کاربرد توام پروتئازگیاهی بروملین و میدان الکترومغناطیس با فرکانس پایین((50 HZ بر آنژیوژنز در مدل حلقه آئورت موش صحرایی

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 2، دوره 12، شماره 1 - شماره پیاپی 44، دی 1397، صفحه 13-24   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

صفا مشتاق¹؛ کاظم پریور¹؛ جواد بهار ارا^{* 2}؛ نسیم حیاتی¹؛ محمد امین کراچیان³

¹گروه زیست شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه علوم و تحقیقات تهران، ایران.

²گروه زیست شناسی. مرکز بیولوژی کاربردی تکوین جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد مشهد، مشهد، ایران.

³گروه ژنتیک پزشکی، دانشکده علوم پزشکی، مشهد، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: رگزایی در بسیاری از فرآیندهای حیاتی نقش دارد و بسیاری از فرآیندهای رشد و نمو تحت تاثیر میدان الکترومغناطیس قرار می گیرند. پروتئاز گیاهی بروملین قادر به مهار تکثیر سلولی می باشد، در این پژوهش تجربی کاربرد توام بروملین و میدان الکترومغناطیس با فرکانس پایین بر آنژیوژنز حلقه آئورت موش صحرایی نژاد ویستار بررسی گردید.
روش کار: ابتدا آئورت موش صحرایی به قطعات یک میلی لیتری برش و در ماتریکس کلاژن کشت داده شد. پس از ظاهر شدن نخستین جوانه های رگی نمونه ها به 8 گروه طبقه بندی گردیدند. گروه شاهد، شاهد آزمایشگاهی ا(تیمار با PBS)، شاهد آزمایشگاهی2 (تیمار با سیستم مولد میدان به حالت خاموش)، شاهد آزمایشگاهی 3 (تیمار باPBSو میدان الکترومغناطیس در شرایط سیستم خاموش)، گروه های تجربی 1 و 2 (تیمار با غلظت های 100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر بروملین)، گروه تجربی 3 (تیماربا میدان الکترومغناطیس به تنهایی با شدت 100 گؤس به مدت 2 ساعت)، گروه تجربی4 (تیمار تؤام با میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس و بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر) تقسیم بندی شدند. تعداد و طول انشعابات عروقی 24 ساعت بعداز تیمار توسط نرم افزار Image J تعیین و داده های کمی توسط نرم افزار آماری SPSS و آزمون های آماری ANOVA و TUKEY در سطح P<0.05تحلیل گردید.
یافته ها: میانگین تعداد و طول انشعابات عروقی در نمونه های تیمار شده با بروملین و میدان الکترومغناطیس کاهش یافت.کاربرد توام از میدان الکترومغناطیس و بروملین باعث کاهش معنی دار میانگین تعداد و طول عروق نسبت به کاربرد هریک به تنهایی گردید.
نتیجه­گیری: نتایج نشان داد که بروملین دارای اثر مهاری وابسته به دوز بر رگزایی است و این تاثیر توسط هم افزایی با میدان الکترومغناطیس به طور معنی داری افزایش می یابد.

کلیدواژه‌ها

بروملین؛ رگزایی؛ حلقه آئورت؛ میدان الکترومغناطیس

اصل مقاله

مقدمه

 

