بررسی اثر پروبیوتیک کلوستات (Bacillus subtilis) بر روی برخی از شاخص‌های رشد، خونی و همچنین بافت روده ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchus mykiss)

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 8، دوره 13، شماره 1 - شماره پیاپی 48، دی 1398، صفحه 85-96   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

مهرزاد محمدی¹؛ سجاد پورمظفر^{* 2}؛ محسن گذری³

¹دانشکده شیلات، دانشگاه خلیج فارس بوشهر، بوشهر، ایران.

²ایستگاه تحققیاتی نرمتنان خلیج فارس، پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور، سازمان تحقیقات،

³ایستگاه تحقیقاتی نرمتنان خلیج فارس، پژوهشکده اکولوژی خلیج فارس و دریای عمان، موسسه تحقیقات علوم شیلاتی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی (AREEO)، بندر لنگه، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: امروزه در صنعت آبزی پروری، استفاده از پروبیوتیک­هابه عنوان جایگزین مناسب آنتی بیوتیک­هاافزایش چشمگیری داشته است.این مطالعه به بررسی اثر رژیم خوراکی حاوی پروبیوتیک تجاریB. subtilis(KEMIN^®)بر شاخص‌های رشد، خونی و مورفولوژی بافت روده در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان (Oncorhynchos mykiss) پرداخته است.
روش کار: در این مطالعه تعداد 135 عدد ماهی با وزن 5/2±68/35 گرم با رژیم غذایی حاوی پروبیوتیک باسیلوس به مدت 50 روز تغذیه شدند. تیمارها شامل سه جیره آزمایشی حاوی گروه شاهد(بدون پروبیوتیک)، 1 و 2 درصد پروبیوتیک بود. در پایان دوره از ماهی ها به صورت تصادفی نمونه برداری شد. به منظور بررسی شاخص­های خونی(تعداد گلبول­های سفید و قرمز، هماتوکریت، هموگلوبین و شمارش افتراقی گلبول­های سفید)خون گیری از سیاهرگ دمی انجام و طول و عرض پرزهای روده، اندازه و تراکم سلول­های جامی شکل در بررسی بافت شناسی اندازه­گیری گردید. هم­چنین شاخص­های رشد نیز مورد سنجش قرار گرفت. 
یافته ها: در پایان دوره تغذیه، عملکرد رشد نسبت در تیمارهای پروبیوتیک نسبت به تیمار شاهد افزایش معنی‌داری داشت(05/0p<). به‌علاوه، در ماهی‌های تغذیه شده با پروبیوتیک تعداد گلبول‌های قرمز، نوتروفیل و ارتفاع برآمدگی روده افزایش معنی‌داریدر مقایسه با تیمار شاهد داشت(05/0p <). تفاوت معنی‌داری در برخی شاخص‌های خونی(تعداد گلبول‌های سفید، هماتوکریت، هموگلوبین، نوتروفیل و مونوسیت) و مورفولوژی روده(عرض برآمدگی روده، اندازه و تراکم سلول‌های جامی شکل) مشاهده نشد(05/0p >).
نتیجه گیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که استفاده خوراکی از پروبیوتیک B. subtilis اثرات سودمند و مثبت بر پارامترهای رشد، خونی و هم­چنین بافت روده ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان داشت.

کلیدواژه‌ها

کلمات کلیدی: B. subtilis؛ رشد؛ پارامترهای خونی؛ بافت روده؛ قزل‌آلای رنگین‌کمان

اصل مقاله

مقدمه

 

