تأثیر سطوح مختلف اسیدآمینه سیستئین بر کیفیت اسپرم و توان آنتی-اکسیدانی تام پلاسمای منی در قوچ عربی

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 1، دوره 12، شماره 1 - شماره پیاپی 44، دی 1397، صفحه 1-12   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

زهرا یوسف زاده¹؛ صالح طباطبائی وکیلی^{* 1}؛ مرتضی مموئی¹؛ مهدی زارعی²

¹فیزیولوژی دام، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان، اهواز، ایران.

²گروه بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهید چمران اهواز، اهواز، ایران.

چکیده

زمینه وهدف:طی نگه­داری منی،آسیب­های ناشی از اکسیداسیون از علل مهم کاهش کیفیت اسپرم­ها محسوب می­شود.هدف از مطالعه حاضر، بررسی تأثیر افزودن سطوح مختلف اسیدآمینه سیستئین به رقیق­کننده بر خصوصیات منی قوچ عربی تحت شرایط نگهداری به صورت مایع بود.
روش کار: اسپرم‏گیری از 10رأس قوچ عربی به طور هفتگی برای 8 هفته انجام و منی آن­ها بلافاصله با هم مخلوط و رقیق­سازی شد. نمونه­ها به 5 قسمت تقسیم و سطوح مختلف سیستئین را دریافت نمودند. تیمارها شامل سطوح صفر، 5، 10، 15 و20 میلی­مول سیستئین در رقیق کننده منی بودند. در زمان­های مختلف نگهداری منی(1، 12، 24، 36 و 48 ساعت)، فراسنجه‏های کیفی منی بررسی شدند.
یافته­ها: در تمام زمان­های نگه­داری منی، میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم در تیمارهای سیستئین بهبود یافت(05/0>P). 24 و 36 ساعت پس از نگه­داری منی، زنده­مانی اسپرم­ها در سطوح 5، 10 و 15 میلی­مول سیستئین بهبود یافت. در زمان­های 36 و 48 ساعت، سطوح 5 و 10 میلی­مول سیستئین موجب کاهش میزان ناهنجاری­های اسپرم شدند(05/0>P). 48 ساعت پس از نگه­داری منی، میزان تحرک پیش­رونده و زنده­مانی اسپرم در سطوح 5 تا 15 میلی­مولسیستئین افزایش یافت. بیشترین میزان توان­آنتی­اکسیدانی تام پلاسمای منی در زمان­های یک و 24 ساعت، مربوط به سطوح 15 و 20 میلی­مول سیسئین بود(05/0>P). 
نتیجه‌گیری: با افزایش زمان نگه­داری منی قوچ عربی، سطوح پایین سیستئین(کمتر از 15 میلی­مول) باعث بهبود اغلب فراسنجه­های کیفی اسپرم شدند. اما میزان توان آنتی­اکسیدانی تام پلاسمای منی در سطوح بالاتر سیستئین(15 و 20 میلی­مول) افزایش یافت.

کلیدواژه‌ها

برون‌تنی؛ سیستئین؛ کیفیت منی؛ قوچ

اصل مقاله

مقدمه

 