فرآیند آنژیوژنز در نتیجه تکثیر فعال سلول های آندوتلیال است و تشکیل رگ های خونی فعال مستلزم برهم کنش هماهنگ بین سلول های آندوتلیالی، ماتریکس خارج سلولی و سلول های احاطه کننده آن ها می باشد(20). با این که این سلول ها خاموش هستند اما توانایی فعال شدن در پاسخ به عوامل مناسب را دارند. در واقع می توان رگزایی را فرآیند ضروری در فیزیولوژی بدن دانست که با واسطه تعادل بین فاکتورهای القا کننده و مهارکننده رگزایی تنظیم می گردد و در صورتی که این تعادل از بین برود، زمینه برای بروز برخی از بیماری ها از جمله رشد و متاستاز تومور فراهم می­شود(22). در سال 1975 فولکمن برای اولین بار فرضیه وابسته بودن رشد تومورها به رگزایی را مطرح نمود. تحقیقات بعدی نشان دادند که رشد و متاستاز تومورها به ایجاد رگ های جدید و رفع نیازهای تغذیه ای تومور بستگی دارد(10). یکی از اهداف درمان سرطان مهار آنژیوژنز در سلول­های سرطانی است. منشا رگ های تشکیل دهنده در ابتدا نامشخص بوده و علت آن می تواند سلول های تغییر یافته توموری و یا سلول های طبیعی که از بافت های خوش­خیم مجاور منشا گرفته اند باشد. مدتی بعد این تئوری مطرح گردید که عامل محرک رشد سلول های رگ­های خونی در تومورها از سلول های بدخیم مجاور منشا می­گیرند، لذا تومورها ابتدا عروق میزبان را برای بقای خود به کار گرفته، که این امر خود منجر به اضمحلال عروق میزبان شده و رشد مداوم سلول های توموری در ادامه منجر به فرآیند آنژیوژنز می شود(17). از آن جا که آنژیوژنز در پدیده های پاتولوژیک نظیر رشد و متاستاز تومورهای سرطانی نقش مهمی ایفا می کند، لذا شناسایی و توسعه درمان های جدید رو به گسترش می باشد. بر طبق تجربیات Argonکه در سال 2009 صوت گرفت استفاده از روش شیمی درمانی مقاومت اکتسابی سلول­های سرطانی را به داروهای شیمی درمانی در پی دارد و نیز میزان جهش و ناپایداری ژنتیکی در این سلول ها بسیار بالاست، لذا به سرعت دست­خوش تغییرات می ­شوند و نسبت به داروهای شیمی درمانی مقامت پیدا می­کنند، در حالی که سلول های آندوتلیال سلول هایی کاملاً طبیعی هستندکه از نظر ژنتیکی پایدار بوده و میزان جهش در آن ها پایین می باشد، لذا مهار رگزایی که بر پایه مواد طبیعی می باشد باعث کاهش بسیار زیاد مقاومت دارویی می گردد. شواهد این طور نشان داده اند که با توجه به مصرف منابع گیاهی به طور گسترده انجام مطالعات با هدف شناسایی ترکیبات ضد توموری و ضدرگزایی با منشا گیاهی اهمیت شایانی پیدا کرده است. از سوی دیگر ترکیبات طبیعی به دست آمده از گیاهان بدون این که سمیت قابل توجه و عوارض جدی بر بافت های طبیعی داشته باشد، به طور اختصاصی می توانند با تشکیل عروق جدید در تومورها مقابله نمایند(17). علاوه بر این مطالعات بسیاری نشان داده اند که عوامل موثر در این ترکیبات طبیعی قادر به مهار تکثیر و رشد تومور از طریق مسیرهای فیزیولوژیک مثل مسیرهای پیام رسان سلولی هستند. تاکنون اثرات ضد رگزایی ترکیبات متعدد با منشا گیاهی از جمله عصاره پیازچه، موسیر، زعفران، هندوانه ابوجهل، کورکومین و اوژنول مورد بررسی قرار گرفته است(11). در این پژوهش تجربی از آنزیم پروتئولیتیک بروملین موجود در میوه خام و رسیده آناناس به منظور مهار رگزایی استفاده گردید. تحقیقات نشان داده اند که بروملین دارای خواص درمانی متفاوتی است که از طریق فرآیندهای متفاوت بیولوژیکی انجام می گیرد. در مطالعات بالینی متفاوت مکانیسم های متفاوتی از مرگ سلولی توسط بروملین گزارش شده است. تحقیقات نشان داده اند که بروملین موجود در آناناس عملکرد پروتئینی را که در 30 درصد سرطان‌ها دخیل است، متوقف نموده و قادر است سیستم ایمنی بدن را برای هدف قرار دادن و نابود ساختن سلول‌های سرطانی تحریک کند. این خاصیت آناناس به ویژه در مورد سرطان سینه، ریه، روده بزرگ، تخمدان و سرطان پوست به اثبات رسیده است(8). از سوی دیگر اثرات آپوپتوزی و ضد توموری بروملین بررسی شده است(15)، ولی تاکنون مطالعات اندکی در زمینه اثرت ضد رگزایی بروملین صورت پذیرفته است. در طی چند دهه گذشته با افزایش استفاده از وسایل الکترونیکی تولیدکننده میدان های الکترومغناطیس در محیط کار و زندگی، توجه محققین به تهدیدات احتمالی این وسایل برای سلامتی بشر جلب گردیده است. گزارش های متعددی از اثرات میدان های الکترومغناطیس با فرکانس پایین و بررسی اثرات آن با وضعیت های پاتولوژیک ارائه شده که نوع میدان، شدت آن، مدت زمان در معرض قرارگیری و محتوای ژنی نمونه تیمار شده در نتایج آزمایشات موثر واقع شده است(1). مطالعات آزمایشگاهی در شرایط in vitro و in vivoنشان می دهد که مواجه با میدان های الکترومغناطیس در شدت های بالا با تغییر در عملکرد و یا مراحل عملکردی سلول ها، پاسخ های متنوعی در موجودات زنده القا می کند. که می توان به تاثیر آن بر روی تکثیر و تمایز سلولی، اختلال در چرخه سلولی، القای مرگ برنامه ریزی سلولی، اختلال در ارتباطات بین سلولی، افزایش تخریب RNA، اختلال در بیان ژن ها و تولید رادیکال های آزاد اشاره نمود(3). به منظور بررسی فرآیند رگزایی چندین مدل آزمایشگاهی نظیر پرده کوریوالانتوئیک جوجه، مدل تشکیل عروق جدید در قرنیه چشم، ماتریژل، مدل آمنیون انسانی وحلقه آئورت مورد توجه می باشند، از میان این مدل ها مدل حلقه آئورت به طور گسترده برای بررسی رگزایی و ساز و کارهای وابسته به آن مورد توجه قرار می گیرد(16)، از ویژگی های این مدل می توان به تکرار پذیری بالا، اثربخشی و هزینه کم آن اشاره نمود. هم چنین حلقه آئورت پلی بین اطلاعات آزمایشگاهی و طبیعی می باشد. در این روش جوانه های رگی مشتق از حلقه آئورت در ژل کلاژن به یک شبکه مویرگی تبدیل می شوند که موجب ارائه تصویر کامل تر از فرآیند رگزایی در مقایسه با سنجش های قدیمی تر مبتنی بر سلول می گردد(20). از ین رو با توجه به کاستی هایی که در درمان سرطان وجود دارد، مانندنرخ رشد سریع آن و عدم تشخیص به موقع که سبب محدود شدن روش­های درمانی می شود، استفاده از روش های ترکیبی می تواند در جبران این کاستی ها تاثیرگذار باشد، لذا با توجه به این که یکی از مکانیسم های جلوگیری از رشد و تکثیر سلول های سرطانی، مهار رگزایی می باشد، پژوهش تجربی حاضر با هدف بررسی کاربرد توام پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر و میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس و فرکانس 50 هرتز بر پدیده مهار رگزایی حلقه آئورت رت انجام شد .

