ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت جداشده از برخی گونه‌های دارویی بومی استان گلستان

اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی

مقاله 4، دوره 8، شماره 1 - شماره پیاپی 29، خرداد 1399، صفحه 64-76   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

ساره حاتم زاده^{* 1}؛ کامران رهنما²؛ سعید نصرالله نژاد³؛ خلیل بردی فتوحی فر⁴؛ خدایار همتی⁵؛ جیمز وایت⁶

¹گروه گیاهپزشکی،دانشکده تولید گیاهی،دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان،ایران

²-1 گروه گیاهپزشکی ، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان

³گروه گیاهپزشکی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان

⁴گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی،دانشگاه تهران،کرج.

⁵گروه باغبانی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان،گرگان

⁶گروه بیولوژی و بیماری شناسی گیاهی ، دانشگاه راتگرز، نیوبرونزویک نیوجرسی،آمریکا

چکیده

گیاهان دارویی منبع بسیار غنی از ترکیبات آنتی­اکسیدانی هستند، قارچ‌های اندوفیت گیاهان دارویی درنتیجه همزیستی طولانی‌مدت با این گیاهان می‌توانند برخی خصوصیات زیستی گیاه میزبان خود و توانایی تولید متابولیت‌‌‌‌‌‌‌های ثانویه گیاهی را به دست آورده‌اند. ازاین‌رو در این پژوهش خاصیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت همزیست با هفت گیاه دارویی از تیره Asteraceae شامل Matricaria chamomilla, Anthemis triumfetii, Anthemis parthenium, Anthemis altissima var. altissima, Achillea millefolium, Achillea filipendulina, Cichorium intybus موردبررسی قرار گرفت. نمونه‌برداری از گیاهان سالم و عاری از هرگونه علائم بیماری از بیشتر مناطق رویشگاه این گیاهان از ارتفاعات استان گلستان در بهار 1395انجام شد. پس از جداسازی قارچ‌ها و بررسی‌های ریخت‌شناسی و شناسایی مولکولی به روش چندژنی خاصیت آنتی‌اکسیدانی 37 گونه قارچ اندوفیت  به روش تخریب رادیکال­های آزاد DPPH موردبررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده اختلاف معنی­دار در سطح 99 درصد بین خواص آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت مشاهده گردید و دامنه فعالیت آنتی‌اکسیدانی بین 11/32  تا 83/98 درصد متغیر بود. کمترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی مربوط به قارچ Stemphylium amaranthiکه از بافت برگ گونهAnthemis triumfetiiجدا شده بود و بیشترین میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی مربوط به قارچ Trametes versicolor  جدا شده از بافت ساقه گونه بومادران زرد (Achillea filipendulina) بود. همچنین از نظر فعالیت انتی اکسیدانی گونه قارچ گوش ماهی Schizophyllum communeبا میزان 8/98درصددر یک گروه با قارچT. versicolor از بازیدیومیست­هاقرار گرفت. گونه‌هایی از جنس  Cladioporium sp. شامل  Cladosporium cladosporioides و Cladosporium ramotenellum میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالایی را  حدود 97 درصد از خود نشان دادند. با توجه به زمان تولید کوتاه مدت و نرخ رشد بالای قارچ­ها و عدم نیاز به تخریب اکوسیستم نسبت به حفظ ذخایر گیاهان دارویی می­تواند اندوفیتها را به انتخاب خوبی برای تولید مواد آنتی‌اکسیدانی تبدیل کند.

کلیدواژه‌ها

آنتی‌اکسیدانی؛ قارچ اندوفیت؛ گیاهان دارویی؛ Asteraceae

اصل مقاله

 

 

فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، شماره پیاپی 29، سال هشتم، شماره 1، بهار 1399

 

ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت جداشده از برخی گونه‌های

دارویی بومی استان گلستان

 

ساره حاتم‌زاده¹، کامران رهنما^2*، سعیدنصراله‌نژاد²، خلیل بردی­ فتوحی­فر³، خدایارهمتی⁴، جیمزوایت⁵

¹دکتری بیماری شناسی گیاهی، گروه گیاه‌پزشکی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

²دانشیار، گروه گیاه‌پزشکی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

³دانشیار، گروه گیاه‌پزشکی،دانشکده کشاورزی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

⁴دانشیار، گروه باغبانی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه علوم کشاورزی منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

⁵استاد، گروه بیولوژی بیماری شناسی گیاهی، دانشگاه راتگرز، نیوبرونزویک نیوجرسی، آمریکا

 

تاریخ دریافت: 2/11/97     تاریخ پذیرش: 31/2/98

 

چکیده

گیاهان دارویی منبع بسیار غنی از ترکیبات آنتی­اکسیدانی هستند، قارچ‌های اندوفیت گیاهان دارویی درنتیجه همزیستی طولانی‌مدت با این گیاهان می‌توانند برخی خصوصیات زیستی گیاه میزبان خود و توانایی تولید متابولیت‌‌‌‌‌‌‌های ثانویه گیاهی را به دست آورده‌اند. ازاین‌رو در این پژوهش خاصیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت همزیست با هفت گیاه دارویی از تیره Asteraceae شامل Matricaria chamomilla, Anthemis triumfetii, Anthemis parthenium, Anthemis altissima var. altissima, Achillea millefolium, Achillea filipendulina, Cichorium intybus موردبررسی قرار گرفت. نمونه‌برداری از گیاهان سالم و عاری از هرگونه علائم بیماری از بیشتر مناطق رویشگاه این گیاهان از ارتفاعات استان گلستان در بهار 1395انجام شد. پس از جداسازی قارچ‌ها و بررسی‌های ریخت‌شناسی و شناسایی مولکولی به روش چندژنی خاصیت آنتی‌اکسیدانی 37 گونه قارچ اندوفیت  به روش تخریب رادیکال­های آزاد DPPH موردبررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده اختلاف معنی­دار در سطح 99 درصد بین خواص آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت مشاهده گردید و دامنه فعالیت آنتی‌اکسیدانی بین 11/32  تا 83/98 درصد متغیر بود. کمترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی مربوط به قارچ Stemphylium amaranthiکه از بافت برگ گونهAnthemis triumfetiiجدا شده بود و بیشترین میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی مربوط به قارچ Trametes versicolor  جدا شده از بافت ساقه گونه بومادران زرد (Achillea filipendulina) بود. همچنین از نظر فعالیت انتی اکسیدانی گونه قارچ گوش ماهی Schizophyllum communeبا میزان 8/98درصددر یک گروه با قارچT. versicolor از بازیدیومیست­هاقرار گرفت. گونه‌هایی از جنس  Cladioporium sp. شامل  Cladosporium cladosporioides و Cladosporium ramotenellum میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالایی را  حدود 97 درصد از خود نشان دادند. با توجه به زمان تولید کوتاه مدت و نرخ رشد بالای قارچ­ها و عدم نیاز به تخریب اکوسیستم نسبت به حفظ ذخایر گیاهان دارویی می­تواند اندوفیتها را به انتخاب خوبی برای تولید مواد آنتی‌اکسیدانی تبدیل کند.