نگه­داری اسپرم در دوره‏های کوتاه و بلند مدت می‏تواند کمک موثری در موفقیت تلقیح مصنوعی که در مقایسه با آمیزش طبیعی دارای مزایای زیادی است، داشته باشد. ذخیره و نگه­داری مناسب اسپرم، انتقال موفقیت آمیز اسپرم را از مناطق دورتر تسهیل کرده و گسترش استفاده از ذخایر ژنتیکی بهتر را امکان پذیر می‏سازد. اما معمولاً اسپرماتوزوئیدها در طی نگه­داری دچار استرس حرارتی شده و در دماهای پایین و بالا با کاهش خواص حیاتی خود مثل تحرک و زنده مانی روبه‏رو می‏شوند، این امر یک عامل نامطلوب در توسعه استفاده از تلقیح مصنوعی است. یک رقیق کننده مطلوب حجم منی را زیاد کرده و سبب نگه­داری و افزایش طول عمر اسپرم می‏گردد(24). از ابتدای به کارگیری تکنیک تلقیح مصنوعی، رقیق کننده‏های مختلفی جهت نگه­داری منی در شرایط مایع و منجمد استفاده شده است. به دلیل فقدان یک منبع پروتئینی در ترکیب رقیق کننده تریس امکان دارد که افزودن یک منبع پروتئینی موجب بهبود کیفی اسپرم قوچ در شرایط نگه­داری مایع و منجمد شود(16). رقیق کننده‏ها علاوه بر این که اسپرم را هنگام خنک کردن محافظت می‏کنند، منبع مهمی از مواد مغذی برای متابولیسم اسپرم فراهم آورده و از تغییرات pH جلوگیری می‏کنند(33، 25، 21). سیستئین اسید آمینه ای با وزن مولکولی پایین حاوی تیول بوده که پیش­ساز گلوتاتیون داخل سلولی می باشد. سیستئین به راحتی از غشای سلول وارد شده و باعث افزایش بیوسنتز گلوتاتیون داخل سلولی هم در برون تنی و هم درون تنی و محافظت لیپیدها و پروتئین های غشایی به علت خواص خنثی کنندگی غیر مستقیم رادیکال های آزاد می شود. گفته شده که سنتز گلوتاتیون در شرایط برون تنی ممکن است به علت کمبود سیستئین در محیط کشت دچار نقص شود که این امر به علت ناپایداری بالای گلوتاتیون و اکسیده شدن خود به خودی آن به سیستئین می باشد. سیستئین اثر محافظتی در برابر یک پارچگی عملکرد آکروزوم و میتوکندری در برابر انجماد داشته و فعالیت حرکتی اسپرم را بعد از خروج از انجماد بهبود می بخشد. اثبات شده که تیول­هایی از قبیل گلوتاتیون و سیستئین مانع از دست رفتن فعالیت حرکتی اسپرم در مایع منی گاو بعد از یخ گشایی شده و باعث بهبود قابلیت بقاء، حفظ ساختار کروماتین و یک پارچگی غشای اسپرم خوک، در طی ذخیره مایع منی می شود(13). سیستئین در رقیق کننده منی با جلوگیری از پراکسیداسیون لیپید به وسیله متابولیت­های فعال اکسیژن از کاهش جنبایی اسپرم گاو ممانعت می‌کند(5). آمینو­اسید سیستئین شامل گروه­های تیولی(SH-) است که یک رده بزرگی از آنتی اکسیدان­ها هستند(11). مکانیسم‏های خاصی برای استفاده از آمینواسیدها برای ایجاد مقاومت در برابر تنش سرمایی وجود دارد. آمینواسیدها(به عنوان مثال سیستئین) نقش مهمی در جلوگیری از رسوب پروتئین‏های غشا در طول ذخیره اسپرم، هم چنین در افزایش پتانسیل محافظت اسپرم در برابر شوک سرمایی اسپرم بز دارند(22، 18). سیستئین نقش مهمی در حفاظت از دناتوره شدن پروتئین­های ماهیچه ماهی در طول ذخیره انجمادی داشته و قابلیت حفاظت از انجماد اسپرم بز دارد(19). محققین اثبات کرده­اند که آمینواسیدها در خارج سلول عمل می­کنند و جنبایی، سلامت آکروزوم و توان باروری اسپرم اسب، انسان و میمون را بعد از فرآیند انجماد یخ­گشایی بهبود می­دهند(18). سیستئین زنده­مانی اسپرم خوک را پس از سردسازی افزایش داد. هم چنین، سیستئین به شکل N- استیل- L- سیستئین قابلیت بیشتری برای جلوگیری از مرگ برنامه ریزی شده(آپوپتوزیس) سلول اسپرم در مجاری لوله­های منی­ساز بیضه انسان دارد(14). رادیکال­های تیول موجود در آمینواسید سیستئین از اثر کاهشی پراکسید هیدروژن بر جنبایی اسپرم گاو بعد از یخ­گشایی جلوگیری می­کند(5). هدف از مطالعه­ی حاضر، بررسی تأثیرافزودن سطوح مختلف اسید­آمینه سیستئین به رقیق­کننده، بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و توان آنتی­اکسیدانی تام پلاسمای منی قوچ عربی متعاقب نگه­داری منی به حالت مایع بود.

مواد و روش­ها

اسپرم­گیری و رقیق­سازی منی

پژوهش حاضر در ایستگاه دامپروری دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی رامین خوزستان واقع در 35 کیلومتری شهر اهواز با استفاده از 10 راس قوچ نژاد عربی با متوسط سن 5/2 سال و تحت برنامه تغذیه­ای و مدیریت یکسان در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام گرفت. در فصل تولیدمثلی، اسپرم­گیری به طور هفتگی برای مدت 8 هفته توسط تحریک الکتریکی با الکترو اجا کولاتور انجام و منی جمع­آوری شده از قوچ­ها به منظور حذف اثرات فردی بلافاصله با هم مخلوط و به نسبت 1 به 10 در رقیق کننده پایه تریس(تریس 63/3 گرم، فروکتوز 5/0 گرم، اسید سیتریک 99/1 گرم، زرده تخم مرغ 14 میلی­لیتر و آب مقطر 100 میلی­لیتر) رقیق سازی شد.

تیمارهای آزمایشی

نمونه­های انزال مخلوط و رقیق شده به 5 قسمت تقسیم و هر کدام سطح مختلف سیستئین(صفر یا شاهد، 5، 10، 15 و 20میلی­مول) را دریافت کردند. در زمان­های مختلف نگه­داری منی رقیق­شده حاوی تیمارهای آزمایشی(یک، 12، 24، 36 و 48 ساعت) به صورت مایع تحت دمایC ^°5، فراسنجه‏های کیفی منی بررسی شدند.

ارزیابی فراسنجه­ها

تحرک پیش­رونده اسپرم: برای ارزیابی تحرک پیش­رونده اسپرم­ها، 5 میکرولیتر از منی رقیق شده بر روی لام گرم قرار داده شده و پس از لامل­گذاری، تحت میکروسکوپ نوری با بزرگنماییX400 در چند میدان درصد تحرک پیشرونده اسپرم­ها بررسی  قرار گرفته و میانگین حاصل به عنوان درصد تحرک پیشرونده ثبت گردید(27).

زنده­مانی اسپرم: جهت بررسی درصد اسپرم­های زنده و مرده از رنگ­آمیزی ائوزین- نیگروزین با حل کردن 67/1 گرم ائوزینY، 10 گرم نیگروزین و 9/2 گرم سیترات سدیم در 100 میلی­لیتر آب مقطر استفاده شد.، تحت بزرگنمایی X1000 میکروسکوپ نوری و با استفاده از روغن ایمرسیون انجام گردید. اسپرم­های مرده رنگ ائوزین را به خود جذب کرده و به رنگ صورتی دیده شدند، اما اسپرم­های زنده رنگ را به خود جذب نکرده و سفید رنگ ماندند(32)(شکل 1).

ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم: درصد اسپرم­های ناهنجار در نمونه­های رنگ­آمیزی شده باائوزین- نیگروزین تحت بزرگ­نماییX1000 میکروسکوپ با استفاده از روغن ایمرسیون و شمارش حداقل 200 اسپرم در هرلام تعیین شد(32)(شکل 2).

سلامت غشای پلاسمایی اسپرم:برای بررسی سلامت غشای پلاسمایی اسپرم یا آزمون HOST(Hypo osmotic swelling test) از محلول هیپواسموتیک استفاده شد. واکنش اسپرم­ها به محیط هیپواسمول(شامل 9 گرم در لیتر فروکتوز و 9/4 گرم در لیتر سیترات سدیم) به صورت تورم دم یا دم پیچ خورده است. در این حالت اسپرم­هایی که غشای پلاسمایی سالمی دارند به محلول واکنش نشان می­دهند، ولی اسپرم های ناسالم بدون واکنش باقی می­مانند. برای این منظور، 10 میکرولیتر نمونه­ منی با 100 میکرولیتر محیط هیپواسموتیک مخلوط و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردید. پس از تهیه گسترش بر روی لام، با استفاده از میکروسکوپ نوری تحت بزرگنمایی X400 مورد بررسی قرار گرفت(12)

pH منی: ارزیابی میزان pH منی طی زمان­های مختلف پس از نگه­داری منی در هر کدام از تیمارهای آزمایشی با استفاده از pH متر با دقت بالا انجام شد.

توان آنتی اکسیدانی تام پلاسمای منی(TAC):در زمان اول(یک ساعت) و آخر(24 ساعت) نگه­داری منی، توان آنتی اکسیدانی تام پلاسمای منی(TAC) به روش Ferric Reducing Ability of Plasma یاFRAP (توانایی پلاسما در احیای یون‌های فریک) اندازه­گیری گردید(4). در این آزمایش ابتدا محلول کار Frap به صورت زیر تهیه شد. میزان 10 میلی‌لیتر بافر استات با یک میلی‌لیتر از ماده تری­پریدیل- اس- تری­آذیل(TPTZ) محلول در اسیدکلریدریک مخلوط شد. سپس به محلول فوق یک میلی‌لیتر محلول کلرید فریک افزوده گردید. پس از تهیه محلول کار 400 سی‌سی محلول Frap به پلاسمای منی اضافه و نمونه‌ها به مدت 15 دقیقه در انکوباتور قرار داده شدند. با احیای یون‌های آهن فریک به آهن فرو در نمونه، کمپلکس آبی رنگ ایجاد می‌شود. پس از آن، میزان جذب نوری آن­ها به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج 593 نانومتر اندازه‌گیری شد(4).

تحلیل آماری

نتایج به دست آمده از پژوهش حاضر، با استفاده از برنامه­ نرم­افزار آماری SPSS(ویرایش 16) مورد آنالیز قرار گرفت. جهت بررسی فراسنجه­های کیفی منی در هر زمان بین تیمارها از تحلیل واریانس یک­طرفه(one way ANOVA) و آزمون مقایسه­ای چند دامنه­دانکن در سطح 5% استفاده و تعداد تکرار برای هر تیمار، هشت واحد آزمایش در نظر گرفته شد. مدل آماری طرح به قرار زیر می­باشد:Y_{Ij =} µ + T_i +Ɛ_ij

Yij مقدار صفت اندازه‌گیری شده، μ میانگین صفت در جامعۀ مورد نظر، ai اثر سطوح سیستئین و eij اثر خطای آزمایشی است.

نتایج

تاثیر افزودن سطوح مختلف سیستئین به منی قوچ عربی بر فراسنجه­های کیفی اسپرم و pH منی در زمان­های یک، 12، 24، 36 و 48 ساعت پس از نگه­داری منی به حالت مایع در C^°5 در جداول 1 تا 5 ارائه شده است.

یک ساعت پس از نگهداری منی: میزان تحرک پیش­رونده، زنده­مانی، ناهنجاری مورفولوژیکی اسپرم و نیز pH منی در بین تیمارهای آزمایشی تفاوت معنی­داری نداشتند(05/0<P). اما، درصد اسپرم­های با غشای پلاسمایی سالم در تمام سطوح سیستئین به طور معنی­داری بیشتر از شاهد بودند(05/0>P) (جدول 1).

12 ساعت پس از ذخیره منی: کم­ترین میزان تحرک پیش­رونده­ی اسپرم متعلق به سطح 20 میلی­مول سیستئین بود(05/0>P). در همین زمان، میزان زنده­مانی اسپرم بین تیمارهای آزمایشی و شاهد اختلاف معنی­داری نداشتند(05/0<P)، اما درصد اسپرم­های زنده در تیمارهای حاوی 5 و 10 میلی­مول سیستئین به طور معنی­داری بیشتر از سطح 20 میلی­مول این آمینو اسید بود(05/0>P). هم­چنین در این زمان، گروه شاهد کم­ترین میزان سلامت غشای پلاسمایی اسپرم را در مقایسه با تیمارهای سیستئین نشان داد(05/0>P). در زمان 12 ساعت، ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم و pH منی تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفتند(05/0<P)(جدول 2).