مواد و روش ها

استخراج کلاژن و تهیه داربست کلاژنی

کلاژنی با غلظت 4 میلی گرم بر میلی لیتر از دم موش صحرایی نژاد ویستار تهیه گردید.(برای تعیین غلظت از روش برادفورد استفاده شد)، در ابتدا رشته های تاندونی از دم موش جدا و 3 بار شستشو با PBS انجام گرفت و سپس در الکل 70 درصد به مدت یک ساعت گذاشته شد. در مرحله نهایی به مدت 60 دقیقه دورrpm16000 سانتریفیوژ و کلاژن مورد نظر تهیه گردید(19).

تهیه داربست کلاژنی

برای تهیه داربست کلاژنی، کلاژن استخراجی از دم موش صحرایی، بی کربنات سدیم، محیط کشت( DMEM (Sigma, France را به ترتیب به نسبت 8، 1 و 1 مخلوط کرده، پس از تشکیل داربست حلقه های آئورت را درون داربست گذاشته و در انکوباتور به مدت 15 دقیقه قرار داده تا محلول کلاژن به ژل تبدیل شود، سپس پلیت را از انکوباتور خارج کرده و زیر هود محیط کشت DMEM حاوی 30 درصد سرم گوسالهFBS(Gibco, USA) و آنتی بیوتیک پنی سیلین(Gibco, USA) و استرپتومایسین(Gibco, USA) به آن اضافه شده و روی کلاژن ریخته تا سطح رویی آن را بگیرد(11).

جدا ساختن حلقه آئورت از موش صحرایی

در تحقیق حاضر از موش های صحرایی که 4 تا 6 هفته سن و 250 تا 300 گرم وزن داشتند استفاده شد. در ابتدا موش ها با کلروفرم بی هوش و بخش شکمی توسط الکل 70 درصد استریل گردید. حفره شکمی با استفاده از لوازم جراحی باز و پس از پیدا کردن آئورت سینه ای، قطعه هایی با طول مناسب از آئورت جدا و بلافاصله به بافر استریل که حاوی آنتی بیوتیک های پنی سیلین(100 واحد در میلی لیتر) و استرپتومایسین(100 میکروگرم بر میلی لیتر) منتقل گردید، در شرایط استریل زیر هود لامینار، ابتدا بافت زائد چربی با استفاده از قیچی و پنس جدا شد و آئورت چندین بار با بافر فسفات شستشو داده شد تا درون آن از وجود باقی مانده خون و ترکیبات اضافه پاک شود و در نهایت با استفاده از تیغ جراحی، آئورت به حلقه های 1 تا 2 میلی متری قطعه قطعه گردید و درون چاهک های پلیت 96 خانه ای منتقل گردید. محققان این پروژه در کلیه مراحل متعهد به رعایت اصول اخلاقی کار با حیوانات مطابق آیین نامه های مذکور بودند(19).

پوشاندن روی حلقه های آئورت

روی حلقه های آئورت کاشته شده با لایه ای نازک به ضخامت 3 میلی متراز محلول کلاژن(غلظت 4 میلی گرم در هر میلی لیتر) پوشانده شد. پلیت به انکوباتور 37 درجه سانتی گراد منتقل گردید تا محلول کلاژن به صورت کامل ژل گردد. پس از تشکیل ژل پایدار کلاژن، از محیط DMEM حاوی 20 درصد سرم گوساله(FBS) و آنتی بیوتیک پنی سیلین و استرپتومایسین به آن اضافه شد. پس از مشاهده اولین جوانه های عروقی در روز پنجم نمونه ها برای انجام تجربیات در گروه به شرح ذیل به صورت تصادفی قرار داده شدند(11).