امروزه استفاده از روش‌های فوق متراکم در صنعت آبزی‌پروری از رشد چشم­گیری برخوردار بوده است، اما این شیوه پرورش موجب بروز بیماری‌ها و آلودگی‌ها شد، که خسارات جبران‌ناپذیری را به این صنعت وارد کرد. معمولاً برای جلوگیری و درمان این بیماری‌ها از طیف وسیعی از آنتی‌بیوتیک‌ها به صورت گسترده استفاده شد، ولی به دلیل اثرات منفی بر محیط‌زیست، میزبان و انسان استفاده از آن روز به روز محدود و حتی در برخی از کشورها ممنوع اعلام شد. در جانور میزبان، آنتی‌بیوتیک موجب از بین بردن فلور سودمند میکروبی در روده، کاهش رشد و بروز مقاومت باکتریایی شدند(15). بنابراین علاقه‌مندی شدیدی در جایگزینی از این مواد و استفاده از روش‌های دوستدار محیط‌زیست به وجود آمد. یکی از این روش‌ها استفاده از پروبیوتیک­ها بود، که در متعادل کردن فلور میکروبی میزبان نقش مهم و تأثیرگذاری را ایفا کردند. پروبیوتیک­ها بایستی توانایی استقرار و تکثیر در روده میزبان را داشته باشند، در غیر این صورت اثرات منفی و نامطلوبی را بر جای خواهد گذاشت(23). مکانیسم اثر پروبیوتیک­های استفاده شده در آبزی‌پروری عبارت‌اند از: جلوگیری از رشد عوامل بیماری‌زا با تولید مواد مهارکننده، بهبود کیفیت آب، بهبود سیستم ایمنی میزبان، افزایش جذب مواد غذایی و ترشح آنزیم‌های گوارشی(31). پروبیوتیک باسیلوس سابستیلیس(B.subtilis) یک باکتری ساپروفیت گرم مثبت، غیر بیماری‌زا و اسپور آن در آب، هوا، خاک و رسوبات یافت می‌شود(26). هم­چنین آن‌ها قادر به تحمل شرایط ناپایدار هم­چون دماهای بالا و قرار گرفتن در شرایط خشکی می‌باشند(26). این باکتری اثرات مثبتی بر رشد، جذب مواد غذایی(24)، کیفیت آب و بقاء در مواجهه با گونه‌های بیماری‌زا(9) در ماهیان و سخت‌پوستان داشته است. هم­چنین باسیلوس به آنتی‌بیوتیک‌ها در نفوذ به لایه چسبناک اطراف باکتری‌های گرم منفی کمک می‌کند. بهبود پارامترهای رشد در پاسخ به رژیم غذایی حاوی پروبیوتیک باسیلیوس در ماهی تیلاپیا(Yoshitomi tilapia)(24). تیلاپیای نیل(Oreochromis niloticus)(19)، میگوی وانامی(Litopenaeus vannamei)(29)، میگوی بزرگ آب شیرین(Macrobrachium rosenbergii)(19) و قزل‌آلای رنگین‌کمان(21) گزارش شده است. لوله گوارشی در مهره‌داران عموماً وظیفه هضم، گوارش و جذب مواد غذایی را بر عهده داشته و انواع مختلفی از باکتری‌ها با تراکم‌های مختلف در این قسمت حضور دارند که در متابولیسم میزبان اثرگذار می‌باشد. در پرورش آبزیان بالا بردن عملکرد سیستم گوارشی و مقاومت نسبت به عوامل بیماری‌زا، از اهمیت زیادی برخوردار است. روده در ماهیان بافت پوششی ساده‌ای دارد که در بین آن سلول‌های جامی شکل مسئول ترشح موکوس حضور دارند(20). موکوس تولیدی به وسیله سلول‌های جامی شکل از کاهش آب و لیز شدن مجاری روده‌ای جلوگیری می‌کند و روده را از آسیب‌های فیزیکی و عوامل مضر مصون می‌دارد(18). از این رو، مطالعه آن به عنوان مانع فیزیکی و هم­چنین درگیر در فرآیندهای فیزیولوژیکی از اهمیت دو چندانی برخوردار می‌باشد. هم چنین، این بخش به همراه پوست و آبشش به عنوان یکی از راه‌های اصلی نفوذ عوامل بیماری‌زا در موجودات آبزی شناخته می‌شود. بر همین اساس، استخراج باسیلوس سابستیلیس از روده ماهی آمور (Ctenopharyn godonidella) و استفاده آن در رژیم غذایی موجب کاهش تعداد کلونی‌های باکتری Aeromonas hydrophila و آسیب بافتی به روده پس از مواجهه شد. هم­چنین باکتری باسیلوس سابتیلیس نقش مهمی در حفظ یک­پارچگی و انسجام برآمدگی­های روده­ای داشت(8). به علاوه، مطالعات پیشین نشان داده است که استفاده خوراکی از سطوح مختلف باسیلوس سابستیلیس به مدت 60 و 28 روز منجر به  بهبود عملکرد روده به ترتیب در تیلاپیای نیل(20) و ماهی شانک(Sparus aurata) می‌شود(2). بافت و اجزای لوله‌ی گوارشی هم­چون سلول‌های جامی شکل(سلول‌های ترشح‌کننده موکوس)، معمولاً به تغییر در رژیم غذایی حساس می‌باشند. Ramos و همکاران (2017)(18)، و Fernandes و همکاران(2015)(4) نشان دادند که افزودن پروبیوتیک­ها در رژیم غذایی ماهی تیلاپیای نیل(Oreochromis niloticus) منجر به تغییر تعداد سلول‌های جامی شکل، عملکرد جذب و گوارش مواد غذایی خواهد شد. در مطالعه دیگر، تجویز خوراکی باکتری باسیلوس سابتیلیس به میزان 10⁵ و 10⁸ کلونی در هر کیلوگرم موجب بهبود ترشح آنزیم­های هضمی و شاخص های رشد هم­چون افزایش وزن ثانویه و ضریب رشد در میگوی وانامی شد(7). خالقی و همکاران(1397)، بیان کردند که مخلوط تجاری حاوی سویه های باسیلوسی نقش مهمی در افزایش وزن و بهبود شاخص­های رشدی ماهی کپور معمولی(Cyprinus carpio)دارد(1).علاوه بر این، تخمیر سویا به وسیله ی باکتری باسیلوس واستفاده آن در جیره­ی غذایی خوک، اثر سودمند و مفیدی در بهبود رشد از طریق کاهش التهاب غذایی داشت(30). حتی مواد استحصالی از این باکتری نقش مهمی در بهبود شاخص های فیزیولوژیکی آبزیان نقش داشته است. به عنوان مثال، شاخص های ایمنی و هم­چنین عملکرد رشد ماهی Yoshitomi tilapia پس از تغذیه با ماده استخراجی از باکتری باسیلوس سابتیلیس(1-Deoxynojirimycin)افزایش یافت(20). با توجه به مطالب عنوان شده در فوق، هدف از انجام این تحقیق، ارزیابی پتانسیل پروبیوتیک تجاری حاوی باکتری باسیلوس سابستیلیس بر عملکرد رشد، شاخص‌های خونی و بافت‌شناسی روده ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان(Oncorhynchus mykiss) می‌باشد.