24 ساعت پس از نگهداری منی: کم­ترین میزان تحرک پیش­رونده­ی اسپرم و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم به ترتیب در تیمار 20 میلی­مول سیستئین و شاهد مشاهده شدند(05/0>P). میزان زنده­مانی اسپرم در تیمارهای حاوی 5، 10 و 15 میلی­مول سیستئین به طور معنی­داری بیشتر از شاهد و سیستئین 20 میلی­مول بود(05/0>P). هم­چنین در این زمان، سطوح 5، 10 و 15 میلی­مول سیستئین موجب کاهش میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم در مقایسه با شاهد شدند(05/0>P). pH منی اختلاف آماری معنی­داری در بین تیمارها نداشت(05/0<P)(جدول3).

 

 

 

 

 

 

 

 

   اسپرم زنده (بدون رنگ)                                                                       اسپرم زنده (بالا) و اسپرم مرده (پایین)

شکل 1- اسپرماتوزوئیدهای زنده و مرده در بزرگ­نمایی 1000× میکروسکوپ نوری (رنگ­آمیزیائوزین- نیگروزین)

 

 

اسپرم با مورفولوژی طبیعی                                                          اسپرم با مورفولوژی ناهنجار

شکل 2- اسپرماتوزوئیدهای با مورفولوژی طبیعی و ناهنجار در بزرگ­نمایی 1000× میکروسکوپ نوری (رنگ­آمیزیائوزین- نیگروزین)

 

جدول 1-تأثیر سطوح مختلف سیستئین(میلی مول) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم (%) و اسیدیته منی قوچ عربی (1 ساعت پس از نگه­داری منی در C^°5).

تیمارها	تحرک پیش­رونده	زنده‏مانی	ناهنجاری مورفولوژیکی	سلامت غشای پلاسمایی	pH
شاهد	50/1± 40/92	28/1± 80/94	68/0± 40/4	b00/2± 00/53	18/0± 22/7
سیستئین5	70/0± 20/91	50/1± 60/95	36/0± 00/4	a 00/2± 00/72	23/0± 40/7
سیستئین 10	50/1 ± 40/92	52/1± 00/96	49/0± 20/4	a 87/1± 00/71	17/0± 26/7
سیستئین 15	84/1 ± 00/93	50/1± 60/95	40/0± 40/4	a 39/3± 00/67	19/0± 30/7
سیستئین 20	50/1 ± 60/93	44/1± 62/95	32/0± 00/4	a74/4± 00/65	06/0± 42/7

a-bتفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2-تأثیر سطوح مختلف سیستئین(میلی مول) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم(%) و اسیدیته منی قوچ عربی(12 ساعت پس از نگه­داری منی در C^°5).

تیمارها	تحرک پیشرونده	زنده‏مانی	ناهنجاری مورفولوژیکی	سلامت غشای پلاسمایی		pH
شاهد	30/4± 00/76a	90/4± 00/77ab	58/0± 80/5	b15/5± 00/42	18/0± 12/7
سیستئین 5	41/12± 00/73a	00/4± 00/91a	24/0± 40/5	a74/3± 00/58	15/0± 24/7
سیستئین 10	99/6± 60/87a	22/5± 80/90a	24/0± 40/5	a00/2± 00/62	18/0± 30/7
سیستئین 15	55/12± 40/73a	05/12± 20/83ab	37/0± 20/6	a45/2± 00/59	17/0± 22/7
سیستئین 20	88/12± 00/36b	98/11± 00/69b	55/0± 00/7	a32/3± 00/56	13/0± 32/7

a-b : تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است(05/0P<).

 

 

جدول 3-تأثیر سطوح مختلف سیستئین(میلی مول) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم(%) و اسیدیته منی قوچ عربی(24 ساعت پس از نگهداری منی در C^°5).

تیمارها	تحرک پیش­رونده		زنده‏مانی	ناهنجاری مورفولوژیکی	سلامت غشای پلاسمایی	pH
شاهد		a74/3± 00/52	b82/3± 00/51	a34/1± 00/10	b74/3± 00/27	17/0± 10/7
سیستئین 5		a 88/7± 40/75	a00/2± 00/88	c67/0± 60/6	a70/5± 00/55	17/0± 46/7
سیستئین 10		a68/7± 40/71	a34/3± 40/85	bc84/0± 00/7	a47/4± 00/60	18/0± 38/7
سیستئین 15		a79/11± 00/67	a11/11±00/79	bc51/0± 40/7	a57/5± 00/56	16/0± 20/7
سیستئین 20		b38/12± 40/22	b69/9± 00/48	ab81/0± 60/9	a96/6± 00/54	15/0± 30/7

a-c: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

36 ساعت پس از نگه­داری منی: میزان تحرک پیش­رونده­ی اسپرم در تیمارهای دارای سیستئین اختلاف معنی­داری با شاهد نداشت(05/0<P). در همین زمان، سطوح 5، 10 و 15 میلی­مول سیستئین باعث بهبود میزان زنده­مانی اسپرم نسبت به شاهد شدند(05/0>P). هم­چنین، کاهش معنی­داری در میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم برای سطوح 5 و 10 میلی­مول سیستئین در مقایسه با شاهد مشاهده شد(05/0>P). در زمان 36 ساعت، تمام سطوح به کار رفته سیستئین موجب بهبود سلامت غشای پلاسمایی اسپرم نسبت به شاهد شدند(05/0>P). سطوح مختلف سیستئین تاثیر معنی­داری بر pH منی نداشتند(05/0<P)(جدول 4).

48 ساعت پس از نگه­داری منی: سطوح 5، 10 و 15 میلی­مول سیستئین باعث بهبود میزان تحرک پیش­رونده و زنده­مانی اسپرم نسبت به شاهد شدند(05/0>P). هم چنین، میزان ناهنجاری­های مورفولوژیکی اسپرم کم­تری در سطوح 5 و 10 میلی­مول سیستئین در مقایسه با شاهد یافت شد(05/0>P). در زمان 48 ساعت، کم­ترین سلامت غشای پلاسمایی اسپرم متعلق به شاهد بود(05/0>P). همانند زمان­های قبل، میزان pH منی تحت تاثیر تیمارهای آزمایشی قرار نگرفت (05/0<P) (جدول 5).

