ارزیابی فیتوشیمیایی سمیت سلولی، آنتی‌اکسیدانی و ضدباکتریایی اسانس گیاه دارویی Melissa officinalis L. در منطقه مریوان

اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی

مقاله 2، دوره 8، شماره 1 - شماره پیاپی 29، خرداد 1399، صفحه 16-29   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

مرتضی یزدانی¹؛ فرشته جوکار کاشی^{* 2}؛ زینب طلوعی²؛ اکرم رحیمی مقدم²

¹گروه فیتوشیمی، دانشکده شیمی، دانشگاه کاشان، کاشان، ایران

²گروه بیوتکنولوژی، دانشکده شیمی، دانشگاه کاشان، کاشان، ایران

چکیده

با توجه به اثرات نامطلوب آنتی‌بیوتیک‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها و داروهای ضدسرطان مصنوعی بر سلامتی انسان و افزایش مقاومت پاتوژن‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها، لازم است منابع ایمن و جایگزین برای این ترکیب‌ها شناسایی شوند. بدین‌منظور برای اولین بار گیاه بادرنجبویه از شهرستان مریوان واقع در استان کردستان جمع‌آوری شد و فعالیت زیستی گیاه بررسی گردید. اندام‌های هوایی گیاه خودرو بادرنجبویه در مرحله گلدهی در تابستان سال 1395 ازمریوان در ارتفاع ۱۳۲۰ متری از سطح دریای آزاد برداشت و اسانس آن‌ها با امواج میکرویو و بدون استفاده از حلال استخراج شد. ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس‌ با دستگاه کروماتوگرافی گازی-طیف‌سنج جرمی شناسایی شدند. فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس با روش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن، سمیت سلولی آن‌ با آزمون کشندگی میگوی آب شور و فعالیت ضدمیکروبی آن ‌علیه انواعی از سویه‌های میکروبی استاندارد و بالینی با روش انتشار در آگار و تعیین کمترین غلظت مهارکننده رشد بررسی گردید. بازده استخراج اسانس بادرنجبویه 18/1 درصد و اجزای اصلی آن ژرانیول (39/30 درصد) و ژرانیال (19/26 درصد) بودند. بر اساس نتایج آزمون بی‌رنگ شدن بتاکاروتن، مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید توسط اسانس بادرنجبویه و استاندارد بوتیل‌هیدروکسی‌تولوئن به‌ترتیب 48/72 و 48/96 درصد و براساس نتایج آزمون کشندگی میگوی آب شور، مقدار LC₅₀ اسانس بادرنجبویه و داروی ضدسرطان وین‌کریستین‌سولفات به‌ترتیب 76/62 و 751/0 میکروگرم بر میلی­لیتر به‌دست آمد. اسانس‌ بادرنجبویه فعالیت ضدمیکروبی خوبی علیه سویه‌های میکروبی بررسی شده به‌ویژه باکتری‌های گرم مثبت داشت. اسانس‌ بادرنجبویه دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضدسرطانی خوبی است و می‌توان آن‌ را به‌عنوان جایگزینی برای آنتی‌اکسیدان‌ها، آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد ضد سرطان مصنوعی معرفی نمود.

کلیدواژه‌ها

آنتی‌اکسیدان؛ اسانس؛ بادرنجبویه؛ سمیت سلولی؛ فعالیت ضدمیکروبی

اصل مقاله

 

 

فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، شماره پیاپی 29، سال هشتم، شماره 1، بهار 1399

 

ارزیابی فیتوشیمیایی سمیت سلولی، آنتی‌اکسیدانی و ضدباکتریایی اسانس

گیاه دارویی Melissa officinalis L.در منطقه مریوان

 

مرتضی یزدانی¹، فرشته جوکار کاشی^2*، زینب طلوعی²، اکرم رحیمی‌مقدم³

¹کارشناس‌ارشد، گروه فیتوشیمی، دانشکده شیمی، دانشگاه کاشان، کاشان، ایران

²استادیار، گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده شیمی، دانشگاه کاشان، کاشان، ایران

³کارشناس‌ارشد، گروه زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده شیمی، دانشگاه کاشان، کاشان، ایران

 

تاریخ دریافت: 26/9/97      تاریخ پذیرش: 13/3/98

 

چکیده

با توجه به اثرات نامطلوب آنتی‌بیوتیک‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها و داروهای ضدسرطان مصنوعی بر سلامتی انسان و افزایش مقاومت پاتوژن‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها، لازم است منابع ایمن و جایگزین برای این ترکیب‌ها شناسایی شوند. بدین‌منظور برای اولین بار گیاه بادرنجبویه از شهرستان مریوان واقع در استان کردستان جمع‌آوری شد و فعالیت زیستی گیاه بررسی گردید. اندام‌های هوایی گیاه خودرو بادرنجبویه در مرحله گلدهی در تابستان سال 1395 ازمریوان در ارتفاع ۱۳۲۰ متری از سطح دریای آزاد برداشت و اسانس آن‌ها با امواج میکرویو و بدون استفاده از حلال استخراج شد. ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس‌ با دستگاه کروماتوگرافی گازی-طیف‌سنج جرمی شناسایی شدند. فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس با روش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن، سمیت سلولی آن‌ با آزمون کشندگی میگوی آب شور و فعالیت ضدمیکروبی آن ‌علیه انواعی از سویه‌های میکروبی استاندارد و بالینی با روش انتشار در آگار و تعیین کمترین غلظت مهارکننده رشد بررسی گردید. بازده استخراج اسانس بادرنجبویه 18/1 درصد و اجزای اصلی آن ژرانیول (39/30 درصد) و ژرانیال (19/26 درصد) بودند. بر اساس نتایج آزمون بی‌رنگ شدن بتاکاروتن، مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید توسط اسانس بادرنجبویه و استاندارد بوتیل‌هیدروکسی‌تولوئن به‌ترتیب 48/72 و 48/96 درصد و براساس نتایج آزمون کشندگی میگوی آب شور، مقدار LC₅₀ اسانس بادرنجبویه و داروی ضدسرطان وین‌کریستین‌سولفات به‌ترتیب 76/62 و 751/0 میکروگرم بر میلی­لیتر به‌دست آمد. اسانس‌ بادرنجبویه فعالیت ضدمیکروبی خوبی علیه سویه‌های میکروبی بررسی شده به‌ویژه باکتری‌های گرم مثبت داشت. اسانس‌ بادرنجبویه دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضدسرطانی خوبی است و می‌توان آن‌ را به‌عنوان جایگزینی برای آنتی‌اکسیدان‌ها، آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد ضد سرطان مصنوعی معرفی نمود.

 

واژه‌های کلیدی:آنتی‌اکسیدان،اسانس، بادرنجبویه، سمیت سلولی، فعالیت ضدمیکروبی[1]

 

 

مقدمه

تاریخچه استفاده از اسانس گیاهان به هزاران سال پیش بازمی‌گردد. انسان‌ها در زمان‌های قدیم، گیاهان معطرحاوی اسانس را به دلیل بوی مطبوع و خواص شفابخشی که داشتند، برای درمان بیماری‌ها و همچنین در مراسم مذهبی استفاده می‌کردند (Baser and Buchbauer, 2016). امروزه نیز با توجه به عوارض جانبی و اثرات نامطلوب داروهای شیمیایی مصنوعی بر سلامتی انسان، بسیاری از مردم از گیاهان دارویی جهت درمان بیماری‌های خود استفاده می‌کنند. سازمان بهداشت جهانی تخمین زده که بیش از %80 از مردم در کشورهای در حال توسعه از طب سنتی شامل داروهای گیاهی برای نیازهای روزانه خود استفاده می‌کنند و حدود 855 داروی سنتی از عصاره‌های خام گیاهی تشکیل شده است (Miraj et al., 2017). اسانس‌ها ترکیبات شیمیایی طبیعی متنوعی دارند و می‌توانند نیازهای اولیه و مواد لازم برای درمان بیماری‌های انسان را فراهم کنند.