مواد و روش‌ها

تأمین ماهی

135 عدد ماهی قزل‌آلای رنگین کمان(Oncorhynchu mykiss) به ظاهر سالم با وزن تقریبی 50/2 ± 68/35 گرم از مزارع تکثیر و پرورش است از فارس خریداری و در تانک‌های مخصوص حمل ماهی با تزریق اکسیژن خالص به محل اجرای پروژه انتقال داده شد. بعد از انتقال و انجام عمل هم‌ دمایی، برای جلوگیری از وارد آمدن استرس به مدت 24 ساعت قطع غذا شدند. ماهیان در آکواریوم‌های 64 لیتری(‌با ابعاد 40 × 40 سانتی‌متر طول و عرض و ارتفاع آبگیری 40 سانتی‌متر‌) نگهداری شدند. به طوری که135 عدد ماهی در9 آکواریوم و هرآکواریوم 15 عدد ماهی بعد از زیست ‌سنجی اولیه نگهداری شد. چیدمان آکواریوم‌ها به صورت تصادفی انتخاب شدند تا تیمارها و تکرار‌های مختلف در شرایط یکسان محیط آزمایشگاهی قرار گیرند. طول دوره پرورش 50 روز در نظر گرفته شد. عوامل فیزیکی آب شامل درجه حرارت(2/0 ± 16 درجه سانتی گراد)، اکسیژن محلول(9-7 میلی‌گرم در لیتر)، pH(15/8-25/7میلی‌گرم در لیتر)، و شوری(5/2- 74/2 گرم در لیتر) همه روزه به وسیله دستگاه‌های دیجیتال قابل حمل WTW با دقت 01/0 اندازه‌گیری شد.

غذادهی

جیره غذایی به صورت اکسترودر با علامت اختصاری(EX-TG1‌) از شرکت تعاونی 21 بیضاء خریداری و مورد استفاده قرار گرفت. متوسط ترکیبات غذایی، پروتئین خام 45%، چربی خام 14%، فیبر خام 2%، رطوبت 10% و قطر خوراک 4/2 میلی‌متر بود. میزان غذادهی به ماهیان 5/1 درصد وزن توده زنده بودکه در دو نوبت صبح و بعد از ظهر به ماهیان خورانده‌ شد. میزان غذادهی براساس جداول غذادهی توصیه شده توسط شرکت سازنده خوراک ماهی تعیین گردید. پروبیوتیک استفاده شده در این پژوهش با نام تجاری کلوستات(KEMIN^®) حاوی باکتری باسیلوس سابستیلیس بود که به روش خوراکی به ماهی خورانده شد. کلوستات حاوی باسیلوس سابستیلیس به میزانcfu/g10⁷× 2/2، کربنات کلسیم، روغن سویا و مالتو دکسترین بود. جهت جلوگیری از پرت شدن غذا، غذادهی زمانی که ماهی‌ها حرکات فعال تغذیه‌ای نشان می‌دادند، انجام می گردید. روزانه 50% درصد از آب آکواریوم‌ها جهت جلوگیری از کمبود اکسیژن تعویض شد. جهت تهیه پلت حاوی پروبیوتیک از روش(27) استفاده گردید، بدین ترتیب که 1 و 2 گرم کلوستات به ازای هر100 گرم غذا، با روغن ماهی(‌32 میلی‌لیتر به ازای هر کیلوگرم غذا) مخلوط و سپس سوسپانسیون کلوستات و روغن بر روی غذا اسپری شد. مقادیر پروبیوتیک استفاده شده در این پژوهش براساس مطالعه انتخاب و مورد استفاده قرار گرفت(11، 3).

رشد

وزن هر ماهی در انتهای دوره آزمایش با استفاده از ترازوی دیجیتال AND مدل C0006 با دقت 01/0 گرم ساخت کشور ژاپن مورد اندازه‌گیری شد. افزایش وزن، رشد روزانه، ضریب رشد ویژه، درصد افزایش وزن و ضریب تبدیل غذایی از جمله مهم‌ترین فاکتورهایی بودند که مورد بررسی قرار گرفت.

وزن اولیه – وزن نهایی = افزایش وزن

متوسط وزن نهایی) ×100 = درصد افزایش وزن متوسط وزن اولیه - (/متوسط وزن اولیه

تعداد روزهای پرورش / افزایش وزن متوسط ماهی‌ها= میزان رشد یا افزایش وزن روزانه

طول دوره پرورش / (لگاریتم طبیعی وزن اولیه – لگاریتم طبیعی وزن ثانویه) _˟ 100 = ضریب رشد ویژه                           
افزایش وزن توده زنده / مقدار غذای مصرفی = ضریب تبدیل غذایی

خون‌گیری

نمونه‌گیری از خون ماهیان بی‌هوش شده(‌ازهرتکرار3عدد‌) با عصاره گل میخک(170 میلی گرم در لیتر) بعداز زیست‌سنجی با فرو بردن سرنگ 5/2 میلی‌لیتری آغشته به ماده ضد انعقاد هپارین در سیاهرگ دمی و 50روز بعداز شروع آزمایش انجام پذیرفت. شمارش گلبول‌های سفید و گلبول‌های قرمز با استفاده از محلول دایسیس(Dacies fluid) با رقیق کردن خون با غلظت 50:1 از طریق لام هموسیتومتر انجام شد. شمارش افتراقی گلبول‌های سفید با تهیه گسترش خونی و با استفاده از گیمسا 5 درصد(ARJ:1013) به مدت 45 دقیقه انجام گردید. هماتوکریت به روش میکروسانتریفیوژ و با استفاده از لوله‌های میکرو هماتوکریت هپارینه اندازه گیری شد. هم­چنین میزان هموگلوبین خون نیز با استفاده از روش سیانومت هموگلوبین مورد سنجش قرار گرفت(25).