 

واژه‌های کلیدی:آنتی­اکسیدانی، قارچ اندوفیت، گیاهان دارویی،Asteraceae[1]

 

 

مقدمه

قارچ‌های اندوفیت از مهمترین میکروارگانیسم‌های نهفته همراه با گیاهان در طبیعت هستند کـــه همـــراه با گیاهان تک لپه‌ای و دولپه‌ای بوده و در طی چند سال گذشته به اهمیت آنها در حفاظت از گیاهان در برابر استرس، خشکی و شوری خاک پی برده شده است. لیکن این عوامل از گیـــاهـان دارویی کمتر در مقایسه با سایر گیــاهان مورد مطالعـه قرار گرفته است. اولین گزارش شناخته شده از قارچ‌های اندوفیت توسط دانشمندانی صورت گرفت که هیف­های قارچی را در داخل دانه­های به ظاهر سالمLolium temulentum ، گراسی که در زمان‌های قدیم به عنوان علف هرز سمی شناخته شده بود، مشاهده کردند (Sánchez Márquez et al., 2010). ژﺋﻮ در سال 1999 قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ را در ﮔﯿﺎه دارویی ﭘﺎﻟﻢﻓﻦ ﭼﯿﻨﯽ (Livistona chinesis) در ﻫﻨﮏ ﮐﻨﮓ موردبررسی ﻗﺮار داد و ﺗﻌﺪاد 60 ﮔﻮﻧﻪ ﺑﺮ اﺳﺎس ﺧﺼﻮﺻﯿﺎت ﻣﻮرﻓﻮﻟﻮژﯾﮑﯽ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ کرد (Guo et al., 1999). سپس مطالعه قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ در درﺧﺖRubus parviflor  در ﮐانادا انجام گرفت (Shamouna and Sieber, 2000). ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ ﻓﺮاواﻧﯽ قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ در ﭼﻬﺎر ﮔﯿﺎه رازﯾﺎﻧﻪ، ﮐﺎﻫﻮ،
ﮐﺎﺳﻨﯽ و ﮐﺮﻓﺲ نشان داد که جنس­های Fusarium،Alternaria  ،Acremonium  در ﻫﺮ ﭼﻬﺎر ﮔﯿﺎه ﯾﺎﻓﺖ ﺷﺪﻧﺪ و ﮔﻮﻧﻪ Plectosporium tabacinum ﮔﻮﻧﻪ ﻏﺎﻟﺐ ﺟﺪاﺳﺎزی ﺷﺪه ﺑﻮد (D'Amico et al., 2008). ﻋﻠﯽرﻏﻢ ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت زﯾﺎدی ﮐﻪ روی قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ در دﻧﯿا اﻧﺠﺎم ﮔﺮﻓﺘﻪ اﺳﺖ، در اﯾﺮان ﻣﻄﺎﻟﻌﺎت در زﻣﯿﻨـﻪ قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ گیاهان دارویی بسیار اﻧﺪک می‌باشد. ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺟﺪاﺳﺎزی قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ و ﺑﺮرﺳﯽ ﺗﻮﻟﯿﺪ ﺗﺎﮐﺴﻮل در اﯾﻦ قارچ‌ها از ﺳﺮﺧﺪار
ﺑﻮﻣﯽ اﯾﺮان Taxusbaccata، ﺗﻌﺪاد80 ﺟﺪاﯾﻪ اﻧﺪوﻓﯿﺖ ﺟﺪاﺳﺎزی گردیده است ﮐﻪ در اﯾﻦ ﺑﯿﻦ، ﭘﻨﺞ ﺟﺪاﯾﻪ ﻗﺎدر ﺑﻪ ﺗﻮﻟﯿﺪ ﺗﺎﮐﺴﻮل ﺑﻮدﻧﺪ (نصیری ﻣﺪﯾﺴﻪ و ﻫﻤﮑﺎران 1388). در مطالعه­ای که در استان همدان برای بررسی ﺣﻀﻮر قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿﺖ در ﮔﯿﺎه آوﯾﺸﻦ انجام گرفت، جنس­هایPhoma ،Alternaria  Fusarium،Stemphylium ،Ulocladium  تحت ﻋﻨﻮان اﻧﺪوﻓﯿﺖ از ﮔﯿﺎه آوﯾﺸﻦ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روشﻫـﺎی ﻣﻮرﻓﻮﻟﻮژﯾﮑﯽ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﺷﺪند (Masoumi et al., 2012).

در سال 1391 ﺑﻪ ﻣﻨﻈﻮر ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ قارچ‌های اﻧﺪوﻓﯿــﺖ ﮔﯿـﺎه ﺳﺮﺧﺪار ﻣﻌﻤﻮﻟــﯽ ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎﯾﯽ از ﺑﺎﻓﺖﻫﺎی ﺳﺎﻟﻢ ﭘﻮﺳﺖ و ﺷﺎﺧﻪ اﯾﻦ ﮔﯿــﺎه از ﻣﻨــﺎﻃﻖ زرﯾﻦ ﮔﻞ ﺷﻬﺮﺳﺘﺎن ﻋﻠﯽ آﺑﺎد اﺳﺘﺎن ﮔﻠﺴﺘـــﺎن و ﺑــﺎغ ﮔﯿﺎهﺷﻨﺎﺳﯽ ﭘﺮدﯾﺲ ﮐﺸﺎورزی و ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻃﺒﯿﻌﯽ داﻧﺸﮕـﺎه ﺗﻬﺮان، ﮔﻮﻧﻪﻫﺎی C. ،C. herbarum ،Cladosporium subtilissimum C. basiinflatum،cladosporioides و C. perangustum ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از روش ﻣﻮرﻓﻮﻟﻮژﯾﮑﯽ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﺷﺪﻧﺪ (Jam Ashkezari et al., 2014).

اخیرا استفاده از گیاهان دارویی به خاطر کاربرد چند منظوره آنها و تنوع فراوان آنها برای منابع جدیدی از آنتی‌اکسیدان­ها مورد مطالعه فـــراوان قــرار گرفته‌اند (Srinivasan et al., 2010). علی‌الخصوص خاصیت آنتی­اکسیدانی به‌میزان بالا برای ترکیب­های فنولیک و فلاونوئید حاصل از گیاهان به اثبات رسیده است. یکی از مهمترین اثرات تخریبی رادیکال‌های آزاد شروع پراکسیداسیون لیپید می‌باشد که به تخریب غشای سلول منجر می‌شود. پراکسیداسیون لیپید باعث اختلال در سازمان‌بندی غشا و تغییر فعالیت آنزیم‌های وابسته به آن و پروتئین‌های دیگر می‌شود که همراه با آزاد کردن رادیکال‌های هیدروپراکسیل وآلکوپراکسیل به‌صورت بالقوه برای سلول مضر می‌باشد. وجود میزان بالا رادیکال­های آزاد در بدن خطرناک است زیرا با آسیب به سلول‌ها می‌توانند منجر به سرطان شوند (Jagadish et al., 2009).

بدن برای مقابله با رادیکال‌های آزاد شروع به تولید مقادیری آنتی­اکسیدان‌های مورد نیاز می­نماید. از این رو، مصرف آنتی­اکسیدان در رژیم غذایی ضروری است. اندوفیتها میکروارگانیسم‎های هستند که در داخل گیاه بخصوص برگها، ساقه‎ها و ریشه‎ها به صورت همزیست زندگی می‌کنند و هیچ آسیبی آشکاری به میزبان نمی‌رسانند (Duan et al., 2010). تقریبا همه رده‎های گیاهان آوندی و گیاهان داروئی موردبررسی قرار گرفته تا به امروز میزبان موجودات اندوفیت هستند (Aly et al., 2011). قارچ‌های اندوفیت مخزن متابولیت­های ثانویه میزبان خود بــوده و حاوی ترکیبات فعال زیستی می‌باشند. قارچ‌های اندوفیت گیاهان دارویی درنتیجه همزیستی طولانی‌مدت با این گیاهان می‌توانند توانایی تولید متابولیت‌‌‌‌‌‌‌های ثانویه جدید را به دست آورده‌اند (Arbaayah et al., 2013). محققین باور دارند، دلیل این‌که چرا قارچ­های اندوفیت برخی ترکیبات شیمیایی شبیه به گیاهان را تولید می‌کنند این است که یک نوترکیبی ژنتیکی در طی تکامل بین اندوفیت و میزبانش رخ داده است (Strobel et al., 1996; Shahiri et al., 2016). علاوه براین مشخص شده که تولید محصولات با ارزش از منبع میکروبی آسان‌تر، با سرعت بالاتر و اقتصادی‌تر بوده و در کاهش قیمت فروش آن‌ها موثر است. در همین حال، تصور می‌شود که برخی گیاهان تولیدکننده محصولات طبیعی فعال زیستی با اندوفیت‌های تولیدکننده محصولات طبیعی مشابه در ارتباط‌اند و این واقعیت که با توجه به زمان تولید کوتاه مدت و نرخ رشد بالای میکروب‌ها، اندوفیت­ها را به انتخاب خوبی برای تولید مواد کاربردی در طیف گسترده‌ای از عرصه‌های پزشکی، کشاورزی و صنعتی تبدیل کرده است. همچنین بسیاری از گزارش‌ها و مطالعات در مورد فعالیت‌های بیولوژیکی اندوفیت­ها مانند اثرات ضدسرطان و اثرات ضد میکروبی منتشر شده در صورتی­که خواص آنتی‌اکسیدانی قارچ اندوفیت گیاهان دارویی به میزان بسیار کم مورد مطالعه قرار گرفته­اند. با توجه به اینکه استان گلستان زیست بومی غنی از تــنوع زیستـــی و بیولوژیکی گیاهان دارویی به شمار می­آید و امروزه در قلمرو وسیع این گیاهان، تنها تعداد انگشت شماری از گونه‌های گیاهی همزیست با اندوفیت­ها مورد مطالعه قرار گرفته است. در این تحقیــق خواص آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت همزیست گیاهان دارویی تیره Asteraceae در استان گلستان موردبررسی قرار گرفته است.