در میان تمام خانواده‌های گیاهی، نعناعیان دارای بیشترین گونه‌های گیاهان دارویی می‌باشند. بادرنجبویه با نام علمیMelissa officinalis L. و نام لاتین  Lemon balamیکی از مهم‌ترین گیاهان معطر و دارویی متعلق به خانواده نعناعیان می‌باشد که عمدتا در فلور طبیعی ترکیه -مخصوصا در نواحی مدیترانه‌ای- رشد می‌کند و بومی اروپای جنوبی، آفریقای شمالی و مشرق زمین تا قفقاز و شمال ایران است (Bagdat, 2006). این گیاه در مناطقی از ایران از جمله استان‌های تهران، گلستان، آذربایجان، لرستان و کرمانشاه نیز بطورگسترده رشد می‌کند (Ebrahimi Hariry, 2011; Emamghoreishi and  Talebianpour, 2009).

کمیت و کیفیت مواد مؤثره اسانس‌ها به منطقه جغرافیایی، میزان رطوبت، نور، دمای محیط، ارتفاع از سطح دریا، میزان بارندگی، ترکیب خاک، سن گیاه و روش استخراج بستگی دارد و عامل اصلی ایجاد تفاوت در خواص دارویی آن‌ها است. مطالعات قبلی به بررسی ترکیب‌های  شیمیایی و فعالیت زیستی اسانس بادرنجبویه ارومیه، وجودینا، مشهد، الجزایر، مراکش و قم پرداخته‌اند و گزارش نموده‌اند که اسانس بادرنجبویه دارای خواص آنتی‌کسیدانی، ضدسرطانی و ضدمیکروبی است (Ehsani etal., 2017; Mimica-Dukic et al., 2004; De Sousa et al., 2004; Jafari and Mohamadi Sani, 2016; Abdellatifet al., 2014; Jalal et al., 2015; Arzhang et al., 2015). همچنین ضدنفخ و ضداسپاسم و دارای خواص آرام‌بخشی، ضدالتهابی و ضدویروسی است (Yosofi et al., 2011) و در درمان سردرد، سوءهاضمه، قولنج، عصبانیت، بیماری‌های قلبی و افسردگی استفاده می‌شود (Beloued, 2009).

در این مطالعه به منظور یافتن جایگزین طبیعی مناسب برای آنتی‌بیوتیک‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها و مواد ضد سرطان مصنوعی، برای اولین بار گیاه بادرنجبویه از منطقه مریوان واقع در استان کردستان شناسایی و ترکیب شیمیایی و فعالیت زیستی اسانس بخش‌های هوایی آن بررسی گردید.

 

مواد و روش‌ها

تهیه گیاه: اندام­های هوایی گیاه بادرنجبویه در مرحله گلدهی درتابستان سال 1395 ازجنوب شهر مریوان (استان کردستان) برداشت شد. مریوان در منطقه کوهستانی و در ارتفاع ۱۳۲۰ متری از سطح دریای آزاد قرار دارد و دارای آب و هوای معتدل می‌باشد و بادرنجبویه به صورت خودرو در آن‌جا می‌روید. نمونه‌ها توسط اساتید گیاه‌شناسی دانشگاه کاشان بررسی و تأیید و به مدت 6 روز در دمای اتاق خشک و سپس آسیاب شدند.

استخراج اسانس: اسانس بخش‌های هوایی گیاه بادرنجبویه با امواج میکرویو و بدون استفاده از حلال استخراج شد. ابتدا 100 گرم از گیاه در آب خیسانده و پس از یک ساعت آب‌کشی شده و در یک راکتور میکرویو (MicroSYNTH، Milestone، ایالات متحده امریکا) در معرض امواج میکرویو قرار گرفت. استخراج اسانس به مدت 45 دقیقه با قدرت 850 وات در دمای 85 درجه­ی سانتی‌گراد انجام شد. اسانس استخراج شده روی سدیم سولفات بدون آب (مرک، آلمان) خشک و در دمای 4 درجه سانتی‌گراد ذخیره گردید.

شناسایی ترکیب‌های تشکیل‌دهنده اسانس: شناسایی ترکیب‌های تشکیل‌دهنده اسانس با دستگاه کروماتوگرافی گازی (GC)^[2] مدل Agilent HP-6890 مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله‌ای (FID)^[3] و یک دستگاه کروماتوگرفی گازی-طیف‌سنج جرمی (GC/MS)[4] از نوع Hewlett-Packard 6890-5972 با سیستم مجهز به ستون مویینه (به طول 30 متر، قطر 25/0 میلی­متر و ضخامت لایه­ی داخلی 25/0 میکرومتر) انجام شد. افزایش دمای ستون از 60 تا 246 درجه­ی سانتی­گراد و با سرعت 3 درجه سانتی‌گراد در دقیقه بود و در انتها به مدت 10 دقیقه در دمای 250 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. سرعت گاز حامل (هلیم)، 5/1 میلی­لیتر در دقیقه بود. طیف جرمی با انرژی یونیزاسیون 70 الکترون ولت به دست آمد. ضرایب بازداری با استفاده از زمان­های بازداری آلکان­های نرمال که با همان دستگاه و تحت همان شرایط تزریق شده بودند، محاسبه شدند. اجزای سازنده اسانس‌ با مقایسه‌ی طیف‌های جرمی و ضرایب بازداری آن‌ها با طیف‌های جرمی و ضرایب بازداری نمونه‌های استاندارد، شاخص‌های موجود در منابع معتبر (Adams, 2007) و بانک اطلاعاتی موجود در دستگاه GC/MS شناسایی شدند. مقادیر نسبی اجزای سازنده اسانس توسط نرم­افزار دستگاه و با توجه به سطح زیر منحنی آن‌ها در کروماتوگرام حاصل از GC/MS محاسبه شد.

بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی: فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس‌ با روش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن ارزیابی شد (Miller, 1971). ابتدا در یک فلاسک ته‌گرد 02/0 میلی‌گرم از بتاکاروتن (سیگما آلدریچ، ایالات متحده امریکا) در 1 میلی‌لیتر کلروفرم (مرک، آلمان) حل و سپس 20 میلی­گرم لینولئیک اسید (سیگما آلدریچ، ایالات متحده امریکا) و 200 میلی‌گرم توئین 40 (مرک، آلمان) به آن اضافه گردید. کلروفرم با روش تبخیر در خلأ و با استفاده از گاز نیتروژن خارج و 50 میلی­لیتر آب مقطر اشباع از اکسیژن به فلاسک افزوده شد. 5 میلی‌لیتر از امولسیون تهیه شده به لوله آزمایش حاوی 2/0 میلی‌لیتر از اسانس یا استاندارد بوتیل هیدروکسی تولوئن (BHT) (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا)، منتقل و جذب آن در زمان صفر و پس از 30 دقیقه گرماگذاری نمونه‌ها در حمام آب گرم با دمای 50 درجه سانتی‌گراد، در طول موج 470 نانومتر و با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (UV CINTRA6- GBC Scientific Equipment، ایالات متحده آمریکا) خوانده شد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی نمونه‌ها­ به صورت درصد بازدارندگی بی‌رنگ شدن بتاکاروتن با لینولئیک اسید بیان و با فرمول زیر محاسبه شد.

 

I% درصد بازدارندگی، A_sample جذب نمونه بعد از زمان مورد نظر، A_control جذب کنترل بعد از زمان موردنظر و A_control(0) جذب کنترل در زمان صفر است.