نمونه‌برداری از روده

به منظور بررسی تغییرات احتمالی مورفولوژیک روده ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان در پایان دوره پرورش 6 عدد ماهی از هر تیمار به صورت تصادفی انتخاب و نمونه بافت روده از محل یکسانی بر‌داشته شد. ابتدا نمونه‌ها در محلول 10 درصد فرمالین برای 3 روز فیکس، سپس برای نگهداری بیشتر وارد محلول اتانول 70 درصد تا زمان بررسی شدند. برش عرضی(7-5 میکرون) با استفاده از میکروتوم تهیه و سپس نمونه‌ها با ائوزین-هماتوکسیلین رنگ‌آمیزی گردیدند(17). به منظور بررسی طول(ارتفاع) و عرض چین‌خوردگی روده(میکرومتر)، تراکم(تعداد در هر میلی‌متر مربع) و اندازه سلول‌های جامی شکل(میکرومتر مربع)، 8 تصویر از هر نمونه تهیه شد(شکل 1). از نرم‌افزارDigimizer(Version 4.1.1.1)، برای تخمین و اندازه‌گیری شاخص های فوق استفاده شد.

آنالیز داده‌ها

 پراکنش نرمال بودن داده‌ها با استفاده از آزمون کلموگراف - اسمیرنوف مورد سنجش قرار گرفت. با توجه به نرمال بودن داده­ها، اختلاف موجود بین تیمارها در قالب یک طرح کاملاً تصادفی در 3 تیمار و 3 تکرار تعیین شد و نتایج حاصله با استفاده از آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه، با استفاده از نرم­افزار SPSS 18مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. جهت مقایسه میانگین­ها از تست LSD در سطح احتمال 95 درصد استفاده شد(16).

نتایج

نتایج حاصل از زیست‌سنجی ماهیان در پایان دوره آزمایش در جدول 1 نشان داد که پروبیوتیک باسیلوس قادر به ارتقاء شاخص‌های رشد قزل‌آلای رنگین‌کمان می‌باشد. بر همین اساس بالاترین میزان وزن ثانویه در تیمارهای 1(35/3±14/62) و 2 درصد باسیلوس(35/1±90/63) به ثبت رسید که اختلاف معنی‌داری با تیمار شاهد داشت(05/0p <). افزایش معنی‌داری در مقدار ضریب رشد ویژه در تیمار 1 و 2 درصد کلوستات(به ترتیب 11/0±15/1 و 04/0±17/1) در مقایسه با تیمار شاهد مشاهده شد(05/0p <). میزان رشد روزانه در تیمارهای حاوی پروبیوتیک حدود 54/0-57/0 گرم بود که در مقایسه با تیمار شاهد افزایش معنی‌داری داشت(05/0p <). افزایش وزن و درصد افزایش وزن در تیمار 2 درصد در مقایسه با سایر تیمارها افزایش داشت و این اختلاف با تیمار 1 درصد معنادار نبود(05/0p >)، اما هر دوی آن‌ها افزایش معنی‌داری نسبت به تیمار شاهد نشان دادند(05/0p <). در تیمارهای تحت تأثیر کلوستات، ضریب تبدیل غذایی بین 26/1-30/1 بود که کاهش معنی‌داری نسبت به تیمار شاهد داشت (05/0p <).

فاکتورهای خونی:بالاترین میزان گلبول قرمز در تیمار کلوستات 2درصد(75/68 ±25/1081) مشاهده شد که اختلاف معنی‌داری با تیمار شاهد (71/19±75/959) داشت(05/0p<). تعداد گویچه‌های سفید از 90/12(هزار عدد در هر میلی‌متر مکعب) در تیمار شاهد به حدود 07/14 تا 30/14(هزار عدد در هر میلی‌متر مکعب) در تیمارهای حاوی کلوستات رسید که اختلاف معنی‌داری بین آن‌ها مشاهده نشد(05/0p >). درصد لنفوسیت موجود در خون در تیمارهای آزمایشی روند کاهشی را نشان داد به طوری که از 85 درصد در تیمار شاهد به 68 درصد در تیمار 2 درصد کلوستات کاهش یافت و این اختلاف معنی‌دار بود(05/0p<). در حالی که درصد نوتروفیل در تیمار 2 درصد کلوستات افزایش حدود 127 درصدی نسبت به تیمار شاهد و 78 درصدی نسبت به تیمار 1 درصد داشت(05/0p<). به علاوه، تفاوت معنی‌داری در درصد مونوسیت، هماتوکریت و هموگلوبین میان تیمارهای مختلف  مشاهده نشد(05/0p>).

بافت داخلی روده: برخی مشخصه‌های مورفومتریک بافت روده هم­چون ارتفاع و عرض پرزها و هم­چنین تراکم و اندازه سلول‌های جامی شکل در جدول 3 نمایش داده شده است. بیشترین ارتفاع به ترتیب در تیمار 1 درصد(69/9±23/401 میکرومتر) و 2 درصد کلوستات(35/14±02/361 میکرومتر) به ثبت رسید که اختلاف معنی‌داری با تیمار شاهد داشت(05/0p<). با وجود افزایش عرض چین خوردگی­ها(میکرومتر) در تیمارهای آزمایشی، اما تفاوت معنی‌داری بین آن‌ها مشاهده نشد به‌طوری که اندازه این شاخص بین 20/3±61/58 میکرومتر در تیمار شاهد و 83/2±09/61 میکرومتر در تیمار 2 درصد پروبیوتیک متغیر بود(05/0p>). افزایش اندکی در تعداد سلول‌های جامی شکل در هر میلی‌متر مربع در تیمارهای حاوی کلوستات مشاهده شد، اما تفاوتی از لحاظ آماری در تیمارها به ثبت نرسید(05/0p>). اندازه سلول‌های جامی شکل در تیمارهای 1 و 2 درصد کلوستات به ترتیب برابر با 23/14±223 و 94/17±218 میکرومتر مربع بود که در مقایسه با تیمار شاهد 77/18±11/247 اختلاف آماری به ثبت نرسید(05/0p>).

