survive. International Journal of Food Microbiology. 113: 1–15.

12. Helander, lM., Alakomi, HL., Latva-Kala, K. and Koski, P. (1997). Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of Gram-negative bacteria. Microbiology. 143: 3193-3199.

13. Jordan, SL., Glover, J., Malcom, L., Thomson-Carter, FM., Booth, IR., Park, SF., 1999. Augmentation of killing of Escherichia coli O157 by combinations of lactate, ethanol, and low-pH conditions. Applied and Environmental Microbiology. 65: 1308–1311.

14. Karab₁y₁kl₁, S., Degirmenci, H., Karap₁ar, M. (2014). Inhibitory effect of sour orange (Citrus aurantium) juice on Salmonella Typhimurium and Listeria monocytogenes. LWT-Food Science and Technology. 55: 421-425.

15. Lambert, RJW., Hanlon, GW. and Denyer, SP. (2004). The synergistic effect of EDTA/antimicrobial combinations on Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 96: 244–253.

16. Vurma, M., Chung, Y., Shellhammer, TH., Turek, EJ., Yousef, AE., 2006. Use of phenolic compounds for sensitizing Listeria monocytogenes to high-pressure processing. International Journal of Food Microbiology. 106: 263-269.