گروه بندی نمونه ها

پس از پیدایش اولین جوانه های عروقی نمونه ها به 8گروه آزمون به طور تصادفی توزیع شدند که شامل:

1. گروه شاهد(نگهداری در شرایط طبیعی)
2. گروه شاهد آزمایشگاهی 1(تیمار با PBS)
3. شاهد آزمایشگاهی 2(تیمار با میدان الکترومغناطیس در وضعیت خاموش)
4. شاهد آزمایشگاهی 3 (تیمار توام با PBS و وضعیت خاموش سیستم مولد میدان الکترومغناطیس)
5. گروه تجربی 1 که نمونه ها توسط پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر تیمار شدند.
6. گروه تجربی 2 که نمونه ها توسط پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت 200میکروگرم بر میلی لیتر تیمار شدند.
7. گروه تجربی 3 در معرض میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس و فرکانس 50 هرتزبه مدت 2 ساعت قرار گرفتند.
8. گروه تجربی4که تحت اثر میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس به مدت 2 ساعت بودند که بلافاصله بعد میدان به آن­ها پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر افزوده شد(18).

قبل از تیمار و 24 ساعت بعد از تیمار با میکروسکوپ معکوس با بزرگنمایی ثابت بررسی و عکس برداری انجام گردید و تعداد و طول انشعابات رگی در داخل 4 مربع با اندازه یکسان 10 در 10 که به طور تصادفی روی تصاویر توسط نرم افزار Image j رسم شده بود تعیین گردید. در هربار آزمایش برای هر دوز 5 نمونه در نظر گرفته شد و کلیه آزمایش ها 3 بار تکرار گردید.

تحلیل آماری

 داده های آماری حاصل در نرم افزار SPSS و به کمک آزمون آماری ANPVAو آزمون تعقیبی Tukey در سطح معنی داری(05/0p<) تحلیل شد.

نتایج

مطالعه با میکروسکوپ معکوس نشان داد که در روز سوم انشعابات سلول های آندوتلیالی به طور بسیار محدودی شروع به تشکیل کرده و در روز پنجم جوانه­های عروقی به خوبی گسترش یافته اند، لذا تیمار بر روی نمونه ها در روز پنجم به دلیل اندازه مناسب زوائد شبه برای مطالعه با میکروسکوپ معکوس انجام گردید. بر اساس نتایج به دست آمده و تحلیل آزمون های آماری، میانگین تعدد و طول انشعابات عروقی در گروه های شاهد آزمایشگاهی 1، شاهد آزمایشگاهی 2 و شاهد آزمایشگاهی 3 در مقایسه با گروه های شاهد اختلاف معناداری نداشت(05/0p>)، لذا در نمونه های بعدی گروه های تجربی باگروه شاهد مقایسه شدند. به منظور بررسی تاثیر پروتئاز گیاهی بروملین بر مهار رگزایی در مدل حلقه آئورت، نمونه ها با غلظت های 100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر تیمار شدند، مقایسه میانگین تعداد انشعابات عروقی بین گروه شاهد و گروه تجربی1 (تیمار با دوز 100 میکروگرم بر میلی لیتر) وگروه تجربی 2(تیمار با دوز 200 میکروگرم بر میلی لیتر)دارای کاهش معنی دار بود(01/0p<)، هم چنین میانگین طول انشعابات عروقی بین گروه شاهد و گروه تجربی1(تیمار با دوز 100 میکروگرم بر میلی لیتر)(05/0p<) وگروه تجربی 2(تیمار با دوز 200 میکروگرم بر میلی لیتر)دارای کاهش معنی دار بود(001/0p<)(نمودار 1 و 2، شکل 1). در مرحله بعد بررسی نتایج به دست آمده  به منظور بررسی تاثیر کاربرد تؤام میدان الکترومغناطیس با فرکانس پایین به همراه بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر گروه های تجربی 1 و 3 و 4 با گروه تجربی مقایسه شدند، مقایسه میانگین تعداد انشعابات عروقی بین گروه شاهد آزمایشگاهی 3 گروه تجربی 4 (تیمار تؤام با بروملین و میدان الکترومغناطیس) کاهش معنی داری را نشان داد(001/0p<)، هم چنین میانگین طول انشعابات عروقی بین گروه شاهدآزمایشگاهی 3 گروه تجربی 4(تیمار تؤام با بروملین و میدان الکترومغناطیس) نیز دارای کاهش معنی دار بود(001/0p<)(نمودار 3 و 4 ، شکل 1).

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- تصاویر میکروسکوپ نوری معکوس بزرگنمایی(X 100) از راست به چپ دیدار شدن زوائد شبکه رگی از حلقه آئورت کشت شده در ماتریکس کلاژن در روز پنجم، علامت پیکان پدیدار شدن جوانه های عروقی را نمایش می دهد.