بررسی سمیت سلولی[5]: سمیت سلولی اسانس‌ با آزمون کشندگی میگوی آب شور (BST)^[6] بررسی شد. به‌منظور تهیه آب شور مناسب برای تبدیل تخم آرتمیا به لارو و ادامه­ زندگی آنها،23 گرم پودرNaCl (مرک، آلمان)، 11 گرم پودر MgCl₂ (مرک، آلمان)، 4 گرم SO₂Na₄ (مرک، آلمان)، 3/1 گرم CaCl₂ (مرک، آلمان) و 7/0 گرم KCl (مرک، آلمان) در آب مقطر حل و pH آن (pH=9) تنظیم شد. آب شور به مدت چند دقیقه جوشانده شد تا استریل شود. برای تولید لارو، 300 میلی­لیتر از آب شور و 05/0 گرم از تخم آرتمیا به ظرف مناسبی اضافه و در دمای 30 درجه سانتی­گراد و هوادهی مناسب به مدت 48 ساعت نگهداری شد. مقدار 05/0 گرم از اسانس با استفاده از 125 میکرولیتر دی‌متیل‌سولفوکسید (مرک، آلمان) در یک بالن ژوژه 25 میلی­لیتری حل و با آب شور به حجم رسانده و محلول‌های با غلظت 10، 100، 300، 500، 700 و 1000 میکروگرم بر میلی‌لیتر از آن تهیه شد. جهت تهیه کنترل منفی50 میکرولیتر دی‌متیل‌سولفوکسید به بالن ژوژه 5 میلی‌لیتری اضافه و با آب شور به حجم رسانده شد. نمونه شاهد داروی ضدسرطانی وین­کریستین‌سولفات (GedeonRichter، مجارستان) با غلظت­های 15/0، 25/0، 35/0، 45/0، 75/0 و 1 میکروگرم بر میلی‌لیتربود. به هر یک از لوله‌های آزمایش حاوی محلول‌های شاهد، کنترل منفی و اسانس، با پیپت پاستور 10 لارو آرتمیا اضافه و لوله‌های آزمایش به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و نور مناسب نگهداری شدند. سپس تعداد لاروهای زنده موجود در لوله‌های آزمایش شمارش و درصد کشندگی با معادله­ی زیر محاسبه شد:

 

با استفاده از نتایج به دست آمده نموداری از نسبت درصد کشندگی به غلظت رسم شد و میزان LC₅₀[7]یعنی غلظتی از نمونه با درصد کشندگی 50، بر اساس میکروگرم بر میلی­لیتر محاسبه گردید. به‌منظور به حداقل رساندن خطاهای آزمایش واطمینان از صحت نتایج، آزمایش‌ها سه مرتبه تکرار شدند.

 

بررسی فعالیت ضدمیکروبی

میکروارگانیسم­ها: در این مطالعه 12 سویه میکروبی استاندارد و 60 سویه بالینی بررسی شدند. سویه‌های میکروبی استاندارد شامل باکتری‌های گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC 29737)، باسیلوس سوبتیلیس (ATCC 6633) و استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس (ATCC 12228)، باکتری‌های گرم منفی شیگلا دیسانتریه (PTCC 1188)، کلبسیلا پنومونیه (ATCC 10031)، سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853)، سالمونلا پاراتیفی سروتیپ A (ATCC 5702)، اشرشیا کلی (ATCC 10536) و پروتئوس ولگاریس (PTCC 1182) وقارچ‌های آسپرژیلوس نایجر (ATCC 16404)، آسپرژیلوس برازیلینسیس (PTCC 5011) و کاندیدا آلبیکنس (ATCC 10231) بودند. سویه­های میکروبی استاندارد که در این پژوهش مورد استفاده قرار گرفته است از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران تهیه شدند. سویه‌های بالینی شامل باکتری‌های گرم مثبت استافیلوکوکوس اپیدرمیدیس، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس، استافیلوکوکوس ساپروفیتیکوس، باکتری‌های گرم منفی پروتئوس ولگاریس، آسینتوباکتر، سالمونلا، اشرشیا کلی، کلبسیلا، سودوموناس سیرینگه و مخمر کاندیدا آلبیکنس بودند. سویه‌های بالینی در تابستان سال 1396 از بیماران مراجعه کننده به آزمایشگاه بیمارستان شهید بهشتی کاشان جدا شدند.

باکتری‌ها در محیط کشت نوترینت آگار (مرک، آلمان) و قارچ‌ها در محیط کشت سابرو دکستروز آگار (مرک، آلمان) کشت داده شدند. پلیت‌های تلقیح شده با باکتری­ها و قارچ‌ها به‌ترتیب در دمای 37 و 30 درجه سانتی­گراد و به مدت یک شب در گرمخانه گرماگذاری شدند.

روش انتشار در آگار (DD)[8]: فعالیت­ ضدمیکروبی اسانس با روش انتشار در آگار مطابق دستور کار موسسه استانداردهای بالینی و آزمایشگاهی (CLSI)^[9] تعیین شد (CLSI, 2012). ابتدا محیط کشت‌های مولر هینتون آگار (مرک، آلمان) برای باکتری­ها و سابرو دکستروز آگار برای قارچ­ها تهیه شد. اسانس نیز در دی‌متیل سولفوکسید حل و با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرومتر استریل شد. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون‌های میکروبی با کدورت معادل نیم‌مک‌فارلند در سطح محیط کشت‌ها، کشت داده شد. چاهک‌هایی به قطر 6 میلی­متر و به ضخامت4 میلی­متر در محیط کشت‌ها ایجاد و به هر یک از آن‌ها 10 میکرولیتر اسانس با غلظت نهایی 30 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر اضافه گردید. پلیت ها به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد و سپس پلیت‌های تلقیح شده با باکتری‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، پلیت‎های‌ تلقیح شده با مخمر به مدت 48 ساعت و پلیت‌های تلقیح شده با سایر قارچ‌ها به مدت 72 ساعت در گرمخانه با دمای 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. آنتی‌بیوتیک‌های ریفامپین و جنتامایسین (برای باکتری‌ها) (پادتن طب، ایران) و نیستاتین (برای قارچ‌ها) (پادتن طب، ایران) به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. سپس قطر هاله مهار رشد توسط خط‌کش اندازه‌گیری شد. جهت اطمینان از صحت نتایج، آزمایش‌ها سه بار تکرار و میانگین داده‌های به دست آمده به عنوان قطر هاله مهار رشد گزارش شد.

تعیینکم­ترین غلظت مهارکننده رشد (MIC)^[10] با روش رقت‌سازی در محیط کشت مایع[11]: به منظور تعیین MIC سویه‌های باکتریایی و مخمر کاندیدا آلبیکنس از پلیت­ 96 خانه­ای استریل و روش رقت‌سازی در محیط کشت مایع طبق دستور کار CLSI استفاده گردید (CLSI, 2012). به هر یک از خانه‌های پلیت 96 خانه‌ای 200 میکرولیتر محلول شامل 95 میکرولیتر محیط کشت مایع برین هارت اینفیوژن (مرک، آلمان) برای باکتری‌ها و سابرو دکستروز براث (مرک، آلمان) برای مخمر کاندیدا آلبیکنس، 100 میکرولیتر از یکی از غلظت­های
اسانس (03125/0، 0625/0، 125/0، 25/0، 5/0، 1 و 2 میلی‌گرم بر میلی­لیتر) و 5 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی با رقت معادل نیم‌مک‌فارلند افزوده شد. در چاهک‌های مربوط به کنترل منفی به جای اسانس از محیط کشت و در چاهک‌های مربوط به کنترل مثبت به جای اسانس از آنتی‌بیوتیک استفاده شد.پودر آنتی‌بیوتیک‌های ریفامپین و جنتامایسین (سیگما، ایالات متحده امریکا) جهت تهیه کنترل مثبت برای باکتری‌ها و پودر آنتی‌بیوتیک‌ نیستاتین (سیگما، ایالات متحده امریکا) جهت تهیه کنترل مثبت برای مخمر کاندیدا آلبیکنس استفاده شدند. پلیت­های تلقیح شده با باکتری‌ها در دمای 37 درجه سانتی­گراد و به مدت 24 ساعت و پلیت‌های تلقیح شده با مخمر کاندیدا آلبیکنس در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و به مدت 48 ساعت در گرمخانه گرماگذاری شدند. آزمایش‌ها سه بار تکرار شدند و میانگین کمترین غلظت از اسانس که مانع رشد باکتری‌ها یا مخمر کاندیدا آلبیکنس شده بود به‌عنوان MIC گزارش شد.

