تغییرات هیستوپاتولوژیک کلیه ماهی هامور معمولی (Epinephelus coioides) تحت تاثیر بنزوآلفاپایرن و باکتری (alginolyticus Vibrio)

هیستو بیولوژی دامپزشکی

مقاله 10، دوره 3، شماره 2 - شماره پیاپی 5، اسفند 1394، صفحه 32-42   

نوع مقاله: علمی پژوهشی

چکیده

بنزوآلفاپایرن(BaP) از سمی­ترین ترکیبات موجود در نفت خام است که با آلودگی اکوسیستم­های آبی، موجب تضعیف سیستم ایمنی آبزیان و کاهش مقاومت آنها در برابر پاتوژن­های فرصت طلب می­شود. باکتری V. alginolyticus گونه­ای از این پاتوژن­های فرصت طلب است که در شرایط استرس­زا، موجب بیماری ویبریوزیس در موجودات مختلف می­گردد. به­منظور بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک ناشی از تاثیر دو استرسور BaP و باکتری                  V. alginolyticus بر کلیه ماهی هامورمعمولی، تعداد 140 قطعه از این ماهیان به­طور تصادفی در 7 تیمار قرار گرفتند و به مدت 16 روز بررسی شدند. در تیمار شاهد هیچ تزریقی انجام نشد، در تیمار کنترل حلال، فقط روغن نارگیل و در تیمار باکتری غلظت cfu/ml V. alginolyticus 10⁷ تزریق شد. به تیمارهای 4 و 5 به ترتیب غلظت­های mg/kg BaP20 و 200 و به تیمارهای 6 و 7 به ترتیب ( mg/kg BaP20+ cfu/ml V. alginolyticus10⁷) و (mg/kg BaP200+ cfu/ml V. alginolyticus10⁷) تزریق شد. نمونه­برداری از بافت کلیه در روزهای 1،7،4 و 14 صورت گرفت و پس از انجام مراحل بافت­شناسی، بافت­های مذکور در زیر میکروسکوپ نوری بررسی شدند. در تیمارهای مختلف ضایعاتی نظیر تشکیل مراکز ملانوماکروفاژی، نفوذ لوکوسیتی، افزایش فضای ادراری، جداشدن غشای پایه از اپی تلیوم لوله­های کلیوی، اتساع مویرگ­های گلومرولی و خونریزی مشاهده گردید. نتایج نشان داد که با افزایش غلظت بنزوآلفاپایرن وسعت و شدت ضایعات افزایش می­یابد. از طرفی بیشترین ضایعات مربوط به تیمارهای ترکیبی و به ویژهmg/kg  + BaP200باکتری در روز هفتم آزمایش بود. به طوری که نداشتن سازمان یافتگی بافتی، تجمع مراکز ملانوماکروفاژی و خونریزی شدید در این تیمارها مشاهده گردید.

کلیدواژه‌ها

: بنزوآلفاپایرن؛ Vibrio alginolyticus؛ ماهی هامور معمولی؛ کلیه؛ هیستوپاتولوژی

اصل مقاله

مقدمه

 