 

مواد و روش‌ها

تهیه نمونه گیاهی و قارچی: استان گلستان را از نظر ناهمواری­ها می­توان به سه ناحیه کوهستانی، کوهپایه ای و جلگه ای تقسیم کرد. درجه حرارت نقاط مختلف استان یکسان نیست. هرچه از غرب به شرق و از جنوب به شمال برویم بر دمای محیط افزوده می­شود . روش تحقیق بدین صورت بوده است که ابتدا استان گلستان به 4 قسمت اراضی جنگلی، مراتع قشلاقی، مراتع ییلاقی و اراضی زراعی تقسیم شد. سپس با توجه به فصل رویش هر قسمت، مبادرت به انجام عملیات صحرایی و نمونه گیری از گیاهان شد. نمونه‌برداری از گیاهان سالم و عاری از هر گونه بیماری از گونه­هایMatricaria chamomilla, Anthemis triumfetii, Anthemis parthenium, Anthemis altissima var. altissima, Achillea millefolium, Achillea filipendulina, Cichorium intybus از مناطق بومی این گیاهان نظیر ارتفاعات توسکستان، چهارباغ، مراوه تپه، آق قلا، پارک ملی گلستان، منطقه حفاظت شده جهان­نما، دهنه محمدآباد،کلاله، درازنو، چه­جا، هزارپیچ و زیارت در استان گلستان و در فصل بهار سال 1395 انجام گردید.ارتفاع مکان­های نمونه­برداری متفاوت بوده و بالاترین ارتفاع در منطقه درازنو حدود 2770 متر تا کمترین ارتفاع که حدود 56 متر در محدوده شهر آق قلا بود.

کشت و جداسازی قارچ‌های اندوفیت: از هر گونه گیاه دارویی 30 گیاه سالم، شامل ریشه، ساقه، برگ و گل انتخاب گردید. نمونه‌ها در کیسه‌های پلاستیکی در یخچال قبل از جداسازی قارچ‌های نگهداری شدند. سپس نمونه‌ها به‌مدت 10 دقیقه در زیر آب شیر شستشو سپس خشک گردیده و به قطعات 5/0 تا 1 سانتی‌متری تقسیم شده و ابتدا در اتانول 75% به‌مدت 1 دقیقه و در محلول هیپوکلریت ‌سدیم 5/0 تا 3 درصد به‌مدت 3 تا 5 دقیقه (بسته به ضخامت بافت) و سپس اتانول 75 درصد به‌مدت 30 ثانیه قـرار داده شدند. نمونه‌ها پس از ضدعفونی سطحی 6 بار در آب مقطر شسته شده و برای خشک شدن بر
روی کاغذ فیلتر در شرایط استریل قرار داده شدند. پس از خشک شدن در پتری‌های حاوی PDA(Potato dextrose agar) حاوی استرپتومایسین (20 میکروگرم / میلی لیتر) و کلرامفنیکل (30 میکروگرم / میلی لیتر) برای جلوگیری از رشد باکتری­ها قرار داده شدند. این نمونه‌ها در دمای 27-25 درجه سلسیوس به مدت 30 روز نگهداری گردیدند. سپس بررسی روزانه جهت رویت عدم حضور آلودگی ساپروفیتی و اطمینان از حضور قارچ‌های اندوفیت انجام گرفت. پس از رویت قارچ‌ها روی ریزنمونه­ها به روش نوک هیف قارچ‌های رشد یافته از قطعات برگ جدا نموده و در محیط کشت جدید خالص‌سازی گردیدند. پس از خالص­سازی ریسه­های قارچ‌های اندوفیت در هر تیمار اقدام به تهیه اسلاید و بررسی خصوصیات ریسه­ها، زیر میکروسکوپ و شناسایی با استفــــاده از بررسی‌های مورفولوژیک معتبر (Eliss, 1971) و همچنین روشهای مولکولی انجام گردید.

تهیه عصاره از قارچ‌ها: قارچ‌ها در محیط کشت PDA در 28 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 6-3 روز کشت شدند. برای تهیه محیط کشت سوسپانسیون برای رشد ریسه قارچ‌ها، از محیط کشت PDB (Potato dextrose broth) استفاده شد. قارچ‌ها خالص سازی شده و در قرص‌های مشخص به میزان 5×5 سانتی متر قطع شده و در ارلن­های 250 سی­سی با 200 سی­سی محیط کشت PDB مایع کشت گردیده و ارلن­های آماده شده درون شیکر در شرایط تاریکی، دمای 2±25 درجه و دور rpm 120 برای مدت زمان 3-4 هفته نگهداری گردیدند. پس از گذشت این زمان ماده موثره موجود در محیط کشت قــارچ استخـــراج گردید. بدین منظور ابتدا ریسه­های قارچی به وسیله غربال از قسمت مایع جدا شده و با آب مقطر استریل سه بار شستشو شده و این مسیلیوم‌ها پس از پودر شدن با حجم برابر از حلال اتیل استات مخلوط و 24 ساعت روی دستگاه شیکر در شرایط تاریکی، دمای 2±25 درجه و دور rpm120 نگهداری شدند پس از طی این مدت زمان با استفاده از یک قیف دکانتور فاز آلی حاصل جداسازی و در دمای اتاق با استفاده از دستگاه روتاری تبخیر گردید. استخراج سه بار انجام گرفت و ماده خشک حاصل در یک میلی لیتر متانول حل و در 4 درجه سانتی گراد نگهداری گردید (Jagadish et al., 2009).

بررسی خاصیت آنتی­اکسیدانی: برای انجام این مرحله ابتدا عصاره‌های قارچی متفاوت با متانول 80 درصد مخلوط شده و به مدت 24 ساعت برروی شیکر قرار داده شدند. سپس با دور rpm3500 به مدت ده دقیقه سانتریفیوژ شدند. برای سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی از روش DPPH(2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl) استفاده شد. برای این منظور ابتدا محلول DPPH با غلظت 004/0 درصد تهیه و از آن یک میلی­لیتر با یک میلی لیتر عصاره با غلظت 1/. درصد مخلوط و بشدت تکان داده شد. سپس محلول آماده شده به مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شد و میزان جذب آن در طول موج 517 نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت گردید. سپس با استفاده از معادله زیر درصد دام اندازی رادیکال آزاد DPPH اندازه‌گیری گردید (Liu et al., 2007).

Scavenged%=Ab-As/Ab x 100

A_blank : جذب DPPH در 517 نانومتر (بدون عصاره قارچ)

A_sample : جذب نمونه‌ها در 517 نانومتر

طرح در قالب طرح کاملا تصادفی با سه تکرار انجام پذیرفت و آنالیز داده­ها با استفاده از نرم افزار SPSS و آزمون چند دامنه ای دانکن در سطح احتمال 1% صورت پذیرفت.