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 1- مقایسه میانگین شاخص‌های رشد در تیمارهای حاوی پروبیوتیک کلوستات در طی یک دوره 50 روزه.

(اطلاعات بر مبنای میانگین±انحراف معیار بوده و حروف غیر همنام نشان دهند تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0 است).

تیمار
شاخص‌های رشد	تیمار شاهد	1 % کلوستات	2 % کلوستات
وزن اولیه(gr)	a 34/0± 70/50	a42/0±35	a56/0±58/35
وزن نهایی(gr)	b66/0±75/56	a35/3±14/62	a35/1±90/63
ضریب رشد ویژه	b01/0±98/0	a11/0±15/1	a04/0±17/1
میزان رشد روزانه(gr)	b01/0±44/0	a07/0±54/0	a02/0±57/0
افزایش وزن (gr)	b33/0±05/22	a30/3±14/27	a19/1±31/28
درصد افزایش وزن بدن(%)	b18/1±54/63	a37/9±54/77	a50/3±58/79
ضریب تبدیل غذایی	a03/0±57/1	b17/0±30/1	b06/0±26/1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2- مقایسه میانگین شاخص‌های خونی در تیمارهای حاوی پروبیوتیک کلوستات در طی یک دوره 50 روزه.

(اطلاعات بر مبنای میانگین±انحراف معیار بوده و حروف غیر همنام نشان‌دهنده تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0 است).

تیمار
شاخص‌های خونی	تیمار شاهد	1 % کلوستات	2 % کلوستات
گویچه قرمز ×(103) عدد در هر میلی‌لیتر مکعب	b71/19±75/959	ab79/25±33/966	a75/68 ±25/1081
گویچه سفید × ( 103) عدد در هر میلی‌لیتر مکعب	85/1±90/12	41/1±30/14	52/1±07/14
درصد لنفوسیت	a46/3±85	ab1±80	b58/10±68
درصد نوتروفیل	b21/3±33/12	b53/1±67/15	a17/9±28
درصد مونوسیت	58/0±33/2	1±3	53/1±33/3
هماتوکریت (%)	55/0±83/34	99/0±52/33	74/0±94/33
هموگلوبین (گرم در دسی لیتر)	87/0±1/7	54/0±63/6	61/0±80/6

 

 

 

 

 

 

A

جدول 3- مشخصه های مورفومتریک بافت روده ماهی قزل آلای رنگین کمان تغذیه شده با پروبیوتیک باسیلوس سابتیلیس

تیمار
شاخص های روده ای	تیمار شاهد	1 % کلوستات	2 % کلوستات
ارتفاع پرزهای روده (میکرومتر)	c44/11±16/295	a69/9±23/401	b35/14±02/361
عرض پرزهای روده (میکرومتر)	20/3±61/58	09/1±74/59	83/2±09/61
تعداد سلول­های جامی شکل (در هر میکرومتر مربع)	2/0±29/3	25/±53/3	19/0±95/3
اندازه سلول­های جامی شکل  (در هر میکرومتر مربع)	77/18±11/247	23/14±223	94/17±218

 

B

 

 

C

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1- مقطع عرضی از روده ماهی قزل الای رنگین کمان رنگ آمیزی شده با استفاده از ائوزین- هماتوکسیلین.

طول (ارتفاع) (فلش دو طرفه سیاه)، عرض چین خوردگی ها (فلش دو طرفه زرد رنگ) و سلول های جامی شکل (فلش سیاه). بزرگنمایی 1400×.  A: تیمار شاهد، B: تیمار 1 % و C: تیمار 2 % کلوستات

 

 