در چند دهه اخیر، افزایش فعالیت های آنتروپوژنیک منجر به افزایش سطوحآلاینده­ های ارگانیک و غیرارگانیک در اکوسیستم های دریایی و گسترش آنها بویژه در مناطق ساحلی شده است(15). مشکلات آلودگی نفتی خصوصا در مناطق تولیدکننده نفت مانند خلیج فارس بسیار جدی و حاد می باشد. بیشترین تاثیر نفت به بخش آروماتیک آن به ویژه هیدروکربن های آروماتیک های چندحلقه ای (PAHs) نسبت دادهمی شود (12). این ترکیبات به دلیل خاصیت چربی دوستی بالا، قادر به عبور از غشای پلاسمایی انواع سلول ها بوده و با برقراری پیوند کوالانسی با ماکرومولکول های سلول (پروتئین­ها، DNA و RNA) منجر به آسیب های سلولی، جهش و انواع سرطان می شوند (13). بنزوآلفاپایرن (BaP) ایمنوتوکسیک ترین و سرطانزاترینPAH هاست (7). این ترکیببا مکانیسم های مختلفی موجب تضعیف سیستم ایمنی موجودات می گردد (6). تضعیف سیستم ایمنی شرایطی برای بیماری زایی پاتوژن های فرصت طلب از قبیل V. alginolyticus فراهم می کند (6). این باکتری کهجزء فلور میکروبی نرمال محیط های دریایی و آبزیان مختلف از جمله ماهی هامورمعمولی محسوب می شود، در شرایط استرس زا موجب بروز یک عفونت سیستمیک بنام ویبریوزیس می گردد. کلیه از جمله بافت های هدف در بیماری ویبریوزیس است (1)؛ از طرفی، یکی از اولین اندام هایی است که در مواجهه با آلاینده های محیطی، تحت تاثیر قرار می گیرد (22). با توجه به اهمیت کلیه، در تنظیم اسمزی آب و نمک از طریق دفع مواد نیتروژن دار زائد از بدن موجودات (16)، اختلال در عملکرد آن، می تواند موجب اختلال در هومئوستاز بدن گردد. در این پژوهش، گونه مورد بررسی ماهی هامور معمولی (Epinephelus coioids) می باشد. این ماهی از جمله ماهیان بومی خلیج فارس با ارزش غذایی بالاست که در جنوب کشور از بازارپسندی بالایی برخوردار است (5). هدف از مطالعه حاضر، بررسی آسیب های بافتی ناشی از آلاینده شیمیایی (هیدروکربن آروماتیک پنج حلقه ای بنزوآلفاپایرن) و عامل مولد بیماری عفونی حاد ویبریوزیس             (V. alginolyticus) و همچنین ارزیابی تاثیر همزمان این دو استرسور بر ساختار بافتی کلیه ماهی هامور معمولی می باشد. با توجه به اینکه در این خصوص، مطالعات چندانی در کشور انجام نشده است، مطالعه حاضر می تواند اطلاعات ارزشمندی در ارتباط با اثرات همزمان عوامل عفونی وغیرعفونی بر بدن ماهی، به عنوان یک مهره دار آبزی و یکی از با ارزش ترین کالاهای سبد غذایی مردم، در اختیار محققین قرار دهد.

 

روش کار

 

در این پژوهش تعداد 140 عدد ماهی هامور معمولی نابالغ جنسی، با میانگین طولی 2/0 ± 8 /20 سانتیمتر و میانگین وزنی 9/7 ± 180 گرم، از ایستگاه تحقیقاتی بندر امام خمینی تهیه گردید و در همان مرکز در تانک های 6000 لیتری (پر شده با آب تیمار شده با اشعه UV) نگهداری شدند. در ادامه، این ماهیان به 7 تانک 300 لیتری (پر شده با 200 لیتر آب فیلتر شده و هوادهی شده دریا) منتقل شدند. پیش از شروع آزمایش، دوره سازگاری ده روزه، به منظور آداپته شدن ماهیان با شرایط آزمایشگاهیدر نظر گرفته شد (2). در طی دوره سازگاری و دوره آزمایش هیچ گونه غذادهی به ماهیان صورت نگرفت (23). در طول این زمان، پارامترهای شیمیایی آب (دما، شوری و pH) به طور منظم اندازه گیری و ثبت می گشت؛ همچنین، روزانه دوسوم حجم آب هر تانک با سیفون کردن از کف تانک ها خارج می شد، تا از تجمع مواد زائد در آب جلوگیری گردد (23

 

).

 