توان آنتی اکسیدانی تام پلاسمای منی:تاثیر افزودن سطوح مختلف سیستئین به منی قوچ عربی بر توان آنتی اکسیدانی تام پلاسمای منی در زمان­های اول(1 ساعت) و پایانی(48 ساعت) پس از نگه­داری منی به حالت مایع در جدول 6 مشاهده می­شود. در اولین و آخرین زمان نگه­داری منی، سطوح 15 و 20 میلی­مول سیستئین باعث افزایش توان آنتی­اکسیدانی تام

 

پلاسمای منی نسبت به شاهد شدند(05/0>P)(جدول6).

 

 

جدول 4- تأثیر سطوح مختلف سیستئین(mmol) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم(%) و اسیدیته منی قوچ عربی(36 ساعت پس از نگه­داری منی در C^°5).

تیمارها		تحرک پیشرونده	زنده‏مانی	ناهنجاری مورفولوژیکی	سلامت غشایپلاسمایی		pH
شاهد	78/6± 00/44abc		04/6± 00/48c	75/0± 60/10a	67/3± 00/21b	16/0± 16/7
سیستئین 5	90/12± 00/67ab		06/4± 00/87a	81/0± 40/7b	20/6± 00/44a	19/0± 40/7
سیستئین 10	41/10± 00/71a		45/2± 00/86a	71/0± 00/7b	06/4± 00/52a	08/0± 32/7
سیستئین 15	84/16± 00/54abc		76/11± 00/76ab	73/0± 20/8ab	12/6± 00/50a	16/0± 14/7
سیستئین 20	58/7± 00/20c		51/8± 00/55bc	93/0± 40/10a	84/7± 00/42a	16/0± 28/7

a-c: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

جدول 5- تأثیر سطوح مختلف سیستئین (mmol) بر فراسنجه­های کیفی اسپرم (%) و اسیدیته منی قوچ عربی (48 ساعت پس از نگهداری منی در C^°5).

تیمارها	تحرک پیشرونده		زنده‏مانی	ناهنجاری مورفولوژیکی	سلامت غشای پلاسمایی	pH
شاهد		87/3± 00/25c	18/7± 00/43c	89/0± 00/12a	87/3± 00/15b		14/0± 96/6
سیستئین 5		a30/11± 50/54	80/3± 40/81a	60/0± 60/7b	90/4± 00/43a		17/0± 06/7
سیستئین 10		81/12 ± 75/53a	87/1± 00/81a	80/0± 20/8b	36/4± 00/48a		21/0± 06/7
سیستئین 15		73/11 ± 00/50ab	67/3± 00/81a	02/1± 80/8ab	52/7± 00/47a		20/0± 96/6
سیستئین 20		35/7 ± 00/12c	10/12± 00/58bc	39/1± 80/10ab	30/4± 00/39a		17/0± 04/7

a-c: تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

جدول 6- تأثیر سطوح مختلف سیستئین(mmol) بر توان آنتی­اکسیدانی تام پلاسمای منی(mol/mlµ) قوچ عربی در زمان­های 1 و 48 ساعت پس از نگه­داری منی در C^°5.

تیمارها	زمان 1 ساعت	زمان 48 ساعت
شاهد	c66/56±00/403	c45/53± 33/468
سیستئین 5	bc55/48± 67/454	c69/78± 00/465
سیستئین 10	bc72/75± 00/551	abc41/75± 67/633
سیستئین 15	b03/83± 67/653	ab65/129± 33/686
سیستئین 20	a64/103± 00/878	a05/63± 00/768

a-c         : تفاوت میانگین­ها (± خطای معیار) با حروف نامشابه در هر ستون معنی­دار است (05/0P<).