بحث و نتیجه گیری

نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که افزودن پروبیوتیک کلوستات حاوی سویه باکتریایی باسیلوس سابستیلیس موجب بهبود پارامترهای رشد در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان شد، که با نتایج حاصل از مطالعات پیشین مطابقت و هم­خوانی دارد. به عنوان مثال، رژیم غذایی حاوی سطوح مختلف پروبیوتیک B.subtilis و B. licheniformis(5/0، 7/0 و 9/0 گرم به ازای هر کیلوگرم غذا) منجر به بهبود عملکرد رشد در ماهی کپور معمولی شد(1). هم­چنین افزایش مقدارB.subtilisبه میزان(cfu/g) 10¹⁰×23/4 در خوراک ماهی تیلاپیا(Yoshitomi tilapia) افزایش رشد و ضریب رشد ویژه را پس از 56 روز به دنبال داشت(24).Sun  و همکاران گزارش دادند که استفاده خوراکی از باسیلوس­ها به مدت 60 روز و به مقدار(cfu/g)10⁸×1 منجر به افزایش 7-5 درصدی ضریب تبدیل غذایی در ماهیان انگشت قد هامور معمولی(Epinephelu scoioides) شد(23). به علاوه، در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان، استفاده خوراکی از مخلوطی از پنج گونه باسیلوس (10⁶×1، 10⁷×1 و 10⁸×1 در هر 100 گرم غذا) به مدت 60 روز افزایش شاخص‌های رشد و بهبود کارایی پروتئین و چربی را به دنبال داشت(21).Hussein  و همکاران، از پروبیوتیک تجاری با نام Biogen^® دارای باکتری باسیلوس به همراه آنزیم‌های هضمی(آمیلاز، لیپاز و پروتئاز) و پرولیتیکی به مدت 183 روز استفاده کردند و نتایج حاصل نشان داد که وزن نهایی ماهی کپور معمولی(Cyprinus carpio) از 20 گرم به 919 گرم و ضریب رشد ویژه از 47/3 به 73/3 ارتقاء یافت(7). اثر مثبت باسیلوس ها تنها محدود به ماهیان نمی شود به طوری که در میگوی سفید هندی(Fenneropenaeus indicus) موجب افزایش حدود 23-8 درصد وزن ثانویه(31) و در میگوی وانامی (Litopenaeusvannamei) پس از 56 روز تغذیه، بهبود پارامترهای رشد رابه دنبال داشت(29،32). رژیم حاوی پروبیوتیک ها معمولاً با افزایش هضم و جذب غذا از طریق ترشح آنزیم‌های خارج سلولی، تعادل در فلور میکروبی روده و هم­چنین افزایش تجزیه مواد آلی موجب بهبود عملکرد رشد در آبزیان می‌شوند. باسیلوس­ها عمدتاً با بهبود آنزیم‌های هضمی از جمله لیپاز، آمیلاز و پروتئاز و هم­چنین سنتز اسیدهای چرب و ویتامین‌ها در روده موجب افزایش هضم غذا و افزایش رشد در ماهیان می‌شوند(13). مطابق با این نتایج، Yanbo و Zirong گزارش کردند که استفاده از باسیلوس پروبیوتیکی لیوفلیزهBacillussp)) و باکتری‌های فتوسنتز کننده(Photosynthetic bacteria) و مخلوط آن‌ها در تغذیه نوزاد ماهی کپور معمولی(Cyprinus carpio) فعالیت آنزیم‌های گوارشی آمیلاز، لیپاز و پروتئاز در تیمار‌های آزمایشی را نسبت به گروه شاهد به طور معنی‌داری افزایش داد و ضریب تبدیل غذایی از 46/2 به 11/2 درصد کاهش یافت(28). براساس نتایج این مطالعه افزایش معنی‌داری در تعداد گویچه‌های قرمز تیمارهای حاوی پروبیوتیک مشاهده شد، هر چند که این اختلاف تنها در تیمار 2 درصد کلوستات معنی‌دار بود. از طرفی افزایش اندک در تعداد گلبول‌های سفید تیمارهای حاوی کلوستات به ثبت رسید، اما فاقد اختلاف معنادار بود. بر همین اساسFirouzbakhsh و همکاران، بیان داشتند که استفاده خوراکی از پروبیوتیک پروتکسین، باعث افزایش تعداد گلبول‌های سفید وقرمز در ماهی اسکار(Astronotus ocellatus) می‌شود(5). هم­چنین استفاده خوراکی از پروبیوتیک تجاری با نام دی پرو آکوا به مدت 60 روز موجب افزایش تعداد گلبول‌های قرمز و تعداد نوتروفیل­های خون ماهی کپور معمولی شد(1). در مطالعه دیگر، افزایش اندکی در تعداد گلبول‌های قرمز تیلاپیای نیل(Oreochromis niloticus) پس از تغذیه با پروبیوتیک B.amyloliquefaciensبه میزان(cfu/g^-1) 10⁶×5 مشاهده شد، اما اختلاف میان تیمارها معنی‌دار نبود. هم­چنین، افزایش تعداد گلبول‌های سفید و قرمز را در ماهی تیلاپیای نیل پس از تغذیه با پروبیوتیک B. amyloliquefaciens مشاهده شد(20). به نظر می‌رسد که افزایش گلبول‌های قرمز مبین این موضوع است که متابولیسم بالا و افزایش اکسیژن مورد نیاز برای متابولیسم غذا، منجر به افزایش گلبول‌های قرمز خون در ماهیان تغذیه شده با جیره غذایی آغشته به پروبیوتیک­ها شده و در نهایت از این طریق اکسیژن مورد نیاز بافت‌ها تأمین می‌شود(4). به علاوه، اندازه‌گیری شاخص‌های خونی هم­چون گلبول قرمز، هماتوکریت و هموگلوبین می‌تواند در تشخیص میزان سلامتی، بیماری و یا حتی استرس مهم و تأثیرگذار باشد. رژیم غذایی حاوی مخلوط تجاری Lactobacillus plantarum و B.subtilis به میزان(cfu/g^-1) 10⁷×1 به مدت 60 روز تأثیری بر تعداد گلبول‌های سفید، میزان هماتوکریت و هموگلوبین در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان نداشت(22). افزایش تعداد نوتروفیل­ها در این مطالعه می‌توان به عنوان یک تقویت‌کننده غیراختصاصی در سیستم ایمنی و افزایش توانایی بیگانه‌خواری ناشی از مصرف پروبیوتیک دانست(6). نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داد که تجویز خوراکی پروبیوتیک کلوستات به میزان 1 درصد باعث افزایش ارتفاع پرزهای روده نسبت به تیمار شاهد شد. هر چند که تراکم سلول‌های جامی شکل در تیمارهای حاوی پروبیوتیک کلوستات افزایش داشت، اما این افزایش معنی‌دار نبود. به علاوه، در سایر پارامتر‌های مورد بررسی هیچ اختلاف معنی‌داری در تیمار‌های حاوی پروبیوتیک کلوستات نسبت به گروه تیمار مشاهده نشد.Fernandes  و Reda گزارش دادند که استفاده از پروبیوتیک B. amyloliquefaciens در غذای ماهی تیلاپیای نیل(Oreochromis niloticus) موجب افزایش معنی‌دار ارتفاع روده و تراکم سلول‌های جامی شکل شد(4،20). به‌علاوه غذای غنی شده با اینولین به میزان 10 گرم در هر کیلوگرم غذا موجب افزایش اندک تعداد سلول‌های جامی شکل در ماهی شانک شد(2). افزایش ارتفاع برآمدگی‌های روده می‌تواند ناشی از تکثیر و پراکندگی پروبیوتیک در روده باشد، بهبود این عامل مزیتی برای افزایش سطح جذب و دسترسی به مواد غذایی می‌باشد که متعاقباً افزایش رشد را به دنبال خواهد داشت(20). هم­چنین مشابه با این نتایج در ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان بعد از 5 هفته تغذیه با Pediococcus acidilactici(10) و ماهی تیلاپیای نیل بعد از 30 روز  تغذیه با Lactobacillus rhamnosus(14) مشاهده شد. در مطالعه‌ای دیگر به بررسی اثر خوراکی پروبیوتیک حاوی B. subtilis و B. toyoi به میزان 4 گرم در هر کیلوگرم غذا در بافت روده ماهی تیلاپیای نیل پرداخته شد، نتایج حاصل نشان داد که با گذشت 60 روز، افزایش معنی‌داری در ضخامت بافت روده مشاهده و به ثبت رسید(12). نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که پروبیوتیک تجاری حاوی B. subtilis در بهبود شاخص‌های رشد، تعداد گویچه‌های قرمز، درصد نوتروفیل و طول برآمدگی روده نقش مثبت و تأثیرگذاری را داشت. هر چند که در سایر شاخص‌ها، عدم اختلاف معنی‌دار بین تیمارها مشاهده شد. به‌هرحال، مطالعات تکمیلی در خصوص سنجش عوامل درگیر در سیستم ایمنی و همچنینارزش غذایی آبزیان پس از استفاده از این نوع پروبیوتیک بایستی مورد توجه قرار گیرد.