شناسایی مولکولی قارچ‌های اندوفیت دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی: استخراج  DNA ژنومی به روش CTAB انجام گرفت به این صورت که دیسک­هایی از کلنی‌های رشد کرده روی محیطPDA در محیط کشت مایع PDB کشت داده شد. بطری‌های حاوی محیط کشت مایع به شیکر (با سرعت 120 دور در دقیقه) انتقال یافت و پس از حدود یک هفته، میسلیوم­های قارچ به‌دست آمد. پس از آب­گیری، میسلیوم­ها در‌هاون استریل پودر شده و600 میکرولیتر بافر CTAB به ویال‌های حاوی پودر میسلیوم اضافه و کاملاَ مخلوط گردید. سپس به هرکدام از ویال­ها 2 میکرولیتر مرکاپتواتانول اضافه و سپس به بن ماری C˚65 منتقل گردیدند. پس از ‌ گذشت 45 دقیقه، به‌منظور پروتیین‌زدایی، به هر ویال 600 میکرولیتر مخلوط کلروفرم – ایزوآمیل الکل به نسبت 1:24 اضافه شده و به‌مدت 10 دقیقه در 12000 دور سانتریفیوژ  گردید. پس از سانتریفیوژ سه فازتشکیل گرید فاز زیرین کلروفرم و فاز رویی محتویDNA بود. بین این دو فاز مایع، لایه‌ای متشکل از بقایای دیواره سلولی قرار گرفت. فاز رویی با دقت به ویال‌های جدید منتقل گردید و هم حجم آن ایزوپروپانول خنک به محتویات ویال اضافه شده و بعد از ده بار وارونه کردن ویال‌ها، آنها را به مدت نیم ساعت در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری گردید. پس از این مدت تیوب‌ها، به‌مدت 15 دقیقه در 13000 دور سانتریفیوژ شده و در نهایت  پس از رسوب DNA، فاز مایع تخلیه و رسوب حاصله با اتانول 70 درصد شستشو شد. بعــد از خشک شـــدن رسوب DNA  به هر ویال 70 میکرولیتر آب مقطر تزریقی اضافه گردیده و پس از 30دقیقه نگهداری در یخچال به فریزر 20- انتقال یافت. برای تکثیر در PCR از پرایمرهای (LROR,LR5)، (BSANDRY,T1)، (EF1-983F, Efgr)، (ITS4,  ITS5) هرکدام از پرایمرها به میزان 1 میکرولیتر، DNA ژن.می به میزان 2 میکرولیتر(40 میـــکروگرم)، Red amplicon Master Mix 2x (12.5) میکرولیتر و آب دوبا تقطیر به میزان 8.5 میکرولیتر استفاده گردید (Raja et al., 2017). برای ارزیابی محصول، از آگارز یک درصد در بافر TBE با ولتاژ 85 استفاده شد. رنگ آمیزی محصول PCR با استفاده از Gel red انجام گرفت و با دستگاه  documentation system Gel عکس بردای انجام گرفت. سپس برای توالی یابی به روش سنگر به شرکت ماکروژن کره جنوبی ارسال گردید. توالی ژنوم بدست آمده را ازطریق نرم افزار بلاست در NCBI موردبررسی قرار گرفت و شباهت آنها با سایر توالی موجود در بانک جهانی تعیین شده و مراحل ثبت ژن در این پایگاه انجام پذیرفت.

 

 

نتایج

شناسایی قارچ­های اندوفیت: در این بررسی827 ایزوله قارچی از هفت گونه گیاه دارویی مورد جداسازی قرار گرفت که پس از بررسی­های مورفولوژیک و مطالعات مولکولی چند ژنی بر اساس پرایمرهای (LROR,LR5)، (BSANDRY,T1)، (EF1-983F, Efgr)، (ITS4,  ITS5) تعداد 104 گونه قارچی مورد شناسایی قرار گرفت و ژن­های موردبررسی قرار گرفته در پایگاه داده‌های بیوتکنولوژی NCBI ثبت گردید.  به دلیل تعدد گونه­های شناسایی شده از هرگونه گیاهی تعداد محدودی برای بررسی‌های انتی­اکسیدانی در نظر گرفته شد (جدول2). تمام این گونه­های قارچی برای اولین بار از ایران و جهان به عنوان اندوفیت این گیاهان گزارش می­شوند. گونه‌های Septoria tormentillae، Preussia africana، Stephanonectria keithiiتاکنون از ایران گزارش نشده بوده و برای   اولین بار در این بررسی از ایران گزارش می­شوند و برای میکروفلور ایران جدید می­باشند. همچنین جداسازی قارچ‌های اندوفیت از رده بازیدیومیست­ها نظیر Bjerkandera adusta ، Schizophyllum commune، Trametes versicolor تا به امروز جز موارد نادر از گزارش این رده از قارچ‌ها به عنوان اندوفیت از گیاهان می­باشند.

 

 

 

شکل1: خارج شدن قارچ‌های اندوفیت از بافت ساقه پس از 14 روز روی محیط کشت PDA

 

گونه قارچ (Fr)  Schizophyllum commune:این گونه قارچ اندوفیت از گیاه Anthemis altissimaجداسازی گردید و روی محیط کشت PDA پس از 14 روز به رنگ سفید و پنبه‌ای، دارای نرخ رشد سریع، میسیلیوم دارای دیواره نازک، شفاف، اسپـــورها استوانه‌ای تا بیضوی به ابعاد 3-1 میکرومتر بودند، اندام باردهی قــارچ در روی محیــط کشت تشکیل گردید. بر اساس بررسی‌های ریخت‌شناسی (Natrajan and Kolandavelu, 1998) و مولکولی جدایه مورد نظر شباهت 99% را با گونه Schizophyllum commune نشان داد.

گونه قارچ  Trametes versicolor (Fr.) pilat: این گونه قارچی که متعلق به شاخه بازیدیومایکوتا و معروف به قارچ رنگین کمان می­باشد از بافت ساقه گونه بومادران زرد Achillea filipendulina جداسازی گردید و پرگنه‌های قارچ روی محیط کشت PDA پس از 14 روز به رنگ سفید و پنبه ای،دارای نرخ رشد سریع، میسیلیوم دارای دیـــواره نازک، شفـــاف، منشعب و به قطر 4-2 میکرومتر بود. براساس خصوصیات ریخت‌شناسی (Ryvarden, L.; Johansen, I. 1980) و مولکولی چندژنی، جدایه‌ی بدست آمده Trametes versicolor (fr.) pilat شناسایی گردید.

 

 

شکل2: راست: کلنی قارچ روی محیط کشت PDA. چپ:رویت قوس اتصال در قارچ T. versicolor

 

گونه قارچ  Preussia africana(Arenal, Platas and Peláez): این گونه قارچی از گیاه Achillea filipendulinaجداسازی گردید. کلنی قارچ روی محیط کشت PDA پس از 14 روز در دمای 25 درجه به قطر 70 میلیمتر و به رنگ قهوه­ای تیره تــا سیــاه و فرورفته در محیط کشت بود. آسکوماتا پراکنده تا مجتمع و در بیشتر اوقات در بافت محیط کشت غوطه ور بود. سودوتسیوم به قطر 288-205 میکرومتر، گلابی شکل،صاف، قهوه­ای روشن تا قهوه­ای تیره دارای گردن باریک به قطر 60-52 ×40-22 میکرومتر، استوانه­ای شکل و دارای هیف­های به قــطر 20-12×4-2 میکرومتر، پریدیوم به رنگ قهوه‌ای تیره، آسک 110-90×17-16 میکرومتر، هشت اسپوره،بیرنگ، استوانه­ای شکل، اسکوسپورهـــا به ابعاد 42-37×4-3 میکرومتر، استوانه ای شکل، بیرنگ تا قهوه­ای تیره بودند.