بحث و نتیجه­گیری

مطالعه حاضر نشان داد که افزودن اسیدآمینه سیستئین به عنوان یک آنتی­اکسیدان به رقیق کننده منی قوچ عربی باعث بهبود فراسنجه­های کیفی اسپرم متعاقب نگه­داری منی به حالت مایع در C^°5 شده و از آسیب­های ناشی از نگه داری منی محافظت نمود. مشابه با این یافته­ها، در بررسی اثر آنتی­اکسیدان­های سیستئین، اسید­آسکوربیک و هیپوتارین بر اسپرم بز بوئر مشاهده شد که آنتی­اکسیدان­های فوق سبب بهبود میزان زنده­مانی، سلامت غشای پلاسمایی و سلامت آکروزوم اسپرم شدند، طوری که غلظت­های 5 میلی­مول سیستئین و 10 میلی­مول هیپوتارین سبب بهبود فراسنجه­های فوق گردیدند(23). در مطالعه­ی Khalili و همکاران(2010) که در آن اثر غلظت­های مختلف اسید­های آمینه سیستئین و گلیسین، بر اسپرم قوچ مغانی در شرایط انجماد بررسی شد، مشاهده گردید که این دو اسید­آمینه سبب بهبود قابل توجه حرکت پیش­رونده­ی اسپرم، زنده­مانی و یک­پارچگی غشای آکروزوم اسپرم قوچ شدند، طوری که از بین سطوح 5، 10، 15 و 20 میلی­مول سیستئین و گلیسین به کار رفته، مقادیر 10 و 15 میلی­مول سیستئین نسبت به شاهد سبب بهبود قابل توجه حرکت، زنده­مانی و سلامت غشای اسپرم گردیدند(17،31). Topraggaleh و همکاران (2014)، با بررسی اثر اسیدآمینه­های سیستئین و گلوتامین بر فراسنجه­های کیفی اسپرم گاومیش پس از انجماد گزارش کردند که سیستئین و گلوتامین به طور قابل توجهی سبب بهبود تحرک و سلامت غشای پلاسمایی پس از انجماد شده اند، طوری که سیستئین در غلظت 5/7 میلی­مول افزایش حرکت پیش­رونده اسپرم را موجب گردید. اثر اسیدهای آمینه­ی سیستئین و تورین بر کیفیت اسپرم گاو نر مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده شد، که افزودن سیستئین سبب افزایش تحرک اسپرم شده و موجب بهبود میزان سلامت آکروزوم و ناهنجاری اسپرم شده است، اسیدآمینه­ی تورین نیز سبب افزایش تحرک اسپرم گردید (30، 27). طی پژوهشی که درآن اثرات اسیدهای آمینه­ی گلوتامین، گلیسین، آلانین و سیستئین بر اسپرم گاومیش نر پس از انجماد بررسی شد، نتیجه به این صورت بود که پس از انجماد، دو اسید آمینه­ی گلوتامین و گلیسین اثرات مثبتی روی میزان تحرک اسپرم، یک­پارچگی آکروزوم و سلامت غشای اسپرم داشته­اند، طوری­که غلظت 25 میلی­مولار این اسیدهای آمینه و هم چنین غلظت 5 میلی­مولار سیستئین سبب افزایش تحرک، یک­پارچگی آکروزوم و غشای اسپرم شده و نیز ثابت شد که غلظت­های بالاتر مانند 100 میلی­مولار سبب کاهش معنی­دار تحرک، یک­پارچگی غشای اسپرم و آکروزومی می گردد(10). در مطالعه ما نیز بالاترین سطح به کار رفته سیستئین یعنی 20 مول آن تاثیر معنی­داری بر بیشتر فراسنجه­های کیفی اسپرم طی ذخیره منی قوچ عربی به حالت مایع نداشت. اما افزودن سطوح کمتر آن به منی یعنی 5، 10 و 15 میلی­مول سیستئین، این فراسنجه­ها را بهبود دادند. در تحقیقی، سیستامین، جنبایی و ظرفیت آنتی اکسیدانی اسپرم قوچ را بعد از یخ­گشایی افزایش داد(6). Khaliliو همکاران(2010) با انجام پژوهشی بر انجماد اسپرم قوچ مغانی نشان دادند که گلایسین و سیستئین در غلظت­های 5 تا 15 میلی مولار موجب افزایش تحرک، زنده­مانی و سلامت غشاء اسپرم قوچ در دو مرحله سرد سازی و پس از یخ گشایی شد که مشابه با یافته­های مطالعه حاضر در ذخیره منی قوچ عربی به صورت مایع می­باشد. هرچند نقش حفاظتی آمینواسیدها نامشخص است، ولی فرضیات متعددی توسط محققین برای مکانیسم حفاظتی آن ها در طول انجماد مطرح شده است. پژوهش گران معتقدند اثر حفاظتی آمینواسیدها ممکن است از توان آن ها به شکل یک لایه بر روی سطح اسپرم منشاء بگیرد. آن ها مولکول­های بارداری هستند و می­توانند با گروه­های فسفات موجود در فسفولیپیدهای غشاء پلاسمایی اسپرم ترکیب شوند و در اسمولاریته و زنده مانی اسپرم تاثیر داشته باشند(20، 17). افزودن اسیدآمینه سیستئین سبب افزایش درصد تحرک و زنده مانی اسپرم بعد از یخ گشایی می شود. افزودن سیستئین به عنوان اسیدآمینه به رقیق کننده منی در انجماد اسپرم دام­های اهلی موجب بهبود حرکت رو به جلو اسپرم بعد از یخ گشایی و باروری آن شده است. درپژوهشی، افزودن آنتی‏اکسیدان‏هایی از قبیل تائورین، هیپوتائورین،گلوتامین، سیستئین، آلبومین سرم گاوی، تره‏هالوز و هیالورونان به رقیق کننده قبل از انجماد باعث بهبود درصد تحرک اسپرم، مورفولوژی اسپرم، قابلیت زنده‏مانی اسپرم و محافظت فراسنجه‏های منی پس از یخ گشایی در خوک ‏گردید(9). در آزمایشی دیگر، افزودن آنتی اکسیدان سیستئین با دوز 10 میلی مولار سبب بهبود درصد تحرک، توان زنده­مانی و کاهش درصد ناهنجاری اسپرم­ها و نیز کاهش میزان گونه­های فعال اکسیژن(ROS) نسبت به گروه شاهد تحت شرایط انجماد شد. هم چنین دوز 10 میلی مولار سیستئین نتوانست سبب کاهش کمبود پروتامین و قطعه قطعه شدنDNA  شود (26). در مطالعه Chen و همکاران(1993) ملاحظه شد که افزودن اسیدهای آمینه گلوتامین، گلایسین، آلانین و سیستئین به رقیق‏کننده منی گاو میش قبل از انجماد، باعث بهبود فراسنجه‏های کیفی منی گاومیش بعد از یخ گشایی آن شد(8).‏ افزودن سیستئین به رقیق­کننده منی خوک نر، باعث محافظت­فراسنجه­های منی در شرایط انجماد شد(18). در مطالعه­ی دیگر که در آن اثر ال- سیستئین بر کیفیت اسپرم گاو نر ساهیوال بررسی شد، مشخص گردید که پس از 24 ساعت از ذخیره­سازی در دمای 37 درجه سانتی­گراد، تحرک، زنده­مانی و سلامت غشای پلاسمایی اسپرم بهبود یافت، به طوری که ال- سیستئین به مقدار 2-1 میلی­مول سبب بهبود کیفیت اسپرم در این دام شد(2). در تحقیق دیگر، اثر ال-سیستئین بر اسپرم نریان در شرایط انجماد بررسی و گزارش گردید که این اسید­آمینه سبب بهبود پارامترهای کیفی اسپرم در طول ذخیره سازی در دمای 5 درجه­ی سانتی گراد به مدت 48 ساعت شد، طوری که غلظت 200 مول بر لیتر آن سبب بهبود تحرک پیش­رونده، زنده­مانی و یک­پارچگی آکروزوم اسپرم گردید(28). بررسی اثر آنتی­اکسیدان­های ویتامین E و سیستئین بر پارامترهای اسپرم گربه بیان گر بهبود تحرک اسپرم و سلامت غشای پلاسمایی پس از انجماد می­باشد(29). در پژوهشی اثر گلوتاتیون، سیستئین و هیپوتائورین بر پارامترهای اسپرم خوک در دمای 10 درجه سانتی­گراد بررسی و مشاهده گردید که طی 7 و 14 روز در حضور گلوتاتیون و سیستئین میزان زنده­مانی اسپرم بالاتر بود(14). Bucak و همکاران(2009) با انجام آزمایشی گزارش کردند، رقیق کردن منی با سیستامین، های پوتائورین و محلول اسیدآمینه­ای باعث افزایش معنی­دار در جنبایی اسپرم بز می­شود. هایپوتائورین پیش­سازآمینواسیدتائورین است که در اسپرم پستانداران وجود دارد و در تولید پایانی متابولیسم سیستئین می­باشد. هایپوتائورین برای یک سری از اعمال اسپرم شامل ظرفیت پذیری، جنبایی، قابلیت باروری و رشد اولیه جنین ضروری می­باشد. هم چنین، هایپوتائورین می­تواند رادیکال­های هیدروکسیل تولید شده در طول پراکسیداسیون لیپید را خنثی و با محافظت از گروه­های تیولی موجود در غشاء پلاسمایی از آسیب اکسیداتیوی به اسپرم جلوگیری می­کند(3،7).