(A)گسترش شبکه عروقی در روز پنجم، (B)افزودن غلظت 100 میکروگرم از بروملین به نمونه ها که اثر مهاری ضعیفی را در رشد و گسترش عروق خونی نمایش می دهد. C)) افزودن غلظت 200 میکروگرم از بروملین به نمونه ها که اثر مهاری مناسب را در رشد و گسترش عروق خونی نمایش می دهد. (D) تیمار توام توسط میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس و غلطت 100 میگرگرم بر میلی لیتر از بروملین که اثر مهار شکنندگی قوی در رشد و گسترش عروق خونی را نمایش می دهد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ن

 

 

 

 

 

نمودار 1- مقایسه میانگین تعداد انشعابات عروق خونی در نمونه های تحت تیمار با پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت 100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر در مقایسه با نمونه هایی که فقط با PBS تیمار شده اند(01/0P<^** mean ± ).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2- مقایسه میانگین طول انشعابات عروق خونی در نمونه های تحت تیمار با بروملین با غلظت100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر در مقایسه با نمونه های شاهدآزمایشگاهی 1 که فقط با PBS تیمار شده اند(^*001/0P<  ^*** 05/0 P<^*)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 3- مقایسه میانگین تعداد انشعابات عروق خونی در نمونه های تحت تیمار تؤام با بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر و میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس به مدت 2 ساعت در مقایسه با نمونه هایی که فقط با PBS و گروهی که فقط با بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر( تجربی 1) و 200 میکروگرم بر میلی لیتر(تجربی 2) به تنهایی و گروهی که توسط میدان الکترومغناطیس به حالت سیستم مولد خاموش تیمار شده اند( تجربی 3)(001/0P< ^***و 01/0P<^**)

 

 

نمودار 4- مقایسه میانگین طول انشعابات عروق خونی در نمونه های تحت تیمار با بروملین با غلظت100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتر در مقایسه با نمونه های شاهدآزمایشگاهی 1 که فقط با PBS تیمار شده اند

 (01/0P<  ^** 05/0 P<^*)

 

بحث و نتیجه گیری

 