 

 

 

شکل3: سمت راست: آسکوکارپ قارچ Preussia africana سمت چپ: کلنی قارچ Preussia africana

روی محیط کشت PDA پس از 14 روز

 

بررسی خاصیت آنتی­اکسیدانی: عصاره اتیل استاتی قارچ­های اندوفیت هفت گونه گیاه دارویی از لحاظ میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی مورد ارزیابی قرار گــرفت. DPPH  (2 و 2- دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل) رادیکال آزاد پایداری است که خصوصیت جذب آن در ٥١٧ نانومتر برای مطالعه اثرات به دام اندازی رادیکال­ها توسط عصاره، مورد استفاده قرار می­گیرد. این رادیکال آزاد ارغوانی رنگ است، در تماس با ترکیب آنتی­اکسیدان (عصاره) بــــه ترکــیب پایدار زرد رنگی تبدیل می­شود که آنتی‌کسیدان­ها، پروتون را به رادیکال­های آزاد داده و سبب کاهش میزان جذب می­شوند. کاهش میزان جذب معیاری برای سنجش به دام­اندازی رادیکال‌های آزاد می­باشد. ظرفیت به دام اندازی رادیکـــال­های آزاد به روش  DDPHدر جدول 2 نشان داده شده است.

 

جدول 1: نتایج تجزیه واریانس بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی به روش ANOVA

سطح معنی‌دار	مقدار F	میانگین مربعات	درجه آزادی	منبع تغییرات
000/0	053/1	34/1182	35	بین گروه‌ها
		11	72	درون گروه
			107	کل

 

 

بر اساس نتایج به دست آمده اختلاف معنی­دار در سطح 99 درصد بین خواص آنتی‌اکسیدانی قارچ‌ها مشاهده گردید که دامنه فعالیت آنتی­اکسیدانی بین 11/32 و 83/98 درصد بود و کمترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی مربوط به قارچStemphylium amaranthiکه از بافت برگAnthemis triumfetiiجدا شده بود و بیشترین میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی مربوط به قارچ Trametes versicolor از بافت ساقه گونه گیاهی بومادران زرد Achillea santolina بود. همچنین گونه بازیدیومیستSchizophyllum communeبا میزان 8/98 درصددر یک گروه با قارچT.versicolorقرار گرفت. در این بررسی گونه­هایی از جنس  Cladosporium sp. شامل Cladosporium cladosporioides و Cladosporium ramotenellum میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالایی را از خود نشان دادند (جدول 2).

بنابراین در این بررسی گونه‌های اندوفیت قارچی جدا شده از گیاه بومادران  Achillea filipendulina فعالیت آنتی‌اکسیدانی بیشتری نسبت به بقیه گیاهان از خود نشان دادند.

 

 

 

 

شکل4: میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت از هفت گونه گیاه دارویی

در استان گلستان

 

 

جدول2: میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت هفت گونه گیاه دارویی

درصد مهار		کد ثبت شده در NCBI	درصد شباهت	گونه قارچ	بافت	گیاه میزبان	نام ایزوله
3/83		MH583749	100%	Leptosphaerulina saccharicola	برگ	Achillea millefolium	AM01
	49/74	MH259172	99%	Septoria lycopersici var. lycopersici	ساقه	Achillea millefolium	AM04
	08/58	MH259166	100%	Fusarium redolens	ریشه	Achillea millefolium	AM13
	75/92	MH259188	100%	Colletotrichum tanaceti	ساقه	Achillea millefolium	Am33
49/74		MH259171	100%	Septoria tormentillae	برگ	Achillea millefolium	AM51
55/96		MH259170	99%	Cladosporium ramotenellum	ساقه	Achillea millefolium	AM55
52/71		MH259183	99%	Nemania serpens	ساقه	Achillea millefolium	Am64
35/72		MG583742	100%	Fusarium avenacearum	برگ	Achillea millefolium	Am84
12/59		MH259177	100%	Fusarium sp.	برگ	Achillea millefolium	Am87
13/91		MH259181	99%	Alternaria burnsii	برگ	Achillea millefolium	Am88
05/76		MH250008	98%	Antennariella placitae	ساقه	Achillea filipendulina	As01
05/76		MG583753	99%	Preussia africana	ساقه	Achillea filipendulina	As03
83/98		MG583750	99%	Trametes versicolor	ساقه	Achillea filipendulina	As10
44/62		MH250010	100%	Acremonium sclerotigenum	ساقه	Achillea filipendulina	As16
26/32		MH250007	100%	Plectosphaerella cucumerina	ساقه	Achillea filipendulina	As23
12/52		MH245101	99%	Xylaria sp.	ساقه	Matricaria chamomilla	BA04
72/36		MH245096	99%	Phoma haematocycla	ساقه	Matricaria chamomilla	BA06
01/90		MH245107	100%	Epicoccum nigrum	ساقه	Matricaria chamomilla	BA18
57/85		MH245097	99%	Paramyrothecium roridum	ساقه	Matricaria chamomilla	BA24
11/32		MH245085	100%	Stemphylium amaranthi	برگ	Anthemis triumfetii	BB26
61/96		MH245079	100%	Arthrinium phaeospermum	گل	Achillea filipendulina	Bg15
49/95		MH245075	99%	Verticillium dahliae	ساقه	Anthemis altissima	Br09
29/98		MH245072	99%	Cladosporium cladosporioides	برگ	Anthemis altissima	Br15
15/97		MH255558	99%	Bjerkandera adusta	ساقه	Anthemis altissima	Br19
12/75		MH245105	99%	Plenodomus tracheiphilus	ساقه	Anthemis altissima	Br20
25/71		MH245078	99%	Aspergillus calidoustus	برگ	Anthemis altissima	Br38
62/81		MH245090	99%	Ulocladium consortiale	برگ	Anthemis altissima	Br41
20/60		MH245108	100%	Didymella tanaceti	برگ	Anthemis altissima	Br42
8/98		MH255552	99%	Schizophyllum commune	ساقه	Anthemis altissima	Br50
08/62		MG655161	100%	Cladosporium tenuissimum	ساقه	Cichorium intybus	K15
09/82		MH255560	100%	Bjerkandera adusta	ساقه	Cichorium intybus	K20
45/52		MH258985	99%	Diaporthe noveum	برگ	Cichorium intybus	K26
28/98		MH258972	100%	Epicoccum nigrum	ساقه	Cichorium intybus	K36
03/52		MG655164	99%	Fusarium avenaceum	برگ	Cichorium intybus	K37
08/90		MH258976	99%	Stephanonectria keithii	ساقه	Cichorium intybus	Kc01
58/97		MG655175	99%	Penicillium canescens	برگ	Cichorium intybus	K101

 

 

بحث

تمام گونه­های قارچی گزارش شده در این بررسی برای اولین بار به عنوان اندوفیت از گیاهان دارویی مطالعه شده از تیره آفتابگردان گزارش گردیدند. نتایج این بررسی به وضوح نشان می­دهد که جدایه­های قارچ­های اندوفیت برخی گیاهان داوریی که در این تحقیق مورد مطالعه قرار گرفته­اند، از نظر خاصیت آنتی­اکسیدانی، در گروه­های مختلف آماری قرار می‌گیرند و قدرت آنها با آنتی اکسیدان‌های استاندارد قابل مقایسه بوده و می­توانند به عنوان منابع میکروبی، که به مراتب تولید آنها در آزمایشگاه راحت تر از گیاهان بوده و موجبات تخریب محیط زیست را به واسطه برداشت بی رویه گیاهان دارویی رخ می­دهد نمی­شوند، برای تولید آنتی اکسیدان­ها مورد استفاده قرار گیرند.