تعیین MIC با روش رقت‌سازی در آگار: جهت تعیین MIC سویه‌های قارچی از روش رقت‌سازی در آگار طبق دستور کار گول و همکاران استفاده گردید (Gul et al., 2002). با افزودن مقادیر مناسبی از اسانس‌ با غلظت‌های 03125/0، 0625/0، 125/0، 25/0، 5/0، 1 و 2 میلی­گرم بر میلی­لیتر به محیط کشت سابرو دکستروز آگار مذاب استریل حاوی توئین 20 (%5/0 حجمی/حجمی) (مرک، آلمان) ،‌ ایجاد شد. پودر آنتی‌بیوتیک‌ نیستاتین جهت تهیه کنترل مثبت استفاده گردید و کنترل منفی پلیت حاوی محیط کشت سابرو دکستروز آگار و توئین 20 (%5/0 حجمی/حجمی) و فاقد اسانس بود. محیط کشت‌ها به صورت نقطه‌ای با 5 میکرولیتر از جدایه‌های قارچی (10⁴ اسپور بر میلی‌لیتر) تلقیح شدند. پلیت‌های تلقیح شده به مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. آزمایش‌ها سه بار تکرار شدند و میانگین کمترین غلظت از اسانس که مانع رشد قارچ‌ها شده بود به عنوان MIC گزارش شد.

 

نتایج

بازده و ترکیبات شیمیایی اسانس: بازده استخراج اسانس بادرنجبویه با امواج میکرویو و بدون استفاده از حلال %18/1 بود. شکل 1 کروماتوگرام اسانس گیاه بادرنجبویه به‌دست آمده از دستگاه GC-MS را نشان می­دهد. ترکیب و درصد اجزای فرار موجود در اسانس بادرنجبویه در جدول 1 آمده است. در اسانس بادرنجبویه 12 ترکیب شناسایی شد. ژرانیول (%39/30)، ژرانیال (%19/26)، سیترال (%07/15) و نرال (%32/13) اجزای اصلی و تشکیل‌دهنده %97/84 از ترکیب‌های اسانس بادرنجبویه بودند.

 

 

جدول 1: ترکیب و درصد اجزای فرار در اسانس بخش‌های هوایی بادرنجبویه

ردیف	نام ترکیب	زمان بازداری به دقیقه	شاخص بازداری	درصد ترکیب
1	β-myrcene	53/8	990	70/0
2	dl-Limonene	88/9	1029	69/0
3	linalool	72/12	1096	77/1
4	unknown	06/16	-	79/0
5	Geranial	84/18	1252	19/26
6	Z-Citral (Neral)	08/19	1238	32/13
7	Camphene	44/19	954	16/1
8	Geraniol	20/20	1252	39/30
9	Citral (Granial)	46/20	1267	07/15
10	Methyl nerolate	17/22	1282	74/0
11	Geranyl acetate	63/24	1381	90/1
12	unknown	51/25	-	42/1
13	trans-Caryophyllene	02/26	1419	90/0
14	Caryophyllene oxide	58/32	1583	47/0
15	Unknown	08/49	-	48/4
16	Total			99/99

 

شکل 1: کروماتوگرام اسانس گیاه بادرنجبویه به‌دست‌آمده از دستگاه GC-MS

 

میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی: روش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن بر اساس بی‌رنگ شدن رقابتی بتاکاروتن طی آنتی‌اکسیداسیون لینولئیک اسید در امولسیون آبی است و با کاهش جذب در ناحیه مرئی بررسی می‌شود (Miller, 1971).در غیاب ترکیب‌های آنتی‌اکسیدان، لینولئیک اسید اکسید و رادیکال‌های آزاد پروکسیل تولید شده، بتاکاروتن اشباع نشده را اکسید می‌کنند و بتاکاروتن تا حدودی تجزیه شده و رنگ نارنجی خود را از دست می‌هد (Kumaran and Joel Karunakaran, 2006 ). حضور آنتی‌اکسیدان‌ها، اکسیداسیون بتاکاروتن با هیدروپراکسیدها را کاهش می‌دهد و هیدروپراکسیدهای تشکیل شده توسط ترکیبات آنتی‌اکسیدان خنثی می‌شوند. بنابراین میزان بی‌رنگ شدن بتاکاروتن به فعالیت آنتی‌اکسیدانی ترکیب بررسی شده بستگی دارد (Ismail et al., 2010).

بر اساس نتایج آزمون بی‌رنگ شدن بتاکاروتن، درصد بازدارندگی اسانس بادرنجبویه و استاندارد BHT به‌ترتیب 48/72 و  48/96 درصد به‌دست آمد که نشان می‎دهد اسانس بادرنجبویه فعالیت آنتی‌اکسیدانی خوبی دارد.

میزان سمیت سلولی: یکی از آزمون­های معتبر جهت تعیین سمیت سلولی مواد، آزمون BST می­باشد که توسط مؤسسه ملی سرطان درآمریکا (NCI)^[12] تأیید شده است. اساس این آزمون، توانایی نمونه­ در کشتن آرتمیا می­باشد. بنابراین با محاسبه میزان کشندگی در غلظت­های معین از نمونه­ اسانس و مقایسه آن با استاندارد منفی، می‌توان اثر ضد سرطانی اسانس را پیش­بینی نمود. در این مطالعه مقدار LC₅₀ اسانس بادرنجبویه و داروی ضد سرطان وین کریستین سولفات به ترتیب 76/62 و 751/0میکروگرم بر میلی­لیتر به دست آمد.

میزان فعالیت ضدمیکروبی: نتایج آزمون‌ انتشار در آگار و تعیین کمترین غلظت مهارکننده رشد سویه‌های استاندارد و بالینی میکروبی توسط اسانس بادرنجبویه و آنتی‌بیوتیک‌های ریفامپین، جنتامایسین و نیستاتین در جدول‌های2 و 3 آمده است. بر اساس این نتایج اسانس بادرنجبویه فعالیت ضدمیکروبی خوبی را برعلیه میکروارگانیسم‌های بررسی شده به خصوص برعلیه باکتری‌های گرم مثبت داشت.