مراجع

1-خالقی،م.، سلطانی،م.، حسینی شکرابی،س.پ. 1397 اثر افزودن مخلوط پروبیوتیکBucillus subtilisوBacillus licheniformic (دی پرو آکوا) به جیره غذایی بر برخی شاخص های رشد، خونی و ایمنی ماهی کپور معمولی

 

(Cyprinus carpio).مجله علمی- پژوهشی زیست شناسی دریا. سال دهم. شماره سی هفت. ص 11–20.

2.Cerezuela, R., Fumanal, M., Tapia-Paniagua, S.T., Meseguer, J., Moriñigo, M., Esteban, M. (2013). Changes in intestinal morphology and microbiota caused by dietary administration of inulin and Bacillus subtilis in gilthead sea bream (Sparus aurata L.) specimens. Fish Shellfish Immunol, 34; 1063–1070.

3.El-Haroun, E.R., Goda, A.M., Kabir, A.S., Chowdhury, M.A. (2006). Effect of dietary probiotic Biogen® supplementation as a growth promoter on growth performance and feed utilization of Nile tilapia Oreochromis niloticus (L.). Aquac. Res, 37; 1473–1480.

4.Fernandes, T., Silva, A., Petrillo, T.R., Yunis-Aguinaga, J., Fernandes Marcusso, P., Da,G., Claudiano, S. (2015). Effects of the probiotic Bacillus amyloliquefaciens on growth performance, hematology and intestinal morphometry in cage-reared Nile tilapia. Lat. Am. J. Aquat. Res, 43; 963–971.

5.Firouzbakhsh, F., Noori, F. Khalesi, M.K. (2011). Effects of a probiotic, protexin, on the growth performance and hematological parameters in the Oscar (Astronotus ocellatus) fingerlings. Fish Physiol. Biochem, 37; 833–842.

6.Gopalakannan, A. Arul, V. (2011). Inhibitory activity of probiotic Enterococcus faecium MC13 against Aeromonas hydrophila confers protection against hemorrhagic septicemia in common carp (Cyprinus carpio). Aquac. Int, 19; 973–985.

7.Hussein, M.S., Zaghlol, A., El Hakim, N.F.A., El Nawsany, M., Abo-State, H.A. (2016). Effect of different growth promoters on growth performance, feed utilization and body composition of common carp (Cyprinus carpio). J. Fish. Aquat. Sci, 11; 370–377.

8.Kong, W., Huang, C., Tang, Y., Zhang, Di., Wu, Z. Chen, X. (2017). Effect of Bacillus subtilis on Aeromonas hydrophila-induced intestinal mucosal barrier function damage and inflammation in grass carp(Ctenopharyngodon idella). Sci. Rep, 7; 1–11.
9.Liu, K.F., Chiu, C.H., Shiu, Y.L., Cheng, W., Liu, C.H. (2010). Effects of the probiotic, Bacillus subtilis E20, on the survival, development, stress tolerance, and immune status of white shrimp, Litopenaeus vannamei larvae. Fish Shellfish Immunol, 28; 837–844.

10.Merrifield, D.L., Dimitroglou, A., Foey, A., Davies, S.J., Baker, R.T.M., Bøgwald, J. (2010). The current status and future focus of probiotic and prebiotic applications for salmonids. Aquaculture, 302; 1–18.

11.Naseri, S., Khara, H., Shakoori, M. (2013). Effects of probiotics and Fe ion on the growth and survival and body composition of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792) frys. J. Appl. Anim. Res, 41; 318–325.
12.Nakandakare, I.B., Iwashita, M.K.P., Dias, D.D.C., Tachibana, L., Ranzani-Paiva, M.J.T., Romagosa, E. (2013). Growth performance and intestinal histomorphology of Nile tilapia juveniles fed probiotics. Acta SciAnim. Sci, 35; 365–370.

