بررسی تنوع ژنتیک جدایه های قارچ آلترناریا عامل بیماری لکه برگی مرکبات به روش IGS-RFLP

فصلنامه علمی پژوهشی دنیای میکروب ها

مقاله 3، دوره 6، شماره 2 (پیاپی 15)، تیر 1392، صفحه 117-131   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

علیرضا نیازمند^{* 1}؛ مریم رحمانی²؛ گیلدا نجفی پور¹

¹استادیار، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه بیماری شناسی گیاهی

²کارشناس ارشد، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد جهرم، گروه بیماری شناسی گیاهی

چکیده

سابقه و هدف: امروزه به منظور بررسی تفاوت های درون گونه ای و نژادی از روش RFLP ناحیه IGS استفاده می شود. این مطالعه با هدف شناسایی گونه های بیماری زای آلترناریا عامل تولید لکه برگی مرکبات با استفاده از روش های مورفولوژیک و توالی یابی ناحیه ITS1 در شهرستان ممسنی و نیز بررسی تفاوت های ژنتیکی جدایه های این قارچ بر اساس RFLP ناحیه IGS انجام گردید.
 مواد و روش ها: این پژوهش به صورت مقطعی- توصیفی بر روی70 نمونه برگی گونه ها و ارقام مختلف مرکبات دارای علایم ظاهری مانند لکه قهوه ای و لکه برگی جمع آوری شده از باغات مرکبات شهرستان ممسنی در پاییز سال 1390 انجام شد. نمونه ها بر روی محیط سیب زمینی آگار کشت گردیدند. پس از خالص سازی قارچ به روش تک اسپور، شناسایی گونه ها با استفاده از بررسی خصوصیات مورفولوژیک انجام گرفت. اثبات بیماری زایی جدایه ها با استفاده از اصول کخ روی برگ ها صورت گرفت. تکثیر نواحیITS1 و IGS با استفاده از آغازگرهای اختصاصی انجام پذیرفت. ناحیه ITS1 جدایه ها توالی یابی شدند و ناحیه IGS پس از برش با استفاده از آنزیم های برش دهنده با روش RFLP ارزیابی شد.
یافته ها: تمامی جدایه های مورد بررسی از لحاظ مورفولوژیک و توالی یابی ناحیه ITS1 به عنوان گونه آلترناریا آلترناتا شناسایی شدند. دندروگرام ترسیمی برای الگوهای برشی آنزیم های مورد استفاده، جدایه ها را در 3 گروه متمایز قرار داد. جدایه هایی که از ارقام پرتقال جمع آوری شده بودند همگی در یک گروه و جدایه های لیمو در یک گروه متمایز دیگر قرار گرفتند. همچنین جدایه لیموشیرین ویکوا در یک گروه کاملاً مجزا از سایر جدایه ها قرار گرفت.
نتیجه گیری: نتایج نشان داد که به کارگیری الگوهای برش آنزیمی ناحیه IGS می تواند مشکل مربوط به طبقه بندی جدایه های  آلترناریا آلترناتا مرکبات بر حسب نوع میزبان را که در حال حاضر مورد بحث بسیار زیادی می باشد تاحدودی حل نماید.

کلیدواژه‌ها

پرتقال؛ لیمو؛ لیمو شیرین؛ ITS1؛ آلترناریا آلترناتا

مراجع

1.         Fao: Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2012. FAO statistical yearbook.

2.         Annamous: Statics of Agriculture. In., vol. 2. Tehran: Minestry of agriculture; 2000: 275. [In Persian]

3.         Timmer LW, Solel Z, Gottwald TR, Ibanez AM, Zitko SE. Environmental factors affecting production, release, and field populations of conidia of Alternaria alternata, the cause of brown spot of citrus. Phytopathology 1998, 88(11):1218-1223.

4.         Gol Mohammadi M, Rahimian H, Bani HS, Taheri H. Occurrence of Brown Spot Disease of Page Mandarin in West of Mazandaran. J Agr Sci Nat. Resour. 2005. [In Persian]

5.         Peever TL, Ibanez A, Akimitsu K, Timmer LW: Worldwide phylogeography of the citrus brown spot pathogen, Alternaria alternata. Phytopathology 2002, 92(7):794-802.

6.         Takamatsu S, Hirata T, Sato Y. Phylogenetic analysis and predicted secondary structures of the rDNA internal transcribed spacers of the powdery mildew fungi (Erysiphaceae). Mycoscience 1998, 39(4):441-453.

7.         Hillis DM, Dixon MT. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. Q Rev Biol 1991:411-453.

8.         Anderson JB, Stasovski E. Molecular phylogeny of northern hemisphere species of Armillaria. Mycologia 1992:505-516.

9.         Henrion B, Le Tacon F, Martin F. Rapid identification of genetic variation of ectomycorrhizal fungi by amplification of ribosomal RNA genes. New Phytol 1992:289-298.

10.       Edel V, Steinberg C, Avelange I, Laguerre G, Alabouvette C. Comparison of three molecular methods for the characterization of Fusarium oxysporum strains. Phytopathology 1995, 85(5):579-585.

11.       Banik MT, Volk TJ, Burdsall Jr HH. Armillaria species of the Olympic Peninsula of Washington state, including confirmation of North American biological species XI. Mycologia 1996:492-496.