 

 

جدول 2: بررسی اثر ضدمیکروبی اسانس‌ بادرنجبویه و آنتی‌بیوتیک‌های ریفامپین، جنتامایسین و نیستاتین برعلیه سویه‌های استاندارد میکروبی

نیستاتین		جنتامایسین		ریفامپین		اسانس بخش‌های هوایی بادرنجبویه		میکروارگانیسم‌ها
کمترین غلظت مهارکننده رشد (میکروگرم بر میلی‌لیتر)	میانگین قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر)	کمترین غلظت مهارکننده رشد (میکروگرم بر میلی‌لیتر)	میانگین قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر)	کمترین غلظت مهارکننده رشد (میکروگرم بر میلی‌لیتر)	میانگین قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر)	کمترین غلظت مهارکننده رشد (میکروگرم بر میلی‌لیتر)	میانگین قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر)	باکتری­های گرم مثبت
*	*	500	35	250	40	25/31	18	Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228)
*	*	500	21	6/15	13	125	12	Bacillus subtilis (ATCC 6633)
*	*	500	21	250	10	125	13	Staphylococcus aureus (ATCC 29737)
								باکتری­های گرم منفی
*	*	500	18	250	8	5/62	13	Shigella dysenteriae (PTCC 1188)
*	*	250	22	250	7	250	12	Klebsiella pneumonia (ATCC 10031)
*	*	500	8	-	-	-	-	Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)
*	*	500	21	-	-	250	12	Salmonella paratyphi-A serotype (ATCC 5702)
*	*	500	21	500	11	250	12	Escherichia coli (ATCC 10536)
*	*	500	23	125	10	-	-	Proteus vulgaris (PTCC 1182)
								قارچ‌ها
25/31	27	*	*	*	*	-	-	Aspergillus niger (ATCC 16404)
25/31	30	*	*	*	*	-	-	Aspergillus brasiliensis (PTCC 5011)
125	33	*	*	*	*	500	10	Candida albicans (ATCC 10231)

(-) به معنای عدم فعالیت ضدمیکروبی است.

(*) به معنای غیرقابل استفاده بودن آنتی‌بیوتیک برای سویه میکروبی است.

 

جدول 3: بررسی اثر ضدمیکروبی اسانس‌ بادرنجبویه برعلیه سویه‌های بالینی میکروبی

میکروارگانیسم		اسانس بادرنجبویه
شماره	نام میکروارگانیسم	میانگین قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر)	کمترین غلظت مهارکننده رشد (میکروگرم بر میلی‌لیتر)
1	Staphylococcus epidermidis	18	25/31
2		19	25/31
3		17	25/31
4		17	25/31
5		17	25/31
6		18	25/31
7	Candida albicans	10	500
8		-	-
9		-	-
10		10	500
11		10	500
12		11	500
13		10	500
14		-	-
15	Proteus vulgaris	-	-
16		-	-
17		-	-
18		-	-
19		-	-
20		-	-
21		-	-
22	Enterococcus faecalis	14	125
23		14	125
24	Acinetobacter baumannii	-	-
25		-	-
26		-	-
27		-	-
28		-	-
29		-	-
30		-	-
31	Staphylococcus saprophyticus	15	5/62
32		15	5/62
33		15	5/62
34		16	5/62
35		15	5/62
36		15	5/62
37		15	5/62
38	Staphylococcus aureus	13	5/62
39		14	5/62
40		14	5/62
41		13	125
42	Salmonella paratyphi	14	125
43		14	125
44	Escherichia coli	11	500
45		11	500
46		12	500
47		11	500
48		11	500
49	Klebsiella pneumonia	13	125
50		13	125
51		14	125
52		13	125
53		13	125
54		13	125
55		13	125
56	Pseudomonas syringae	-	-
57		-	-
58		-	-
59		-	-
60		-	-

(-) به معنای عدم فعالیت ضدمیکروبی است.

 

بحث

مطالعه حاضر اولین گزارش از برداشت بادرنجبویه از مریوان و بررسی ترکیب‌های شیمیایی و فعالیت‌ زیستی اسانس بخش‌های هوایی آن می‌باشد. در این پژوهش بازده استخراج اسانس بادرنجبویه مریوان %18/1 بود که در مقایسه با نتایج مطالعات قبلی مقدار بیشتری داشت. بازده استخراج اسانس بادرنجبویه ارومیه، برزیل، الجزایر، مراکش و قم با دستگاه کلونجر به‌ترتیب %1، %97/0، %34/0، %4/0 و %36/0 و بازده استخراج اسانس بادرنجبویه وجودینا، با روش تقطیر با آب، %2/0 بود (Ehsani et al., 2017; Mimica-Dukic et al., 2004; De Sousa et al., 2004; Abdellatif et al., 2014; Jalal et al., 2015; Arzhang et al., 2015).

ترکیب اصلی تشکیل‌دهنده اسانس بادرنجبویه مریوان، ژرانیول بود. ترکیب اصلی اسانس بادرنجبویه همدان و کوبا نیز ژرانیول با مقادیر %23/44 و %41 گزارش شده است (Adinee et al., 2009; Pino et al., 1999). در مطالعات دیگر ترکیباتی غیر از ژرانیول به عنوان مهم‌ترین ترکیب تشکیل دهنده اسانس بادرنجبویه معرفی شده‌اند. سیترونلال (%33/37)، تیمول (%96/11) و سیترال (%10/10) اجزای اصلی اسانس بادرنجبویه ارومیه را تشکیل دادند (Ehsani et al., 2017). بر اساس تحقیقی که در وجودینا انجام شد، ترکیبات اصلی اسانس بخش‌های هوایی بادرنجبویه، ژرانیال (%4/23)، نرال (%5/16) و سیترونلال (%7/13) بودند (Mimica-Dukic et al., 2004). جعفری و محمدی ثانی (Jafari and Mohamadi Sani, 2016) اجزای اصلی اسانس برگ‌های بادرنجبویه برداشت شده  از مشهد را
D-لیمونن (%70/60) و سیکلوهگزانون (%67/7) گزارش کردند. اجزای اصلی بادرنجبویه برداشت شده از برزیل و الجزایر ژرانیال و نرال بودند ولی مقدار این ترکیبات در دو نمونه با هم تفاوت داشت (De Sousa et al., 2004; Abdellatif et al., 2014). ترکیبات اصلی اسانس برگ‌های بادرنجبویه برداشت شده از مراکش، سیترونلال (%40/14)، بتا-کاریوفیلن اکسید (%00/11) و ژرانیول استات (%20/10) و ترکیبات اصلی اسانس بادرنجبویه برداشت شده از قم به ترتیب کاریوفیلن اکسید (%11/21) و کاریوفیلن (%33/17) بود (Jalal et al., 2015; Arzhang et al., 2015).

تفاوت در بازده، کمیت و کیفیت ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس‌ها به دلیل تفاوت در منطقه جغرافیایی کشت بادرنجبویه، میزان رطوبت، نور، دمای محیط، ارتفاع از سطح دریا، میزان بارندگی، ترکیب خاک، سن گیاه و روش استخراج آن می‌باشد.

درصد مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید توسط اسانس بادرنجبویه مریوان و استاندارد BHT به ترتیب %48/72 و %48/96 به دست آمد. در مطالعه احسانی و همکاران (Ehsani et al., 2017)، درصد مهار اکسیداسیون لینولئیک اسید توسط اسانس بادرنجبویه برداشت شده از ارومیه (غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) و استاندارد BHT (غلظت 10 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به ترتیب %25/51 و %99/99 بود، که نشان می‌دهد فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس بادرنجبویه مریوان بیشتر از فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس بادرنجبویه ارومیه است. گزارش شده است که اسانس بادرنجبویه وجودینا و برزیل هم فعالیت آنتی‌اکسیدانی قابل توجهی دارند (Mimica-Dukic et al., 2004; De Sousa et al., 2004).

اسانس بادرنجبویه مریوان فعالیت ضد سرطانی خوبی داشت. اسانس بادرنجبویه برزیل نیز سمیت سلولی خوبی علیه رده‌های سلول‌های سرطانی انسانی شامل رده‌های سلولی A549، Caco-2، MCF-7، HL-60،K562 ویک رده سلول سرطان موش  B16F10نشان داد (De Sousa et al., 2004).