جهت انجام این مطالعه ماهیان هامورمعمولی، به طور تصادفی در 7 تیمار قرار داده شدند. در تیمار شاهد هیچ تزریقی انجام نشد. در ماهیان تیمار شاهد حلال، روغن نارگیل به صورت درون صفاقی تزریق شد(جهت ارزیابی اثرات احتمالی روغن نارگیل). در تیمار باکتری نیز، تزریق غلظت cfu/ml 10⁷ از باکتری V. alginolyticusصورت گرفت. در گروه های 4 و 5 به ترتیب غلظت های mg/kg 20 و 200 بنزوآلفاپایرن به صورت درون صفاقی تزریق شد. ماهیان در تیمار 6، علاوه بر دریافت درون صفاقی mg/kg 20 بنزوآلفاپایرن، غلظت cfu/ml 10⁷ باکتری V. alginolyticusرا نیز دریافت کردند. در تیمار 7 نیز، تزریق mg/kg 200 کیلوگرم بنزوآلفاپایرن و غلظت cfu/ml 10⁷ از باکتری                V. alginolyticusبه صورت درونصفاقی انجام شد (23). در این مطالعه، از گرانول های جامد زردرنگ BaP  (Aldrich, USA) با خلوص بالای 97% استفاده شد. محلول استوک این ترکیب، از حل کردن میزان معینی از BaP در روغن نارگیل تهیه شد و سپس غلظت های 20 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم بنزوآلفاپایرن، آماده گردید (17). در روز اول آزمایش، غلظت های مذکور بوسیله سرنگ انسولین و به صورت درون صفاقی به ماهیان تزریق شد. همچنین باکتری V. alginolyticus نیز به صورت لئوفیلیزه تهیه گردید و در بافرفسفات به حجم 20 میکرولیتر رسید. سوسپانسیون آماده شده از باکتری، 48 ساعت پس از تزریق بنزوآلفاپایرن، به ماهیان تزریق گردید. طول دوره آزمایش، از زمان تزریق باکتری به مدت 14 روز در نظر گرفته شد، زیرا بنا بر گزارشات موجود، این دوره زمانی برای پیشرفت بیماری ویبریوزیس کافی می باشد. در طول این مدت، وضعیت زنده ماندن و مرگ و میر ماهیان کنترل گردید و تغییرات غیرطبیعی در فاکتورهای وضعیتی (طول و وزن) یا رفتاری ماهیان (شنای غیرنرمال و بی هدف، فعالیت زیاد یا کاهش اشتها) بررسی و کنترل شد (19). در روزهای 1، 4، 7 و 14 نمونه گیری از بافت کلیه تمام ماهیان هامور معمولی انجام شد. بافت کلیه ماهیان مورد مطالعه، به آرامی و با دقت، به وسیله یک پنس ظریف از بافت های اطراف جدا گردید و پس از تثبیت در بافرفرمالین، به منظور آبگیری، شفاف کردن و آغشتگی به پارافین، به دستگاه تمام اتوماتیک هیستوکینت، مدل (RX-11B, Tissue tek rotary, japan) منتقل شد. پس از آن، مقاطع 6-5 میکرومتری از قالب های پارافینی توسط دستگاه میکروتوم مدل (2245LEICA-RM ) تهیه گردید و مورد رنگ آمیزی عمومی هماتوکسیلین- ائوزین (H&E) قرار گرفت. جهت بررسی هیستوپاتولوژیک مقاطع بافتی رنگ آمیزی شده، از بزرگ نماییهای مختلف میکروسکوپ نوری Olympus استفاده و تصاویر مناسب توسط دوربین مجهز به نرم افزارDino capture  تهیه و ذخیره شد.

 

مراجع

منابع:

1- سلطانی، م. 1376. بیماری های باکتریایی ماهی. انتشارات سازمان دامپزشکی کشور با همکاری موسسه نشر جهاد وابسته به جهاد کشاورزی. صفحه21تا23، 175 تا 188.

2- موحدی نیا، ع. 1388. مکانیسم های تنظیم اسمزی در ماهی شانک (Acanthopagrus latus). (مطالعه اکوفیزیولوژیکی، بافت شناختی و فراساختاری آبشش). پایان نامه دکتری رشته بیولوژی دریا گرایش جانوران دریا. دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر.112 صفحه.

3- Aas, E., Beyer, J and Goksoyr, A., 2000. Fixed wavelength fluorescence (FF) of bile as a monitoring tool for polyaromatic hydrocarbon exposure in fish: an evaluation of compound specificity, inner filter effect and signal interpretation. Biomarkers, 5(1), 9-23.

 

4- Arkoosh, M. R., Casillas, E., Clemons, E., Kagley, A. N., Olson, R., Reno, P and Stein, J. E., 1998. Effect of pollution on fish diseases: potential impacts on salmonid populations. Journal of Aquatic Animal Health, 10(2), 182-190.

 

5- Assadi, H., and Dehghani, R., 1997. Atlas of the Persian Gulf and the Sea of Oman fishes. Iranian Fisheries Research Organization Publication, Tehran, 226p.

 

6- Buttgereit, F., Burmester, G. R and Brand, M. D., 2000. Bioenergetics of immune functions: fundamental and therapeutic aspects. Immunology today, 21(4), 194-199.

 

7- Carlson, E. A., Li, Y and Zelikoff, J. T., 2002. Exposure of Japanese medaka (Oryzias latipes) to benzo [a] pyrene suppresses immune function and host resistance against bacterial challenge. Aquatic Toxicology, 56(4), 289-301.