به طور کلی نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که افزودن اسیدآمینه سیستئین در سطوح کمتر از 20 میلی­مول به منی رقیق­شده قوچ عربی موجب بهبود اغلب فراسنجه­های کیفی اسپرم طی ذخیره منی به حالت مایع در C^°5 می گردد. در این میان، سطوح 5 و 10 میلی­مول سیستئین بهترین تاثیر را بر کیفیت اسپرم داشتند. در مقابل، بیشترین میزان توان­آنتی­اکسیدانی تام پلاسمای منی برای هر دو زمان یک و 24 ساعت پس از نگه­داری منی به حالت مایع، در سطوح 15 و 20 میلی­مول سیسئین مشاهده شد.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله ازپشتیبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی خوزستان در اجرای این تحقیق تقدیر و تشکر به عمل می­آید.

مراجع

1.Akhter, S.H., Allah Rakha, B., Iqbal, R., Ansari,M. (2014). Effect of bovine serum albumin on motility, plasmalemma, viabilityand chromatin integrity of buffalo bull spermatozoa. Pak. J.Zool, 46(1); 115-120.

2.Ansari, M.S., Allah Rakha, B.,Akhter, S. (2011). Effect of L-cysteine in extender on post-thaw quality ofSahiwal bull semen. Anim. Sci. Paper Report, 29(3); 197-203.

3.Barnett, D.K ., Bavister, B.D. (1992). Hypotaurine requirement for in vitro development of golden hamster one-cell embryos into morula and blastocysts, and production of term off spring from in vitro-fertilized ova. Biol. Reprod, 47; 297-304.

4.Benzie, I.F.F., Strain, J.J. (1996). The ferric reducing ability of plasma(FRAP) as a measure of antioxidant power: the FRAP assay. Anal.Biochem, 239; 70-76.

5.Bilodeau, J.F., Blanchette, S., Gagnon, C.,Sirard, M.A. (2001). Thiols prevent H-O mediated loss of sperm motility in cryo preserved bull semen. Theriogenology, 56; 275-286.

6.Bucak,M.N.,Atessahin, A., Varisti, O., Yuce, A., Tekin, N.,Akcay, A. (2007). The influence of trehalose, taurines, cysteamine and hyaloronan on ram semen. Microscopic and oxidative stressparameters after freeze-thawing process. Theriogenology, 67; 1060-1061.

7.Bucak, M.N., Tuncer, P.B., Sariozkan, S., Ulutas, P.A., Coyan, K., Baspinar, N., et al.(2009). Effects of hypotaurine, cycteamine and amino acids solution on post-thaw microscopic and oxidative stress parameters of Angora goat semen. J. Res. Vet. Sci, 87; 468-472.

8.Chen, Y.R.,Foote, H., Brockett, C.C. (1993). Effect of sucrose, trehalose, hypotaurine, taurine, and blood serum on survival of frozen bull sperm. Cryobiol, 30; 423-431.

9.Crabo, B.G., Brown, K.I., Graham, E.F. (1972). Effect of some buffers on storage and freezing of boar spermatozoa. J. Anim. Sci, 35; 377-382.