اسانس بادرنجبویه مریوان فعالیت ضدمیکروبی خوبی را برعلیه میکروارگانیسم‌های بررسی شده، به خصوص باکتری‌های گرم مثبت داشت که با نتایج برخی از مطالعات دیگر نیز همخوانی دارد (Ehsani et al., 2017; Jafari and Mohamadi Sani, 2016). بر اساس گزارش احسانی و همکاران (Ehsani et al., 2017) اسانس بادرنجبویه ارومیه فعالیت ضدمیکروبی خوبی علیه اشرشیا کلی (PTCC 1533) و استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1015) نشان داد. جعفری و محمدی ثانی (Jafari and Mohamadi Sani, 2016) نیز نشان دادند که اسانس بادرنجبویه برداشت شده از مشهد فعالیت ضدمیکروبی خوبی علیه استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1431) و اشرشیا کلی (PTCC 1399) دارد. در یک مطالعه دیگر رشد سویه‌های استاندارد سودوموناس آئروژینوزا (ATCC 27853)، اشرشیاکلی (ATCC35218)، اشرشیا کلی (ATCC25922)، باسیلوس سوبتیلیس (ATCC10707)، استافیلوکوکوس اورئوس (ATCC6583) و سویه‌های بالینی سودوموناس آئروژینوزا، اشرشیا کلی و کاندیدا آلبیکنس به میزان قابل توجهی توسط اسانس بادرنجبویه برداشت شده از وجودینا مهار شد (Mimica-Dukic et al., 2004). عبدالطیف و همکاران نیز فعالیت ضدمیکروبی قابل توجهی را برای اسانس بادرنجبویه برداشت شده از الجزایر علیه باسیلوس سوبتیلیس (ATCC 6633)، استافیلوکوکوس اورئوس (CIP 7625)، سودوموناس آئروژینوزا (CIP A22)، اشرشیا کلی (ATCC 10536)، کلبسیلا پنومونیه (CIP 8291) و کاندیدا آلبیکنس (IPA200) گزارش کردند (Abdellatif et al., 2014). در مطالعه جلال و همکاران (Jalal et al., 2015) نیز سویه‌های بالینی کلبسیلا پنومونیه، سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس توسط اسانس بادرنجبویه برداشت شده از مراکش مهار شدند. کاتیون‌های دوظرفیتی و بخش پلی‌ساکاریدی لیپوپلی‌ساکارید در غشای خارجی باکتری‌های گرم منفی خاصیت آبدوستی به دست می‌آورند که از تماس عناصر آب‌گریز (اسانس) با سلول باکتری جلوگیری نموده و منجر به مقاومت بیشتر باکتری گرم منفی نسبت به اسانس می‌شوند (Akhondzadeh-Basti et al., 2014; Burt, 2004; Hashemi et al., 2013; Shojaii and Abdollahi-Fard, 2012; Moradi et al., 2014). تفاوت در فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضد سرطانی و ضدمیکروبی اسانس بادرنجبویه در مطالعات مختلف به دلیل تفاوت در ترکیبات تشکیل‌دهنده اسانس‌ها و روش‌های اسانس‌گیری می‌باشد. تفاوت درغلظت اسانس و سویه‌های میکروبی بررسی شده نیز می‌تواند سبب ایجاد تفاوت در فعالیت ضدمیکروبی شود. به نظر می‌رسد که فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد سرطانی مشاهده شده در اسانس بادرنجبویه مریوان به دلیل حضور مونوترپن‌های اکسیژنه شامل ژرانیول، ژرانیال، سیترال و نرال به خصوص ژرانیول -جزء اصلی اسانس بادرنجبویه مریوان- باشد. در برخی مطالعات دیگر نیز فعالیت آنتی‌اکسیدانی اسانس بادرنجبویه به حضور ژرانیول، ژرانیال، سیترال و نرال نسبت داده شده است (Mimica-Dukic et al., 2004; Venskutionis et al., 1995). گزارش شده است که ژرانیول، تکثیر سلول‌های سرطانی روده بزرگ انسان را در شرایط آزمایشگاهی (Carnesecchi et al., 2001) و رشد تومورهای پانکراس (Burke et al., 1997)، کبد و پوست (Yu et al., 1995) را در شرایط آزمایشگاهی و در بدن موجود زنده مهار می‌کند. مونوترپن‌های اکسیژنه چربی‌دوست هستند و با ایفای نقش خود در غشای سلولی، سبب تغییر نفوذپذیری غشا و آزاد شدن محتویات سلولی می‌شوند (Moosavy et al., 2008) و به همین دلیل می‌توانند خاصیت ضدمیکروبی و سمیت سلولی بالایی را نشان دهند. در مطالعه عبدالطیف و همکاران (Abdellatif et al., 2014) فعالیت ضدمیکروبی سیترال، سیترونلال و کاریوفیلن اکسید تأیید و فعالیت ضدمیکروبی اسانس بادرنجبویه الجزایر به حضور آن‌ها نسبت داده شد.

 

نتیجه‌گیری نهایی

بر اساس نتایج حاصل از این پژوهش، اسانس‌ بادرنجبویه مریوان دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی، ضدمیکروبی و ضد سرطانی خوبی است و می‌توان آن‌ را به عنوان جایگزینی برای آنتی‌اکسیدان‌ها، آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد ضدسرطان مصنوعی معرفی نمود.

 

سپاسگزاری

بدین‌وسیله از پژوهشکده اسانس دانشگاه کاشان که مواد، وسایل و امکانات لازم جهت انجام این پژوهش را فراهم کردند، کمال تشکر و قدردانی را داریم. لازم به ذکر است که این پژوهش با کد اخلاق 1394708در دانشگاه کاشان به ثبت رسیده است.

 

 