 

8- Deane, E. E., Li, J and Woo, N. Y., 2004. Modulated heat shock protein expression during pathogenic Vibrio alginolyticus stress of sea bream. Diseases of aquatic organisms, 62(3), 205-215.

 

9- Giari, L., Simoni, E., Manera, M and Dezfuli, B. S., 2008. Histo-cytological responses of Dicentrarchus labrax (L.) following mercury exposure. Ecotoxicology and environmental safety, 70(3), 400-410.

 

10- Grundy, M. M., Ratcliffe, N. A and Moore, M. N., 1996. Immune inhibition in marine mussels by polycyclic aromatic hydrocarbons. Marine Environmental Research, 42(1-4), 187-190.

 

11- Haaparanta, A., Valtonen, E. T., Hoffmann, R and Holmes, J., 1996. Do macrophage centres in freshwater fishes reflect the differences in water quality?. Aquatic Toxicology, 34(3), 253-272.

 

12- Hannam, M. L., Bamber, S. D., Galloway, T. S., Moody, A. J and Jones, M. B., 2010. Effects of the model PAH phenanthrene on immune function and oxidative stress in the haemolymph of the temperate scallop Pecten maximus. Chemosphere, 78(7), 779-784.

 

13- Holt, J., Hothem, S., Howerton, H., Larson, R and Sanford, R., 2005. 9, 10-Phenanthrenequinone photoautocatalyzes its formation from phenanthrene, and inhibits biodegradation of naphthalene. Journal of environmental quality, 34(2), 462-468.

 

14- Kakkar, P. H., Saxena, R. M., Rathee, N. S and Joshi, M., 2011. Water soluble fraction of diesel fuel induced histopathological alterations in the liver of Channa punctatus. Toxicology international, 18(1), 14.

 

15- Livingstone, D.R., Donkin, P and Walker, C.H., 1992. Pollutants in marine ecosystems: an overview. In: Walker, C.H., Livingstone, D.R. (Eds.), Persistent Pollutants in Marine Ecosystems. Pergamon, Setac special publication, Oxford, pp: 235–263.

 

16- Mohamed, F. A., 2009. Histopathological studies on Tilapia zillii and Solea vulgaris from Lake Qarun, Egypt. World Journal of Fish and Marine Sciences, 1(1), 29-39.

 

17- Nahrgang, J., Camus, L., Gonzalez, P., Goksøyr, A., Christiansen, J. S and Hop, H., 2009. PAH biomarker responses in polar cod (Boreogadus saida) exposed to benzo (a) pyrene. Aquatic Toxicology, 94(4), 309-319.

 

18- Oliveira, R. C., Fanta, E., Turcatti, N. M., Cardoso, R. J and Carvalho, C. S., 1996. Lethal effects of inorganic mercury on cells and tissues of Trichomycterus brasiliensis (Pisces; Siluroidei). Biocell: official journal of the Sociedades Latinoamericanas de Microscopia Electronica... et. al, 20(3), 171-178.

 

19- Prosser, C. M., Unger, M. A and Vogelbein, W. K., 2011. Multistressor interactions in the zebrafish (Danio rerio): Concurrent phenanthrene exposure and Mycobacterium marinum infection. Aquatic toxicology, 102(3), 177-185.

 

20- Suresh, N., 2009. Effect of cadmium chloride on liver, spleen and kidney melano macrophage centres in Tilapia mossambica. Journal of Environmental Biology, 30(4): 505-508.

 

21- Teh, S. J., Adams, S. M and Hinton, D. E., 1997. Histopathologic biomarkers in feral freshwater fish populations exposed to different types of contaminant stress. Aquatic Toxicology, 37(1), 51-70.

 

22- Thophon, S., Kruatrachue, M., Upatham, E. S., Pokethitiyook, P., Sahaphong, S and Jaritkhuan, S., 2003. Histopathological alterations of white sea bass, Lates calcarifer, in acute and subchronic cadmium exposure. Environmental Pollution, 121(3), 307-320.

 

23- Wang, C., Zhao, Y., Zheng, R., Ding, X., Wei, W., Zuo, Z and Chen, Y., 2006. Effects of tributyltin, benzo [a] pyrene, and their mixture on antioxidant defense systems in Sebastiscus marmoratus. Ecotoxicology and environmental safety, 65(3), 381-387.

 

24- Wang, X. H and Leung, K. Y., 2000. Biochemical characterization of different types of adherence of Vibrio species to fish epithelial cells. Microbiology, 146(4), 989-998