در این پژوهش تجربی کاربرد توام پروتئاز گیاهی بروملین و میدان الکترومغناطیس با فرکانس پایین به منظور مهار رگ­زایی برروی مدل حلقه آئورت موش صحرایی مورد ارزیابی قرار گرفت. هم­چنین در این پژوهش تجربی از داربست کلاژنی به عنوان یک مدل مناسب برای کشت حلقه آئورت مورد استفاده قرار گرفت. محمدی مطلق و همکارانش از این مدل کشت برای بررسی مهار رگ­زایی عصاره گیاه موسیر استفاده کردند. اساس مدل­های سه بعدی رگ­زایی بر پایه ظرفیت سلول های آندوتلیال فعال شده جهت تهاجم به محیط های سه بعدی(ماتریکس) بنا نهاده شده است. این ماتریکس ممکن است ژل کلاژن یا فیبرین، ماتریژل و یا مخلوطی از این پروتئین ها به همراه فاکتورهای رشد باشد. به طور کلی مدل های سه بعدی نسبت به مدل های دو بعدی دارای ویژگی ها و شرایط نزدیک تر به محیط درون بدن هستند و در حقیقت بسته به ترکیب محیط کشت(درصد سرم، اضافه کردن فاکتورهای رشد و سایتوکاین ها)، در این نوع مدل ها، سلول ها را می توان برای انشعاب، تکثیر و مهاجرت و یا تمایز سه بعدی استفاده کرد(16). بر اساس نتایج این پژوهش تجربی میانگین تعداد و طول انشعابات عروقی در اطراف محل تیمار در نمونه های شاهد آزمایشگاهی یک(تیمار شده با نرمال سالین) و شاهد آزمایشگاهی 2(قرار داده شده در مجاورت سیستم مولد میدان الکترومغناطیس به حالت خاموش) و شاهد آزمایشگاهی 3(تیمار با نرمال سالین و سیستم مولد میدان به حالت خاموش)در مقایسه با نمونه های شاهد ختلاف معناداری نداشت(05/0p>)، بنابراین می توان این طور گفت که حلال بروملین(نرمال سالین) که توسط آن دوزهای مصرفی تهیه شدند، تاثیر معنی داری بر طول و تعداد انشعابات عروقی ندارد. هم چنین با بررسی نتایج به دست آمده از نمونه های شاهد آزمایشگاهی2 مشخص گردید که تغییر شرایط انکوباسیون و در معرض قرار دادن نمونه ها در سیستم مولد میدان الکترومغناطیس به حالت خاموش موجب اختلاف معنی داری در میانگین تعداد و طول انشعابات عروقی نسبت به نمونه های گروه شاهد نمی کند، لذا اثراتی که میدان الکترومغناطیس به حالت روشن بر میزان رگ­زایی اعمال می کند ناشی از تشعشعات میدان الکترومغناطیس است و تغییر شرایط انکوباسیون تاثیری در رگ­زایی حلقه آئورت رت ندارد(05/0p>). در ادامه نتایج پژوهش نشان داد که میانگین طول انشعابات عروقی در اطراف محل تیمار در نمونه های تیمار شده با پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت های 100و 200 میکروگرم بر میلی لیتر(در مقایسه با نمونه های شاهد به طور معنی داری کاهش داشت(01/0p>). در این پژوهش تجربی از آنزیم پروتئولیتیک بروملین موجود در میوه خام و رسیده آناناس به منظور مهار رگ­زایی استفاده گردید. در تحقیقی در سال 2013 انجام گرفتار یک پروتئاز گیاهی به نام سیستئین بر روی سلول های آندوتلیالی بند ناف به منظور مهار رگ­زایی بررسی شد. نتایج این تحقیق این طور نشان دادند که فعالیت ضد رگ زایی این پروتئاز در مهار رشد و تکثیر سلول های آندوتلیالی به دلیل تداخل در مسیر فسفوریلاسیونAKT,MEK1/2 SAPK/JNK می باشد و در ادامه این طور بیان گردید که بروملین نیز دارای اثرات مشابه با سیستئین می باشد(8). پژوهشی دیگر در سال 2015 بر روی رده سلولی GI-101A سرطان دستگاه تنفسی صورت گرفت این طور نشان داده شد که کاربرد بروملین با غلظت 1 میکروگرم کاهش قابل توجهی در تعداد سلول ها دارد که همراه با القای آپوپتوز می باشد(18).در تحقیقی که در سال 2010 به منظور بررسی اثر اتوفاژی و القای آپوپتوز ترکیب بروملین برروی رده سلولی MCF-7 انجام گردید و فعالیت کاسپاز 9 در آن بررسی شد مشاهده شد که تراکم زیاد کروماتین و کلیواژ هسته ای در این سلول ها وجود دارد. نتایج بیان­گر این موضوع بود بروملین سبب القای کاهش عامل ERK، و از سوی دیگر باعث افزایش بیان JNK و p38 kinase می شود(9). نتایج این پژوهش تجربی نیز این طور نشان داد که کاربرد بروملین به تنهایی و با غلظت 100 و 200 میکروگرم بر میلی لیتربه صورت وابسته به دوز قادر به مهار رگ­زایی در حلقه آئورت موش صحرایی می باشد، که می توان با فعال کردن مسیرهای آپوپتوزی و القای فرآیند آپوپتوز در سلول­های آندوتلیال دیواره عروق خونی باشد. در سال های اخیر مشاهده شده است که میدان های الکترومغناطیس دارای اثرات متفاوت و گاهی مفید بر سیستم های انسان اند و همراه روش های شیمی درمانی، رادیوتراپی از روش های کنترل رشد تومور می باشد(25). مقایسه نتایج تعداد و طول انشعابات عروقی درنمونه هایی که به مدت 2 ساعت درمعرض میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس قرار گرفتند در مقایسه با نمونه های گروه شاهد کاهش معنی داری را نشان داد(01/0p≤). بهارآرا و همکارانش با قرار دادن تخم مرغ های نطفه دار از روز دهم انکوباسیون در معرض میدان الکترومغناطیس یا فرکانس 50 هرتز و شدت های 100، 200 و 300 گؤس نشان دادند که این شدت از میدان های الکترومغناطیس دارای اثر مهاری بر رگ­زایی در پرده کوریوالانتوئیک جنین جوجه است و تعداد و طول اتشعابات عروقی را کاهش می دهد(3). بالا نژاد و همکارانش در سال 2010 گزارش کردند که تشعشعات میدان های الکترومغناطیس با شدت 400 گؤس می تواند قادر به مهار رگ­زایی در پرده کوریوالانتوئیک جوجه می باشد(4). این نتایج به دست آمده از پژوهش های فوق کاملاً هم­سو با نتیجه پژوهش تجربی حاضر می باشد، لذا می­توان عنوان کرد که کاربرد میدان الکترومغناطیس با فرکانس پایین با تغییر در عملکرد و یا مراحل عملکردی سلول ها می تواند پاسخ های متنوعی را در موجودات زنده القا می کنند که از آن جمله القای آپوپتوز در سلول های آندوتلیالی دیواره عروق می باشد. میزان این تغییرات سلولی و مولکولی به مدت زمان تابش، میزان نفوذپذیزی آن در بافت ها و تولید گرما بستگی دارد(3). بر اساس نتایج پژوهش تجربی حاضر میانگین تعداد و طول انشعابات عروقی در اطراف محل تیمار در نمونه هایی که توسط بروملین با غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر و میدان الکترومغناطیس با فرکانس 50 هرتز و میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس به مدت 2 ساعت تیمار توام شدند در مقایسه با گروه هایی که با میدان الکترومغناطیس با شدت 100 گؤس به مدت 2ساعت به تنهایی و نیز بروملین با دوز 100 میکروگرم بر میلی لیتر نمونه های شاهد به طور معنی داری کاهش نشان داد(001/0p≤)، لذا کاربرد توام این دو عامل باعث تشدید اثر مهاری بر رگ­زایی در حلقه آئورت موش صحرایی در مقایسه با کاربرد هر کدام به تنهایی گردد.از آن جمله در روش درمانی ترکیبی دو یا چند عامل درمانی می تواند سنگ بنای درمان سرطان باشد، تحقیقات ثابت کرده اند که کاربرد درمان های ترکیبی هم زمان کارایی بیشتری نسبت به روش های مونوتراپی دارد، که به طور بالقوه مقاومت دارویی کاهش داده و شاهد کاهش رشد تومور را باعث می شود(6). بهارآرا و همکارانش با کاربرد توام عصاره آبی زعفران و میدان الکترومغناطیس با 200شدت گوس به مدت 2 ساعت باعث مهار آنژیوژنز درمدل حلقه آئورت رت شدند(19)، هم چنین تحقیقی دیگر نشان دادکه کاربرد میدان الکترومغناطیس با شدت 50 گوس سبب تشدید اثر مهاری ماده گیاهی سیر بر روی آنژیوژنز پرده کوریوالانتوئیک جوجه می شود(13). بالانژاد و همکاران گزارش کردند که تشعشعات میدان الکترومغناطیس با شدت 400 گوس می تواند منجر به افزایش اثر مهاری راپامایسین بر رگ­زایی در پرده کوریوالانتوئیک جوجه می شود(4). در تحقیقی که توسط مطیع و همکارانش صورت گرفت کاربرد توام نانوذره نقره به همراه میدان الکترومغناطیس با فرکانس پایین برروی رگ­زایی پرده کوریوالانتوئیک جوجه بررسی گردید که نتایج این تحقیق نشان دادند که کاربرد توام این دو باعث کاهش معنی دار رگ­زایی در پرده کوریو الانتوئیک جوجه نسبت به کاربرد هریک به تنهایی می شود(14). با توجه به نتایج به دست آمده از این پژوهش و تحقیقات مشابه انجام شده میدان های الکترومغناطیس با فرکانس پایین می تواند باعث مهاررگ­زایی شود که در صورت توام شدن با عامل دوم در تشدید اثر مهاری عامل دوم تاثیرگذار می باشد. با توجه به این که استفاده از میدان­های الکترومغناطیس بر تخریب سلول های سرطانی و هم زمان سلول های سالم تاثیر گذار باشد، لذا می توان بیان داشت که میدان های الکترومغناطیس با ویژگی های خاص(شدت میدان، زمان تیمار، ژنتیک نمونه و نوع میدان) با اجزای دوقطبی سلول مثل سلول مثل غشای پلاسمایی، DNA و هسته و میکروتوبول ها تداخل عمل پیدا کرده و بسته به ویژگی های میدان این تداخل می­تواند به صورت تحریکی یا مهاری عمل کند(7). لذا یافتن روشی که به کمک آن بتوان بدون این که سلول های سالم آسیب ببینند، تنها سلول های سرطانی و عروق اطراف آن را مورد هدف قرار داد می تواند یک روش موثر در درمان بسیاری از سرطان ها باشد. این پژوهش با هدف به کار گیری توام پروتئاز گیاهی بروملین با غلظت­های 100میکروگرم بر میلی لیتر با میدان الکترومغناطیس با فرکانس 50 هرتز و شدت 100 گؤس به منظور بررسی آن بر پدیده رگ­زایی در حلقه آئورت موش صحرایی نژاد ویستار انجام شد. نتایج بیان گر آن است که بروملین به صورت وابسته به دوز دارای اثر مهاری بر رگ­زایی حلقه آئورت موش صحرایی است، از سوی دیگر کاربرد توام بروملین(100 میکروگرم بر میلی لیتر) و میدان الکترومغناطیس(فرکانس 50 هرتز و شدت 100 گؤس به مدت 2 ساعت) باعث کاهش معنی­داری در رگ­زایی حلقه آئورت موش صحرایی نسبت به کاربرد هریک به تنهایی می شود، لذا پیشنهاد می گردد در مطالعات بالینی مرتبط با رگ­زایی این موضوع می­تواند مورد توجه بیشتری قرار بگیرد.