References­

1. Abdellatif, F., Boudjella, H., Zitouni, A. and Hassani, A. 2014. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from leaves of Algerian Melissa officinalis L. EXCLI Journal, 13: 772-781.
2. Adams, R.P. 2007. Identification of essential oil components by gas chromatography/quadruple mass spectroscopy. Allured Publishing Cropration, Carol Stream IL, 804 p.
3. Adinee, J., Piri, K. and Karami, O. 2009. Essential oil composition of lemon balm (Melissa officinalis L.) Leaves grown in Hamadan province, Iran. Medicinal and aromatic plant science and biotechnology, 3: 58-60.
4. Akhondzadeh-Basti, A., Aminzare, M., Razavi-Rohani, S.M., Khanjari, A., Noori, N., Jebelli Javan, A., Taheri Mirghaed, A., Raeisi, M., Naghili, H. and Mohammadkhan, F. 2014.  The combined effect of lysozyme and Zataria Multiflora essential oil on Vibrio parahaemolyticus. Journal of Medicinal Plants, 2: 27-34. [Full Text in Persian]
5. Arzhang, M., Dakhili, M. and Farahani, F. 2015. Investigation of chemical compounds and anti-microbial activity of essential oil of Melissa officinalis L. Qom University of Medical Sciences Journal, 9: 7-13. (In Persian)
6. Bagdat, R.B. 2006. The essential oil of lemon balm (Melissa officinalis L.), its components and using fields. Journal of the Faculty of Agriculture, 21: 116-121.
7. Baser, K.H.C. and Buchbauer, G. 2016. Handbook of Essential Oils: Science, Technology, and Applications. CRC Press, United States, 1128 p.
8. Beloued, A. 2009. Plantes médicinales d’Algérie. Office des Publications Universitaires, Alger, 277 p.
9. Burke, Y.D., Stark, M.J., Roach, S.L., Sen, S.E. and Crowell, P.L. 1997. Inhibition of pancreatic cancer growth by the dietary isoprenoids farnesol and geraniol. Lipids, 32: 151-156.
10. Burt, S. 2004. Essential oils: Their antibacterial properties and potential applications in foods: A review. International Journal of Food Microbiology, 94: 223-253.
11. Carnesecchi, S., Schneider, Y., Ceraline, J., Duranton, B., Gosse, F., Seiler, N., Raul, F. 2001. Geraniol, a component of plant essential oils, inhibits growth and polyamine biosynthesis in human colon cancer cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298: 197-200.
12. CLSI. Clinical and Laboratory Standard Institute. 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing: Approved standard: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 29: 1-76.
13. De Sousa, A.C., Alviano, D.S., Blank, A.F., Alves, P.B., Alviano, C.S. and Gattass, C.R. 2004. Melissa officinalis L. essential oil: antitumoral and antioxidant activities. Journaal of pharmacy and pharmacology, 56: 677-681.
14. Ebrahimi Hariry, R. 2011. Anticonvulsant effects of hydroalcoholic extract of Melissa officinalis on pentylenetetrazole (PTZ) model of convulsion in mice. Journal of medicinal plant research, 5: 3803-3809.
15. Ehsani, A., Alizadeh, O., Hashemi, M., Afshari, A. and Aminzare, M. 2017. Phytochemical, antioxidant and antibacterial properties of Melissa officinalis and Dracocephalum moldavica essential oils. Veterinary Research Forum, 8: 223-229.
16. Emamghoreishi, M. and Talebianpour, M.S. 2009. Antidepressant effect of Melissa officinalis in the forced swimming test. Daru Journal of Faculty of Pharmacy, 17: 42-47.
17. Gul, H.I., Ojanen, T. and Hänninen, O. 2002. Antifungal evaluation of bis Mannich bases derived from acetophenones and their corresponding piperidinols and stability studies. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 25: 1307-1310.
18. Hashemi, M., Ehsani, A., Jazani, N.H., Aliakbarlu, J. and Mahmoudi, R. 2013. Chemical composition and in vitro antibacterial activity of essential oil and methanol extract of Echinophora platyloba DC against some of food-borne pathogenic bacteria. Veterinary Research Forum, 4: 123-127.
19. Ismail, M., Mariod, A., Bagalkotkar, G. and Ling, H.S. 2010. Fatty acid composition and antioxidant activity of oils from two cultivars of Cantaloupe extracted by supercritical fluid extraction. Grasas y Aceites, 61: 37-44.
20. Jafari, N.K. and Mohamadi Sani, A. 2016. Chemical composition and antibacterial activity of essential oil from Melissa officinalis leaves. ARPN Journal of Agricultural and Biological Science, 11: 367-372.
21. Jalal, Z., Atki, Y.E., Lyoussi, B. and Abdellaoui, A. 2015. Phytochemistry of the essential oil of Melissa officinalis L. growing wild in Morocco: Preventive approach against nosocomial infections. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5: 458-461.
22. Kumaran, A. and Joel Karunakaran, R. 2006. Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus. Food Chemistry, 97: 109-114.
23. Miller, H.E. 1971. A simplified method for evaluation of antioxidant. Journal of the American Oil Chemists Society, 48: 91.
24. Mimica-Dukic, N., Bozin, B., Sokovic, M. and Simin, N. 2004. Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L. (Lamiaceae) essential oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 2485-2489.
25. Miraj, S., Rafieian-Kopaei, and Kiani, S. 2017. Melissa officinalis L: A review study with an antioxidant prospective. Journal of Evidence - Based Complementary and Alternative Medicine, 22: 385-394.
26. Moosavy, M.H., Akhondzadeh Basti, A, Misaghi, A., Zahraei Salehi, T., Abbasifar, R., Ebrahimzadeh Mousavi, H.A., Alipour, M., Emami Razavi, N., Gandomi, H. and Noori, N. 2008. Effect of Zataria multiflora Boiss. essential oil and nisin on Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in a food model system and on the bacteria cell membranes. Food Research International, 41: 1050-1057.
27. Moradi, M., Hassani, A., Ehsani, A., Hashemi, M., Raeisi, M. and Naghibi, S.S. 2014. Phytochemical and antibacterial properties of Origanum vulgare ssp. gracile growing wild in Kurdistan province of Iran. Journal of Food Quality and Hazards Control, 1: 120-124.
28. Pino, J.A., Rosado, A. and Fuentes, V. 1999. Composition of the essential oil Melissa officinalis L. From Cuba. Journal of Essential Oil Research, 11: 363-364.
29. Shojaii, A. and Abdollahi-Fard, M. 2012. Review of pharmacological properties and chemical constituents of Pimpinella anisum. International Scholarly Research Network: Pharmaceutics, 2012: 510795.
30. Venskutionis, P.R., Dapkevicius, A. and Baranuauskiene, M. 1995. Flavour composition of some lemon-like aroma herbs from Lithuania. Developments in Food Science, 37: 833-847.
31. Yosofi, M., Hojjati, M.R., Moshtaghi, E., Rahimiyan, R., Dawodiyan-Dehkordi, A. and Rafieian Kopaei, M. 2011. The effect of hydro-alcoholic extract of Melissa officinalis on learning and spatial memory in Balb/c mice. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences, 13: 51-59. [Full Text in Persian]
32. Yu, S.G., Hildebrandt, L.A. and Elson, C.E. 1995. Geraniol, an inhibitor of mevalonate biosynthesis, suppresses the growth of hepatomas and melanomas transplanted to rats and mice. The Journal of Nutrition, 125: 2763-2767.

 

 

 

 

Eco-phytochemical Journal of Medicinal Plants, 8th Year, Volume One, Spring 2020

 

 

 

Evaluation of phytochemical, cytotoxic, antioxidant and antibacterial activity of of Melissa officinalis L. from Marivan region

 

Yazdani, M.¹, Jookar Kashi, F.^2*, Toluei, Z.², Rahimi-Moghaddam, A.³

¹M.Sc., Department of Phytochemistry, Faculty of Chemistry, university of Kashan, Kashan, Iran

²Assistant Professor, Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Chemistry, University of Kashan, Kashan, Iran

³M.Sc., Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Chemistry, University of Kashan, Kashan, Iran

 

Received: 2018-12-17;         Accepted: 2019-6-3

 

Abstract

Considering the adverse effects of synthetic antioxidants, antibiotics, and anti-cancer drugs on human health and increasing the antibiotic resistance of pathogens, it is a necessity to find safe alternative sources for these compounds. For this purpose, Melissa officinalis L. was collected from Marivan, Kurdestan province, and its chemical compositions and bioactivities were determined. Aerial parts of self-sowing M. officinalis were harvested during the flowering stage at 1320 meters above the sea level in 2016 summer. Using solvent-free microwave extraction methodessential oil of M. Officinalis was obtained and their component was identified by gas chromatography/mass spectrometry. The antioxidant and cytotoxicity activity of the essential oil were determined via β–carotene bleaching assay and brine shrimp lethality test, respectively. The antibacterial activity of the essential oil was evaluated by agar well diffusion method and minimum inhibitory concentrationdetermination against various types of standard and clinical microbial strains.Extraction yield of the essential oil was 1.18%, and the main componentswere geraniol (30.39%) and geranial (26.19%).Based on the results of
β–carotene bleaching assay, inhibition of linoleic acid oxidation by the essential oil and BHT were 72.48% and 96.48%, respectively.Using the brine shrimp lethality test, LC₅₀ of theessential oil and vincristine sulfate were obtained 62.76 μg/ml and 0.751 μg/ml, respectively.Thus, this study revealed that essential oil of M. officinalis had good antimicrobial activity against testedmicroorganisms, especially Gram-positive bacteria.In addition, it showed significant antioxidant, antibacterial and anticancer activities, so it seems that essential oil of M. officinalis may have potential use as an alternative to synthetic antioxidants, antibiotics and anticancer drugs.