تصور می­شود که اندوفیت­ها و گیاهان میزبان آنها به‌صورت همزمان تکامل یافته باشند، قضاوت در رابطه با ین موضوع  بر اساس این واقعیت است که گونه‌های اندوفیتی نزدیک به هم از خانواده­های گیاهی یکسان جداسازی گردیده­اند (Aly et al., 2011). بنابراین این فرضیه را که اندوفیت­ها خاصیت آنتی‌اکسیدانی را از گیاه میزبانشان به ارث برده­اند، می­توان مطرح کرد. بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی عصاره متانولی گیاه بومادران نشان داده است که خاصیت آنتی‌اکسیدانی این گیاه حدود 90 درصد بوده است (Georgieva et al., 2015)، در صورتی که در این بررسی قارچ T. versicolor از رده بازیدیومیکوتا که از گیاه بوماردان زردfilipendulina  A.جداسازی گردیده است، بالاترین خاصیت آنتی‌اکسیدانی را حتی نسبت به گیاه میزبانش از خود نشان داد. ابراهیم­زاده و همکاران نشان دادند که فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاهان به حضور ترکیبات فنلی در آنها مرتبط می­باشد (Ebrahimzadeh et al., 2015). ولیخا و همکاران بیان کردند که روند استخراج ترکیبات فنلی فاکتوری مهم در تعیین ویژگیهای آنتی­اکسیدانی عصاره است. دما، حلال، زمان عصاره­گیری، قدرت استخراج و روش استخراج تأثیر بارزی در محتویات عصاره خواهد گذاشت (Valikha et al., 2008). چنانچه، تفاوت موجود بین خاصیت آنتی‌اکسیدانی قارچ اندوفیت و گیاه میزبانش در این بررسی ممکن است مرتبط با تفاوت در روند استخراج ترکیبات باشد. تمام گونه­های اندوفیت جنس Cladosporium که در این بررسی از میزبانهای متفاوت جداسازی شده بودند، دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی بالا بودند و بالاترین میزان آن حدود 98 درصد و مربوط به گونه Cladosporium cladosporioides جداسازی شده از بابونه و سپس گونه Cladosporium ramotenellumبا میزان حدود 96 درصد، بود. مطالعه (Mirzaie et al., 2010) نشان داده شده است که خاصیت آنتی‌اکسیدانی گیاه بابونه بیشتر از بومادران است. که نتایج حاصل از خاصیت آنتی‌اکسیدانی قارچ­های اندوفیت جداشده از آنها در این تحقیق نیز این موضوع را تایید می­کند. مطالعه انجام شده در رابطه با قارچ­های اندوفیت گیاهان دارویی، خاصیت آنتی‌اکسیدانی گونه  C.  cladosporioides حدود 80 درصد گزارش گردیده است. (Hulikere et al., 2016) خاصیت ظرفیت کاهشی در عصاره قارچ­ها به‌دلیل قابلیت انتقال هیدروژن آنها می­باشد که مولکول‌های مربوطه را با پذیرش یون‌های هیدروژنی از عصاره‌ها و پایان دادن به زنجیره‌های رادیکال تثبیت می­کند. بنابراین، خاصیت ظرفیت کاهشی می­تواند به‌عنوان یک شاخص قابل توجه از پتانسیل آنتی‌اکسیدانی یک ترکیب بیان شود. نتابج برخی پژوهش­ها نشان داده است که قارچ S. commune در مقایسه با سایر قارچ‌های ماکروبازیدیومیست خاصیت آنتی‌اکسیدانی بالاتری دارد که با نتایج حاصل از این بررسی مطابقت دارد (Arbaayah and Umi, 2013). بازیدیومیست­ها گروه مهمی از قارچ‌ها هستند که برخی از آنها ارزش خوراکی داشته و جهت استفـــاده به­صورت غذا کشت می­گردــند. همچنیــن بازیدیـومیست­ها به خاطر تولید انواع مواد ویژه از لحاظ طعم، عطر، رنگ و خصوصیـــات سمی مورد توجه می­باشند و در علوم پزشکی، کشاورزی و صنعت مورد استفاده قرار گرفته­اند (Mirfat et al., 2010). قارچ بازیدیومیست
T. versicolor دارای بیشترین خاصیت انتی اکسیدانی به میزان حدود 98 درصد بود که در مقایسه با مطالعه ای که توسط (Jhan et al., 2016) انجام گرفته و میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی این قارچ را حدود 90 درصدگزارش کرده، بیشتر است و این موضوع نشان دهنده این است که احتمالا همزیستی بین این قارچ و گیاه دارویی بومادران موجب افزایش در فعالیت آنتی‌اکسیدانی این قارچ گردیده است. از سوی دیگر قارچ بازیدیومیست S. commune نیز میزان خاصیت انتی­اکسیدانی حدود 97 درصد از خود نشان داد که در مطالعه محققان دیگر (Mirfat et al., 2010) میزان
آن حدود 83 درصد گزارش گردیده است. اگرچه این تفاوت می­تواند به منطقه جمع‌آوری گیاه و شرایط اکولوژیک آنها نسبت داده شود.  امروزه محققین، علاقه زیادی به مطالعه اندوفیت­های گیاهان دارویی و استخراج آنتی­اکسیدان­های طبیعی از آنها، برای کاربرد آنها به‌عنوان جانشین آنتی­اکسیدان­های مصنوعی دارند. آنتی­اکسیدان­های طبیعی سالم تر هستند؛ فواید بیشتری دارند و با توجه به زمان تولید کوتاه مدت و نرخ رشد بالای میکروب‌ها و عدم نیاز به تخریب اکوسیستم نسبت به حفاظت از ذخایر گیاهان دارویی می­تواند اندوفیت‌ها را به انتخاب بسیار مناسبی برای تولید مواد آنتی‌اکسیدانی تبدیل کند (Srinivasan et al., 2010; Arbaayah and Umi, 2013).

 

نتیجه‌گیری نهایی

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که قارچ‌های اندوفیت بازیدیومیست با خاصیت آنتی‌اکسیدانی  بالا جزء قارچ‌های دارویی ارزشمند مطرح بوده و می‌توانند به‌عنوان منابع آنتی‌اکسیدانی بالقوه در آینده نزدیک در صنایع دارویی مورد توجه قرار گیرند.

 

 