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از همکاران محترم مرکز تحقیقاتی بیولوژی کاربردی دانشگاه آزاد اسلامی تشکر می شود.

مراجع

1.Baharara, J., Zahedifar, Z. (2012). The effect of low frequency electromagnetic fields on some biological activities of animals. Arak Medical University Journal (AMUJ), 15(66); 80 - 93.

2.Baharara, J., Ramezani, T. (2014). A review on angiogenesis in tumor. Journal of Cell & Tissue (JCT), 5 (1); 89-100.

3.Baharara, J., Ashraf, A., Balanejad, S., SamarehMosavi, S. (2010). The inhibitory effect of low frequency field(50HZ) on angiogenesis inchorioallantoic memberane of chick. J ZahedanUniv Med Sci, 12(2); 8-11. [Persian].

4.Balanejad, S., Parivar, K., Baharara, J., MohseniKochesfahani, H. (2010). Effect of combinned rapamycine and of low frequency electromagnetic field on angiogenesis. J. Shahrekord Univ. Med. Sci, 11(3); 70 - 6.

5.Baharara, J., Ashraf, A., Balanejad, S., Mosavi, S. (2010). The inhibitory effect of low frequency electromagnetic field (50Hz) on angiogenesis in chorioalantoic membrane of chick. Zahedan Journal Research in Medical Science, 12(2); 8-12.