 

Keywords: Antimicrobial, Antioxidant, Cytotoxicity, Essential oil, Melissa officinalis L.[13]

 

---

*نویسنده مسئول: [e-mail]

[2]. Gas Chromatograph

[3]. Flame Ionization Detector

[4]. Gas Chromatography/Mass Spectrometry

[5]. Cytotoxicity

[6]. Brine shrimp lethality test

[7]. Lethal concentration 50

[8]. Disk Diffusion

[9]. Clinical and Laboratory Standards Institute

[10]. Minimum inhibitory concentration

[11]. Broth microdilution

[12]. National Cancer Institute

*Corresponding author;  [e-mail]

مراجع

1. Abdellatif, F., Boudjella, H., Zitouni, A. and Hassani, A. 2014. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil from leaves of Algerian Melissa officinalis L. EXCLI Journal, 13: 772-781.
2. Adams, R.P. 2007. Identification of essential oil components by gas chromatography/quadruple mass spectroscopy. Allured Publishing Cropration, Carol Stream IL, 804 p.
3. Adinee, J., Piri, K. and Karami, O. 2009. Essential oil composition of lemon balm (Melissa officinalis L.) Leaves grown in Hamadan province, Iran. Medicinal and aromatic plant science and biotechnology, 3: 58-60.
4. Akhondzadeh-Basti, A., Aminzare, M., Razavi-Rohani, S.M., Khanjari, A., Noori, N., Jebelli Javan, A., Taheri Mirghaed, A., Raeisi, M., Naghili, H. and Mohammadkhan, F. 2014.  The combined effect of lysozyme and Zataria Multiflora essential oil on Vibrio parahaemolyticus. Journal of Medicinal Plants, 2: 27-34. [Full Text in Persian]
5. Arzhang, M., Dakhili, M. and Farahani, F. 2015. Investigation of chemical compounds and anti-microbial activity of essential oil of Melissa officinalis L. Qom University of Medical Sciences Journal, 9: 7-13. (In Persian)
6. Bagdat, R.B. 2006. The essential oil of lemon balm (Melissa officinalis L.), its components and using fields. Journal of the Faculty of Agriculture, 21: 116-121.
7. Baser, K.H.C. and Buchbauer, G. 2016. Handbook of Essential Oils: Science, Technology, and Applications. CRC Press, United States, 1128 p.
8. Beloued, A. 2009. Plantes médicinales d’Algérie. Office des Publications Universitaires, Alger, 277 p.
9. Burke, Y.D., Stark, M.J., Roach, S.L., Sen, S.E. and Crowell, P.L. 1997. Inhibition of pancreatic cancer growth by the dietary isoprenoids farnesol and geraniol. Lipids, 32: 151-156.
10. Burt, S. 2004. Essential oils: Their antibacterial properties and potential applications in foods: A review. International Journal of Food Microbiology, 94: 223-253.
11. Carnesecchi, S., Schneider, Y., Ceraline, J., Duranton, B., Gosse, F., Seiler, N., Raul, F. 2001. Geraniol, a component of plant essential oils, inhibits growth and polyamine biosynthesis in human colon cancer cells. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298: 197-200.
12. CLSI. Clinical and Laboratory Standard Institute. 2012. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility testing: Approved standard: National Committee for Clinical Laboratory Standards, 29: 1-76.
13. De Sousa, A.C., Alviano, D.S., Blank, A.F., Alves, P.B., Alviano, C.S. and Gattass, C.R. 2004. Melissa officinalis L. essential oil: antitumoral and antioxidant activities. Journaal of pharmacy and pharmacology, 56: 677-681.
14. Ebrahimi Hariry, R. 2011. Anticonvulsant effects of hydroalcoholic extract of Melissa officinalis on pentylenetetrazole (PTZ) model of convulsion in mice. Journal of medicinal plant research, 5: 3803-3809.
15. Ehsani, A., Alizadeh, O., Hashemi, M., Afshari, A. and Aminzare, M. 2017. Phytochemical, antioxidant and antibacterial properties of Melissa officinalis and Dracocephalum moldavica essential oils. Veterinary Research Forum, 8: 223-229.
16. Emamghoreishi, M. and Talebianpour, M.S. 2009. Antidepressant effect of Melissa officinalis in the forced swimming test. Daru Journal of Faculty of Pharmacy, 17: 42-47.
17. Gul, H.I., Ojanen, T. and Hänninen, O. 2002. Antifungal evaluation of bis Mannich bases derived from acetophenones and their corresponding piperidinols and stability studies. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 25: 1307-1310.
18. Hashemi, M., Ehsani, A., Jazani, N.H., Aliakbarlu, J. and Mahmoudi, R. 2013. Chemical composition and in vitro antibacterial activity of essential oil and methanol extract of Echinophora platyloba DC against some of food-borne pathogenic bacteria. Veterinary Research Forum, 4: 123-127.
19. Ismail, M., Mariod, A., Bagalkotkar, G. and Ling, H.S. 2010. Fatty acid composition and antioxidant activity of oils from two cultivars of Cantaloupe extracted by supercritical fluid extraction. Grasas y Aceites, 61: 37-44.
20. Jafari, N.K. and Mohamadi Sani, A. 2016. Chemical composition and antibacterial activity of essential oil from Melissa officinalis leaves. ARPN Journal of Agricultural and Biological Science, 11: 367-372.
21. Jalal, Z., Atki, Y.E., Lyoussi, B. and Abdellaoui, A. 2015. Phytochemistry of the essential oil of Melissa officinalis L. growing wild in Morocco: Preventive approach against nosocomial infections. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 5: 458-461.
22. Kumaran, A. and Joel Karunakaran, R. 2006. Antioxidant and free radical scavenging activity of an aqueous extract of Coleus aromaticus. Food Chemistry, 97: 109-114.
23. Miller, H.E. 1971. A simplified method for evaluation of antioxidant. Journal of the American Oil Chemists Society, 48: 91.
24. Mimica-Dukic, N., Bozin, B., Sokovic, M. and Simin, N. 2004. Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L. (Lamiaceae) essential oil. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 2485-2489.
25. Miraj, S., Rafieian-Kopaei, and Kiani, S. 2017. Melissa officinalis L: A review study with an antioxidant prospective. Journal of Evidence - Based Complementary and Alternative Medicine, 22: 385-394.
26. Moosavy, M.H., Akhondzadeh Basti, A, Misaghi, A., Zahraei Salehi, T., Abbasifar, R., Ebrahimzadeh Mousavi, H.A., Alipour, M., Emami Razavi, N., Gandomi, H. and Noori, N. 2008. Effect of Zataria multiflora Boiss. essential oil and nisin on Salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus in a food model system and on the bacteria cell membranes. Food Research International, 41: 1050-1057.
27. Moradi, M., Hassani, A., Ehsani, A., Hashemi, M., Raeisi, M. and Naghibi, S.S. 2014. Phytochemical and antibacterial properties of Origanum vulgare ssp. gracile growing wild in Kurdistan province of Iran. Journal of Food Quality and Hazards Control, 1: 120-124.
28. Pino, J.A., Rosado, A. and Fuentes, V. 1999. Composition of the essential oil Melissa officinalis L. From Cuba. Journal of Essential Oil Research, 11: 363-364.
29. Shojaii, A. and Abdollahi-Fard, M. 2012. Review of pharmacological properties and chemical constituents of Pimpinella anisum. International Scholarly Research Network: Pharmaceutics, 2012: 510795.
30. Venskutionis, P.R., Dapkevicius, A. and Baranuauskiene, M. 1995. Flavour composition of some lemon-like aroma herbs from Lithuania. Developments in Food Science, 37: 833-847.
31. Yosofi, M., Hojjati, M.R., Moshtaghi, E., Rahimiyan, R., Dawodiyan-Dehkordi, A. and Rafieian Kopaei, M. 2011. The effect of hydro-alcoholic extract of Melissa officinalis on learning and spatial memory in Balb/c mice. Journal of Shahrekord University of Medical Sciences, 13: 51-59. [Full Text in Persian]
32. Yu, S.G., Hildebrandt, L.A. and Elson, C.E. 1995. Geraniol, an inhibitor of mevalonate biosynthesis, suppresses the growth of hepatomas and melanomas transplanted to rats and mice. The Journal of Nutrition, 125: 2763-2767.