Reference

1. Aly, A.H., Debbab, A. and Chaidir, C. 2011. Fungal endophytes: Unique plant inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology, 90(6):1829-45.
2. Arbaayah, H.H. and Umi K.Y. 2013. Antioxidant properties in the oyster mushrooms (Pleurotus spp.) and split gill mushroom (Schizophyllum commune) ethanolic extracts. Mycosphere, 4 (4): 661-673.
3. Arona, M.B., Cano, A. and Acosta, M. 2001. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity. Food Chemistry, 73: 239-244.
4. Barros, L., Ferreira, M.J., Queirós, B., Ferreira, C.F.R. and Baptista, P. 2007. Total phenols, ascorbic acid, β-carotene and lycopene in Portuguese wild edible mushrooms and their antioxidant activities. Food Chemistry, 103: 413-419.
5. Barnett, H.L. and Hunter, B.B. 1999. Illustrated genera of imperfect fungi. APS press, 217pp.
6. D'Amico, M., Frisullo S. and Cirulli M. 2008. Endophytic fungi occurring in fennel, lettuce, chicory, and celery−commercial crops in southern Italy. Mycological Research, 112: 100-107.
7. Duan, X.J., Zhang, W.W., Li, X.M. and Wang, B.G. 2006. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry, 95: 37-43.
8. Ebrahimzadeh, M.A., Hosseinimehr, S.J., Hamidinia, A. and Jafari, M. 2008. Antioxidant, and free radical scavenging activity of Feijoa sallowiana fruits peel and leaves. Pharmacology, 1: 7-14.
9. Ellis, M.B. 1997. Dematiaceous Hyphomycetes. Commonw. Mycol. Inst. Kew, Surrey, England, 608pp.
10. Georgieva, L., Gadjalova, A., Mihaylova, D. and Pavlov, A. 2015. Achillea millefolium L. – phytochemical profile and in vitro antioxidant activity. International Food Research Journal, 22(4): 1347-1352.
11. Guo, L.D. 1999. Identification of endophytic fungi in Livistona chinesis (Palmae). Ph. D dissertation, Department of Ecology and Biodiversity, University of Hong Kong. 243pp.
12. Guo, B. 2000. Cytonic acids A & B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species. Journal of Natural Product, 63: 602-604.
13. Hatamzadeh, M., Rahnama, K., Nasrollahnejad, S., Fotowhifar, K., Hemmati, Kh. and White, J. 2017. Isolation and Identification of some endophytic fungi of four species of Camomille in Golestan province. 3rd Iranian Mycological Congress, Kurdistan, Sanandaj, Iran.
14. Hatamzadeh, M., Rahnama, K., Nasrollahnejad, S., Fotowhifar, K., Hemmati, Kh. and White. J. 2017. Effect of plant tissue and culture media on the isolation rate of endophytic fungi of some medicinal plants. 3rd Iranian Mycological Congress, Kurdistan, Sanandaj, Iran.
15. Hulikere, M.M., Joshi, G.C.D., Jagadeesh J. and T. Nivya. 2016. Antiangiogenic, wound healing and antioxidant activity of Cladosporium cladosporioides (Endophytic Fungus) isolated from seaweed (Sargassum wightii). Mycology, 20(40): 22-29.
16. Jagadish, L.K., Krishnan, V.V., Shenbhagaraman, R. and Kaviyarasan, V. 2009. Comparitive study on the antioxidant, anticancer and antimicrobial property of Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach before and after boiling. African Journal of Biotechnology, 8(4): 654-661.
17. Jam Ashkezari, S., Fotouhifar, K. and Farzaneh, M. 2014. Identification of some endophytic fungi of common yew trees (Taxus baccata) in Iran. Rostaniha, 15(1): 50-64.
18. Jhan, M.H., Yeh, C.H., Tsai, C.C., Kao, C.T., Chang, C.K. and Hsieh, C.W. 2016. Enhancing the antioxidant ability of Trametes versicolor polysaccharopeptides by an enzymatic hydrolysis process. Molecules. 21: 215-220.
19. Leong, L.P. and Shui, G. 2002. An investigation of antioxidant capacity of fruits in Singapore markets. Food Chemistry, 76: 69-75.
20. Jagadish, L.K., Krishnan, V.V., Shenbhagaraman, R. and Kaviyarasan, V. 2009. Comparative study on the antioxidant, anticancer and antimicrobial property of Agaricus bisporus imbach before and after boiling. African Journal of Biotechnology, 8: 654-661. Liu, X., Mingsheng D., Xiaohong Ch., Mei J., Xin L.V. and Guijun, Y. 2007. Antioxidant activity and phenolics of an endophytic Xylaria sp. from Ginkgo biloba. Food Chemistry, 105: 548-554.
21. Masoumi, S., Mirzai, S., Kalvandi. R. and Zafari D. 2012. Identification of fungal endophytes of thyme in Hamedan province. 20th Iranian Plant Protection Congress, Shiraz, Iran, 127.
22. Mirfat, A.H.S., Noorlidah A. and Vikineswary, S. 2010. Scavenging activity of Schizophyllum commune extracts and its correlation to total phenolic content. Journal of tropical agriculture and food science, 38(2): 231-238.
23. Mirzaei, A., Akbartabartori, M., Sadeghi, H. and Sharifi B. 2010. The evaluation of total phenol and antioxidant activity yarrow, wormwood and chamomile. Journal of Armaghane Danesh. 15: 243-252.
24. Natarajan, K. and Kolandavelu K. 1998. Resupinate Aphyllophorales of Tamil Nadu, India. Centre for advanced study in Botany, University of Madras, 133pp.
25. Raja, H.A., Miller, A.N., Pearce, C.J. and Oberlies, N.H. 2017.  Fungal Identification Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community. Journal of Natural Product, 80(3): 756-770.
26. Ryvarden, L. and Johansen, I. 1980. A preliminary polypore flora of East Africa. Fungiflora, Oslo, 636pp.
27. Sánchez Márquez, S., Bills G.F., Domínguez Acuña, L. and Zabalgogeazcoa, I. 2010. Endophytic mycobiota of leaves and roots of the grass Holcus lanatus. Fungal Diversity 41: 115-123.
28. Shahiri Tabarestani, M., Rahnam, K., Nasrollanejad. S. and Fatemi. M.H. 2016. Identification of Volatile Organic Compounds from Trichoderma virens (6011) by GC-MS and Separation of a Bioactive Compound via Nanotechnology. International Journal of Engineering, 29 (10): 1347-1353.
29. Shamouna, S.F. and Sieber, T.N. 2000. Colonisation of leaves and twigs of Rubus parviflorus and R. spectabilis by endophytic fungi in a reforestation site in British Columbia. Mycological Research, 104: 841-845.
30. Shimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K., and Nakamura, T. 1992. Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. Journal of Agricuture and Food Chemistry, 40 (6): 945-948.
31. Silva, F., Ferreres, J.O. and Malva, A.C.P. 2005. Phytochemical and antioxidant characterization of Hypericum perforatum alcoholic extracts. Food Chemistry, 90 (2): 157-167.
32. Srinivasan, K., Jagadish, L.K., Shenbhagaraman, R. and Muthumary, J.  2010. Antioxidant activity of endophytic fungus phyllosticta sp. isolated from guazuma tomentosa. Journal of Phytology, 2(6): 37-41.
33. Strobel, G., Yang, X., Sears, J., Kramer, R., Sidhu, R. S. and Hess, W. M. 1996. Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallichiana.Microbiology, 142: 435-440.
34. Taga, M.S., Miller, E.E. and Pratt, D.E. 1984. Chia seeds as a source of natural lipid antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society, 61: 928-993.
35. Tan, R.X., and Zou, W.X. 2001. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Natural Product Reports, 18: 448-459.
36. Vilkha, K., Mawson, R., Simons, L. and Bates, D. 2008. Application and opportunities for untrasound assisted extraction in food industry; a review. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 9: 161-169.

 

 

 

 

 

 

 

 

Eco-phytochemical Journal of Medicinal Plants, 8th Year, Volume One, Spring 2020

 

 

 

Evaluation of antioxidant activity of endophytic fungi isolated from some native medicinal species of Golestan province

 

Hatamzadeh, S.¹, Rahnama, K.², Nasrollahnejad, S.², Berdi Fotowhifar, Kh.³, Hemmati, Kh.⁴, White, J.⁵

¹Ph.D of plant pathology,Department of Plant Protection, Faculty of plant production, Gorgan University of Agricultural sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran

²Associate professor, Department of Plant Protection, Faculty of plant production, Gorgan University of Agricultural sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran

³Associate professor ,Department of Plant Protection, Faculty of Agricultural Science and Engineering, college of Agriculture and Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran

⁴Associate professor Department of Horticulture, Faculty of plant production, Gorgan University of Agricultural sciences and Natural Resources, Gorgan, Iran

⁵Professor, Department of Plant Biology, Rutgers University, New Brunswick, New Jersey, U.S.A.

 

Received: 2019-1-22;       Accepted: 2019-5-21

 

Abstract   

Medicinal plants are a very rich source of antioxidant compounds. Endophytic fungi of medicinal plants, due to long-term coexistence with these plants produce plant secondary metabolites. Therefore, in this study, the antioxidant properties of endophytic fungi isolated from 7 medicinal plants of the Asteraceae family includeing Matricaria chamomilla, Anthemis triumfetii, Anthemis parthenium, Anthemis altissima var. Altissima, Achillea millefolium, Achillea filipendulina, Cichorium intybus was investigated. The samplings were done from healthy plants and free of any diseases from most areas of Golestan province during 2016 spring. After morphological and molecular identification of endophytic fungi, the antioxidant property of 37 species of endophytic fungi was evaluated by DPPH free radicals metod. Based on the results, a significant difference of 99% was observed between the antioxidant properties of endophytic fungi. The lowest (32.1% ) and highest (98.8%) antioxidant activity were related to the Stemphylium amaranthi and Trametes versicolor  fungi isolated from Anthemis triumfetii leaf and Achillea santolina stem tissues, respectively. In addition, the Schizophyllum commune with 98.8% antioxidant activity was placed in the same group with T. versicolor. The Cladioporium spp. such as Cladosporium cladosporioides and Cladosporium ramotenelum showed a high antioxidant activity of about 97%. Considering short-term production and the high growth rate of fungi, endophytes maybe a good choice for the production of antioxidant substances.