6.Bin, Sh., Li-Fang, W., Wen, Sh., Liang, C. (2017). Carnosic acid and fisetin combination therapy enhances inhibition of lung cancer through apoptosis induction. International Journal Oncology. Pages; 2123-2135. https://doi.org/10.3892/ijo.2017.3970.

7.Calvente, I., Fernandez, M., Villalba, J., Olea, N., Nuñez, M. (2010). Exposure to electromagnetic fields (nonionizing radiation) and its relationship with childhood leukemia: a systematic review. Science of the Total Environment, 408(38); 3062 - 9.

8.Chobotova, K., Vernallis, A.B., Majid, F.A. (2010). Bromelain's activity and potential as an anti-cancer agent: current evidence and perspectives.Cancer Letters, 290(2); 148–156.

9.Dharma, P.T.R., Malueghaa, M., Widodob, A., Pardjianto, B. (2015). The effects of bromelain on angiogenesis, nitricoxide, andmatrix metalloproteinase-3and-9 in rats exposed to electrical burninjury. Wound Medici, 9; 5-9.

10.Ernesta, F., Ruben, B., Laura, P., Ivanek, R., Curzio, R., Gerhard, C. (2013). An immature B cell population from peripheral blood serves as surrogate marker for monitoring tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapy in mouse models., Medici, 18(3); 327-345.

11.Kouhestanian, K., Baharara, J., Ramezani, T., Mousavi, M. (2015). Antiangiogenic effects of eugenol in chorioallantoic membrane of chick embryo. Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 23(4); 2109-2117.

12.Kouhestanian, K1., Baharara, J., Zafarbalanezhad, S. (2015). Feyz. Journal of Kashan University of Medical Sciences, 19(3); 197-203.

13.Mansouri, K., Mostafaie, A., MohammadiMotlagh, H. (2010). Angiogenesis and tumor biology. J Improve, KermanshahUniv Med Sci, 14(4); 315-05.

14.Motie, M., Baharara, J., Iranbakhsh, A., Ramezani, T. (2016). Synergic application effects of silver nanoparticles and low-frequency electromagnetic field on the chick embryo chorioallantoic membrane on angiogenesis. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 24(4); 317-328

15.Mohammadi Motlagh, HR., Mansouri, K., Shakiba, Y., Keshevarz, M., Khodarahmi, R., Siami, A., Mostafaie, A. (2009).The effects of aqueous extract on Antiangiogenic. J Bio electromagnetics, 35(5); 390-9.

16.Mansouri, K., Mostafaie, A., MohammadiMotlagh, H. (2010). Angiogenesis and Tumor Biology. J Improve Kermanshah Univ Med, 14(4); 315-05.[in Persian]

17.Mortazaei, S., Rafieian, M., AnsarySamani, R., Shahinfard, N. (2013). Comparison of phenolic compounds concentrations and antioxidant activity of eight medicinal plants. J Rafsanjan Univ Med Sci, 12(7); 519-30 [Persian].

18.Mohr, T., Desser, L.(2011). Plant proteolytic enzyme papain abrogates angiogenic activation of human umbilical vein endothelialcells (HUVEC) in vitro. Journal of Cell & Tissue (JCT), 18(5);396-400.

19.Moshtagh, S., Baharara, J., Zafar-Balanejad, S., Ramezani, T. (2014). .Effects of saffron aqueous extract and low frequency electromagnetic field on angiogenesis on in a Wistar rat aortic ring model. Koomesh Journal, 15(4); 522–529.

20.Nicosia, R. (2009). The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Angiogenesis Review Series. Cell Mol Med, 13(10); 4113-36.

21.Paulo, M., Karime, K. (2012). Role of angiogenesis in the pathogenesis of cancer. Cancer Treatment, 8(7); 825 - 33.

22.Ruggiero, M., Bottaro, Dp., Liguri, G., Gulisano, M., Peruzzi, B., Pacini, S. (2004). Magnetic field inhibits angiogenesis in chick embryo chorioallanto icmembrane. J Bio electromagnetics, 25(5); 390-9

23.Ramezani, R., Baharara, J. (2014). A review on angiogenesis in tumor. Journal of Cell & Tissue (JCT), 5 (1);89-100.

24.ShahrokhAbady, Kh. (2003). Evalution of cytotoxicity effect oftotal Saffrons extract on HepG2 cell line.Genet 3rd millennium, Kermanshah Univ Med, 14(1); 65-33. (Persian).

25.Xinsheng, Xu., Huixia, Lu., Huili, Lin., Xiaolu, Li., Meh, utNi., Chingjiang, Li. (2009). Aortic adventitial angiogenesisand lymphogiogenesis promote intimalinflammation and hyperplasia. Cardio vascular Patholyrgf, 18(5); 267-78.

26.Zafar Balanejad, S., Pariva, K., Baharara, J., Koochesfahani, H. (2009). The effect of kljmk; rapamycinon angiogenesis in chick chorioalantoic membrane. J Arak Univ Med Sci, 12(1); 73-80. [Persian].