13.Newaj-Fyzul, A., Al-Harbi, A.H. Austin, B. (2014). Review: Developments in the use of probiotics for disease control in aquaculture. Aquaculture, 431; 1–11.
14.Pirarat, N., Pinpimai, K., Endo, M., Katagiri, T., Ponpornpisit, A., Chansue, N. (2011). Research in veterinary science modulation of intestinal morphology and immunity in nile tilapia(Oreochromis niloticus ) by Lactobacillus rhamnosus GG. Res. Vet. Sci, 91; 92–97.
15.Pourmozaffar, S., Hajimoradloo, A. Miandare, H.K. (2017). Dietary effect of apple cider vinegar and propionic acid on immune related transcriptional responses and growth performance in white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol, 60; 65–71.

16.Pourmozaffar, S., Hajimoradloo, A., Paknejad, H., Rameshi, H. (2019). Effect of dietary supplementation with apple cider vinegar and propionic acid on hemolymph chemistry, intestinal microbiota and histological structure of hepatopancreas in white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shell fish Immunol, 86; 900–905.

17.Pourmozaffar, S., Tamadoni Jahromi, S., Rameshi, H., Gozari, M. (2019). Evaluation of some haemolymph biochemical properties and F ‐ cell prevalence in hepatopancreas of white leg shrimp(Litopenaeus vanammei) after fed diets containing apple cider vinegar and

propionic acid. Aquac. Res, 00; 1–9.

18.Ramos, M.A., Batista, S., Pires, M.A., Silva, A.P., Pereira, L.F., Saavedra,M.J. (2017). Dietary probiotic supplementation improves growth and the intestinal morphology of Nile tilapia. Animal, 11; 1259–1269.

19.Ranjit Kumar, N., Raman, R.P., Jadhao, S.B., Brahmchari, R.K., Kumar, K. Dash,G. (2013). Effect of dietary supplementation of Bacillus licheniformis on gut microbiota, growth and immune response in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii(de Man, 1879).

 

Aquac. Int, 21; 387–403.
20.Reda, R.M., Selim, K.M. (2014). Evaluation of Bacillus amyloliquefaciens on the growth performance, intestinal morphology, hematology and body composition of Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Aquac. Int, 23; 203–217.

21.Sargazi, H., Jafarian, H., Yelghi, S. Farhangi, M. (2014). Stress resistance, survival and growth performance of rainbow trout Fry (Oncorhynchus mykiss) supplemented with a commercial basillus probiotic. Fish. Sci. Technol, 3; 1-12. In Persian.

22.Sel, İ., Hisar, O., Yilma, S. Yigit, M. (2016). Effects of different probiotic bacteria on growth, body composition, immune response and hematological parameters of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) under sublethal water temperature. Mar. Sci. Technol. Bull, 4; 21–28.

23.Sun, Y.Z., Yang, H.L., Ma, R.L. Lin, W.Y. (2010). Probiotic applications of two dominant gut Bacillus strains with antagonistic activity improved the growth performance and immune responses of grouper Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunol, 29; 803–809.
24.Tang, L., Huang, K., Xie, J., Yu, D., Sun, L., Huang, Q. (2017). 1-Deoxynojirimycin from Bacillus subtilis improves antioxidant and antibacterial activities of juvenile Yoshitomi tilapia. Electron. J. Biotechnol, 30; 39–47.

25.Thrall, M.A., Weiser, G., Allison, R. Campbell, T. (2012). Veterinary hematology and clnical chemistry 2nd ed. Ames, Iowa : Wiley-Blackwel.

26.Tseng, D.Y., Ho, P.L., Huang, S.Y., Cheng, S.C., Shiu, Y.L., Chiu,C.S. (2009). Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20. Fish Shellfish Immunol, 26; 339–344.
27.Waché, Y., Auffray, F., Gatesoupe, F.J., Zambonino, J., Gayet, V., Labbé,L. (2006). Cross effects of the strain of dietary Saccharomyces cerevisiae and rearing conditions on the onset of intestinal microbiota and digestive enzymes in rainbow trout, Onchorhynchus mykiss, fry. Aquaculture, 258; 470–478.
28.Yanbo, W., Zirong, X. (2006). Effect of probiotics for common carp (Cyprinus carpio) based on growth performance and digestive enzyme activities. Anim. Feed Sci. Technol, 127; 283–292.
29.Yu, M.C., Li, Z.J., Lin, H.Z., Wen, G.L. Ma, S. (2008). Effects of dietary Bacillus and medicinal herbs on the growth, digestive enzyme activity, and serum biochemical parameters of the shrimp Litopenaeus vannamei. Aquac. Int, 16; 471–480.

30.Zhang,Y., Shi,C., Wang,C., Lu,Z., Wang,F., Feng,J. (2018). Effect of soybean meal fermented with bacillus subtilis BS12 on growth performance and small intestinal immune status of piglets. Food Agric. Immunol., 29; 133–146.

30.Ziaei-Nejad, S., Rezaei, M.H., Takami, G.A., Lovett, D.L., Mirvaghefi, A.R. Shakouri, M. (2006). The effect of Bacillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus. Aquaculture, 252; 516–524.
31.Zokaeifar, H., Balcázar, J.L., Saad, C.R., Kamarudin, M.S., Sijam, K., Arshad, A. (2012). Effects of Bacillus subtilis on the growth performance, digestive enzymes, immune gene expression and disease resistance of white shrimp, Litopenaeus vannamei. Fish Shellfish Immunol, 33; 683–689.