12.       Guidot A, Lumini E, Debaud JC, Marmeisse R. The nuclear ribosomal DNA intergenic spaces as a target sequence to study intraspecific diversity of the ectomycorrhizal basidiomycete Hebeloma cylindrosporum directly on Pinus roof systems. Appl Environ Microb 1999(65):903-909.

13.       Molina FI, Jong S-C, Huffman JL. PCR amplification of the 3^' external transcribed and intergenic spacers of the ribosomal DNA repeat unit in three species of Saccharomyces. FEMS Microbiol lett 1993, 108(3):259-263.

14.       Selosse MA, Costa G, Battista CD, Tacon FL, Marfin F. Meiotic segregation and recombination of the intergenic spacer of the the ribosomal DNA of the oomycetous fungus Pythium ultimum. Curr Genet 1996(17):125-127.

15.       Vilgalys R, Hester M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. J Bacteriol 1990, 172(8):4238-4246.

16.       Chen W. Restriction fragment length polymorphism in enzymatically amplified ribosomal DNAs of three heterothallic Pythium species. Phytopathology 1992, 82(12):1467-1472.

17.       Edel V, Steinberg C, Gautheron N, Alabouvette C. Evaluation of restriction analysis of polymerase chain reaction (PCR)-amplified ribosomal DNA for the identification of Fusarium species. Mycol Res 1997, 101(2):179-187.

18.       Simmons EG. Alternaria: an identification manual: Am Soc Microbiol, 2007.

19.       Stewart Jr CN, Via LE. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications. Biotechniques 1993, 14(5):748-750.

20.       Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. PCR protocols: a guide to methods and applications: Academic press; 1990.

21.       White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Edited by Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. San Diego, CA: Academic Press; 1990: 315-322.

22.       Hong SG, Cramer RA, Lawrence CB, Pryor BM. Alt a 1 allergen homologs from Alternaria and related taxa: analysis of phylogenetic content and secondary structure. Fungal Genet Biol 2005, 42(2):119-129.

23.       Ershad D. Fungi of Iran. Publications Department of botany 1995(10):277. [In Persian]

24.       Rouhibakhsh A, Ershad D. An investigation on mycoflora of citrus necrotic spots in Western part of Mazandaran. Iranian J Plant Pathol 1997(33):94 - 110. [In Persian]

25.       Banihashemian S, Zad J, Hedjaroud GA, Okhovvat SM, Mosahebi GH. Albinism in citrus seedlings. Iranian J Agric Sci 2001, 32(2):345-354. [In Persian]

36.       Kohmoto K, Akimitsu K, Otani H. Correlation of resistance and susceptibility of citrus to Alternaria alternata with sensitivity to host-specific toxins. Phytopathology 1991, 81(7):719-722.

27.       Kohmoto K, Scheffer RP, Whiteside JO. Host-selective toxins from Alternaria citri [from lemon and tangerine trees in Florida]. Phytopathology 1979, 69.

28.       Palm ME, Civerolo EL. Isolation, pathogenicity, and partial host range of Alternaria limicola, causal agent of mancha foliar de los citricos in Mexico. Plant Dis 1994, 78.

29.       Peever TL, Olsen L, Ibanez A, Timmer LW. Genetic differentiation and host specificity among populations of Alternaria spp. causing brown spot of grapefruit and tangerine and grapefruit hybrids in Florida. Phytopathology 2000, 90(4):407-414.

30.       Timmer LW, Peever TL, Solel Z, Akimitsu K. Alternaria diseases of citrus-novel pathosystems. Phytopathol Mediterr 2003, 42(2):99-112.

31.       Golmohammadi M, Andrew M, Peever TL, Peres NA, Timmer LW. Brown spot of tangerine hybrid cultivars Minneola, Page and Fortune caused by Alternaria alternata in Iran. Plant Pathology 2006, 55(4): 578-587.

32.       Peay KG, Kennedy PG, Bruns TD. Fungal community ecology: a hybrid beast with a molecular master. Bioscience 2008, 58(9):799-810.

33.       Pryor BM, Michailides TJ. Morphological, pathogenic, and molecular characterization of Alternaria isolates associated with Alternaria late blight of pistachio. Phytopathology 2002, 92(4):406-416.

34.       Appel DJ, Gordon TR. Relationships among pathogenic and nonpathogenic isolates of Fusarium oxysporum based on the partial sequence of the intergenic spacer region of the ribosomal DNA. Mol. Plant Microbe In1996, 9(2):125-138.

35.       Pecchia S, Mercatelli E, Vannacci G. PCR amplification and characterization of the intergenic spacer region of the ribosomal DNA in Pyrenophora graminea. FEMS Microbiol lett 1998, 166(1):21-27.

36.       Slippers B, Wingfield BD, Coutinho TA, Wingfield MJ. DNA sequence and RFLP data reflect geographical spread and relationships of Amylostereum areolatum and its insect vectors. Mol Ecol 2002, 11(9):1845-185.

37.       Pantou MP, Mavridou A, Typas MA. IGS sequence variation, group-I introns and the complete nuclear ribosomal DNA of the entomopathogenic fungus Metarhizium: excellent tools for isolate detection and phylogenetic analysis. Fungal Genet Biol  2003, 38 (2): 159-174.

38.       Hong SG, Liu D, Pryor BM. Restriction mapping of the IGS region in Alternaria spp. reveals variable and conserved domains. Mycol Res 2005, 109(1):87-95