10.Elsheshtawy, R.I.,Elsisy, G.A.,Elna,W.S. (2008). Use of selected amino acids to improve buffalo bull semen. Cryopreserv, 2(4); 146-150.

11.Erkkilä, K., Hirvonen, V., Wuokko, E., Parvinen, M., Dunkel, L. (1998). N-acetyl-L-cysteine inhibits apoptosis in human male germ cells in vitro. J.Clin.Endocrinol.Met, 83(7); 2523-2531.

12.Evans, G., Maxwell, W.M.C. (1987). Handling and examination semen. In: Maxwell WMC, editor. Salamon’s artificial insemination of sheep and goat. Sydney: Butterworths, pp: 93-106.

13.Fanaei, H., Azizi, Y., Khayat, S. (2013). Role of oxidative stress in male infertility. J.Fasa. Univ. Med. Sci, 3(2); 93-102

14.Funahashi, H., Sano, T. (2005). Select antioxidants improve the function of extended boar semen stored at 10 degrees C. Theriogenology, 63(6); 1605-1616.

15.Gilmore, J.A., Liu, J., Peter, A.T., Critser, J.K. (1998). Determination of plasma membrane characteristics of boar spermatozoa and their relevance to cryopreservation. Biol. Reprod, 58(1); 28-36.‏

16.JafariAhangari, Y., Attarchi, H. (2008). The effect of royal jelly in tris extender on sperm characteristics of Dallagh rams. J. Agric. Sci.Natur.Resour, 15(3); 125-129.

17.Khalili, B., Jafaroghli, M., Farshad, A., Paresh-Khiavi, M.(2010). The effects of different concentrations of glycine and cysteine on the freezability of Moghani ram. Asian-Aust. J. Anim. Sci, 23; 318-328.

18.Khlifaoui, M., Battut, I., Bruyas, J.F. Chatagnon, G., Trimeche, A., Tainturier, D. (2005). Effects of glutamine on post-thaw motility of stallion spermatozoa: an approach of the mechanism of action at spermatozoa level. Theriogenology, 63(1); 138-149.

19.Kimura, M., Orikasa S., Mitsukawa, S.(1981). Effects of methyl cobalamin on sperm counts and sperm motility in oligo zoo spennic cases. J. Androl, 2;18-23.

20.Kundu, C.N., Das, K., Majumder, G.C.(2001). Effect of amino acids on goat cauda epididimal sperm cryo preservation using a chemically defined model system. J. Cryobiol, 42; 21-27.

21.Leboeuf, B., Restall, B., Salamon, S. (2000). Production and storage of goat semen for artificial insemination. Anim.Reprod.Sci, 62; 113–141.

22.Li, Y., Si, X.W.,Zhang, A.,Dinnyes, A. Ji, W. (2003). Effect of amino acids on cryo preservation of cynomolgus monkey(Maca cafascicularis) sperm. Anim. J. Primatol, 59(4); 159-165.

23.Memon, A.A., Wahid, H., Rosnina, Y., Goh, Y.M., Ebrahimi, M., Nadia, F.M. (2012). Effect of antioxidants on post thaw microscopic, oxidative stress parameter and fertility of Boer goat spermatozoa in tris egg yolk glycerol extender. Anim. Reprod. Sci, 136(1); 55-60.

24.ParizadianKavan, B., JafariAhangaran Y. (2010). Comparison the different extender effects on sperm characteristics in Atabi ram under storage in liquid condition. Research report. Research Institute Anim.Sci, Iran.

25.Purdy, P.H. (2006). A review on goat sperm cryo preservdation. Small Rumin.Res, 63(3); 215-22.

26.Samimi, A., Rezazadeh, M., Amanlu, M. (2009). Evaluation the cysteine and taurine antioxidants on oxidative stress and frozen semen parameters in human. M.Sc. thesis. TabriyatModares University, Iran.

27.Sarıozkan, S., Bucack, M.N., Tuncer, P.B., Ulutaş, P.A., Bilgen, A. (2009). The influence of cysteine and taurine on microscopic–oxidative stress parameters and fertilizing ability of bull semen following cryo preservation. Cryobiol, 58(2); 134-138.

28.Sukho, P., Juwarahawong, H., Sangiam, S. and Kaeoket, K. (2013). The effect of adding L-cysteine in modified kenny's extender on the quality of chilled stallion semen at 5 C°. J. Applied Anim. Sci, 6(1); 43-52.

29.Thuwanut, P. (2010). Role of oxidative stress and antioxidants in domestic and non-domestic cat spermatozoa. Doctoral thesis, Acta Universitatis Agriculturae Sueciae, Sweden.

30.Topraggaleh, T. R., Shahverdi, A., Rastegarnia, A., Ebrahimi, B., Shafiepour, V., Sharbatoghli, M. (2014). Effect of cysteine and glutamine added to extender on post‐thaw sperm functional parameters of buffalo bull. Andrologia, 46(7); 777-783.‏

31.Triwulanningsih, E., Situmorang, P., Sugiarti, T., Sianturi, R.G., Kusumaningrum, D.A. (2010). Effect of glutathaion addition to the sperm diluentmedium on quality of bovine chilled semen. Indonesian J. Agri, 3(1); 60-65.

32.Uysal, O., Bucak, M.N. (2009). The role of different trehalose concentrations and cooling rates in freezing of ram semen. Ankara Univ. Vet.Fak.Derg, 56; 99-103.

33.Zamiri. M.J. (2006). Physiology of Reproduction.1^st ed. HaghShenas publication. Tehran, Iran.