 

Keywords: Antioxidant activity, Asreraceae family, Endophytic fungi, Medicinal plants[2]

 

---

^*نویسنده مسئول: [e-mail]

*Corresponding author; [e-mail]

مراجع

1. Aly, A.H., Debbab, A. and Chaidir, C. 2011. Fungal endophytes: Unique plant inhabitants with great promises. Applied Microbiology and Biotechnology, 90(6):1829-45.
2. Arbaayah, H.H. and Umi K.Y. 2013. Antioxidant properties in the oyster mushrooms (Pleurotus spp.) and split gill mushroom (Schizophyllum commune) ethanolic extracts. Mycosphere, 4 (4): 661-673.
3. Arona, M.B., Cano, A. and Acosta, M. 2001. The hydrophilic and lipophilic contribution to total antioxidant activity. Food Chemistry, 73: 239-244.
4. Barros, L., Ferreira, M.J., Queirós, B., Ferreira, C.F.R. and Baptista, P. 2007. Total phenols, ascorbic acid, β-carotene and lycopene in Portuguese wild edible mushrooms and their antioxidant activities. Food Chemistry, 103: 413-419.
5. Barnett, H.L. and Hunter, B.B. 1999. Illustrated genera of imperfect fungi. APS press, 217pp.
6. D'Amico, M., Frisullo S. and Cirulli M. 2008. Endophytic fungi occurring in fennel, lettuce, chicory, and celery−commercial crops in southern Italy. Mycological Research, 112: 100-107.
7. Duan, X.J., Zhang, W.W., Li, X.M. and Wang, B.G. 2006. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry, 95: 37-43.
8. Ebrahimzadeh, M.A., Hosseinimehr, S.J., Hamidinia, A. and Jafari, M. 2008. Antioxidant, and free radical scavenging activity of Feijoa sallowiana fruits peel and leaves. Pharmacology, 1: 7-14.
9. Ellis, M.B. 1997. Dematiaceous Hyphomycetes. Commonw. Mycol. Inst. Kew, Surrey, England, 608pp.
10. Georgieva, L., Gadjalova, A., Mihaylova, D. and Pavlov, A. 2015. Achillea millefolium L. – phytochemical profile and in vitro antioxidant activity. International Food Research Journal, 22(4): 1347-1352.
11. Guo, L.D. 1999. Identification of endophytic fungi in Livistona chinesis (Palmae). Ph. D dissertation, Department of Ecology and Biodiversity, University of Hong Kong. 243pp.
12. Guo, B. 2000. Cytonic acids A & B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species. Journal of Natural Product, 63: 602-604.
13. Hatamzadeh, M., Rahnama, K., Nasrollahnejad, S., Fotowhifar, K., Hemmati, Kh. and White, J. 2017. Isolation and Identification of some endophytic fungi of four species of Camomille in Golestan province. 3rd Iranian Mycological Congress, Kurdistan, Sanandaj, Iran.
14. Hatamzadeh, M., Rahnama, K., Nasrollahnejad, S., Fotowhifar, K., Hemmati, Kh. and White. J. 2017. Effect of plant tissue and culture media on the isolation rate of endophytic fungi of some medicinal plants. 3rd Iranian Mycological Congress, Kurdistan, Sanandaj, Iran.
15. Hulikere, M.M., Joshi, G.C.D., Jagadeesh J. and T. Nivya. 2016. Antiangiogenic, wound healing and antioxidant activity of Cladosporium cladosporioides (Endophytic Fungus) isolated from seaweed (Sargassum wightii). Mycology, 20(40): 22-29.
16. Jagadish, L.K., Krishnan, V.V., Shenbhagaraman, R. and Kaviyarasan, V. 2009. Comparitive study on the antioxidant, anticancer and antimicrobial property of Agaricus bisporus (J.E. Lange) Imbach before and after boiling. African Journal of Biotechnology, 8(4): 654-661.
17. Jam Ashkezari, S., Fotouhifar, K. and Farzaneh, M. 2014. Identification of some endophytic fungi of common yew trees (Taxus baccata) in Iran. Rostaniha, 15(1): 50-64.
18. Jhan, M.H., Yeh, C.H., Tsai, C.C., Kao, C.T., Chang, C.K. and Hsieh, C.W. 2016. Enhancing the antioxidant ability of Trametes versicolor polysaccharopeptides by an enzymatic hydrolysis process. Molecules. 21: 215-220.
19. Leong, L.P. and Shui, G. 2002. An investigation of antioxidant capacity of fruits in Singapore markets. Food Chemistry, 76: 69-75.
20. Jagadish, L.K., Krishnan, V.V., Shenbhagaraman, R. and Kaviyarasan, V. 2009. Comparative study on the antioxidant, anticancer and antimicrobial property of Agaricus bisporus imbach before and after boiling. African Journal of Biotechnology, 8: 654-661. Liu, X., Mingsheng D., Xiaohong Ch., Mei J., Xin L.V. and Guijun, Y. 2007. Antioxidant activity and phenolics of an endophytic Xylaria sp. from Ginkgo biloba. Food Chemistry, 105: 548-554.
21. Masoumi, S., Mirzai, S., Kalvandi. R. and Zafari D. 2012. Identification of fungal endophytes of thyme in Hamedan province. 20th Iranian Plant Protection Congress, Shiraz, Iran, 127.
22. Mirfat, A.H.S., Noorlidah A. and Vikineswary, S. 2010. Scavenging activity of Schizophyllum commune extracts and its correlation to total phenolic content. Journal of tropical agriculture and food science, 38(2): 231-238.
23. Mirzaei, A., Akbartabartori, M., Sadeghi, H. and Sharifi B. 2010. The evaluation of total phenol and antioxidant activity yarrow, wormwood and chamomile. Journal of Armaghane Danesh. 15: 243-252.
24. Natarajan, K. and Kolandavelu K. 1998. Resupinate Aphyllophorales of Tamil Nadu, India. Centre for advanced study in Botany, University of Madras, 133pp.
25. Raja, H.A., Miller, A.N., Pearce, C.J. and Oberlies, N.H. 2017.  Fungal Identification Using Molecular Tools: A Primer for the Natural Products Research Community. Journal of Natural Product, 80(3): 756-770.
26. Ryvarden, L. and Johansen, I. 1980. A preliminary polypore flora of East Africa. Fungiflora, Oslo, 636pp.
27. Sánchez Márquez, S., Bills G.F., Domínguez Acuña, L. and Zabalgogeazcoa, I. 2010. Endophytic mycobiota of leaves and roots of the grass Holcus lanatus. Fungal Diversity 41: 115-123.
28. Shahiri Tabarestani, M., Rahnam, K., Nasrollanejad. S. and Fatemi. M.H. 2016. Identification of Volatile Organic Compounds from Trichoderma virens (6011) by GC-MS and Separation of a Bioactive Compound via Nanotechnology. International Journal of Engineering, 29 (10): 1347-1353.
29. Shamouna, S.F. and Sieber, T.N. 2000. Colonisation of leaves and twigs of Rubus parviflorus and R. spectabilis by endophytic fungi in a reforestation site in British Columbia. Mycological Research, 104: 841-845.
30. Shimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K., and Nakamura, T. 1992. Antioxidative properties of xanthan on the autoxidation of soybean oil in cyclodextrin emulsion. Journal of Agricuture and Food Chemistry, 40 (6): 945-948.
31. Silva, F., Ferreres, J.O. and Malva, A.C.P. 2005. Phytochemical and antioxidant characterization of Hypericum perforatum alcoholic extracts. Food Chemistry, 90 (2): 157-167.
32. Srinivasan, K., Jagadish, L.K., Shenbhagaraman, R. and Muthumary, J.  2010. Antioxidant activity of endophytic fungus phyllosticta sp. isolated from guazuma tomentosa. Journal of Phytology, 2(6): 37-41.
33. Strobel, G., Yang, X., Sears, J., Kramer, R., Sidhu, R. S. and Hess, W. M. 1996. Taxol from Pestalotiopsis microspora, an endophytic fungus of Taxus wallichiana.Microbiology, 142: 435-440.
34. Taga, M.S., Miller, E.E. and Pratt, D.E. 1984. Chia seeds as a source of natural lipid antioxidants. Journal of the American Oil Chemists Society, 61: 928-993.
35. Tan, R.X., and Zou, W.X. 2001. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Natural Product Reports, 18: 448-459.
36. Vilkha, K., Mawson, R., Simons, L. and Bates, D. 2008. Application and opportunities for untrasound assisted extraction in food industry; a review. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 9: 161-169.