مقایسه ویژگی های سلول های بنیادی مزانشیم انسانی مشتق شده از مغز استخوان و بافت چربی و پرده جنینی

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

مقاله 4، دوره 13، شماره 3 - شماره پیاپی 50، تیر 1399، صفحه 41-56   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

سپیده کاظمی¹؛ کاظم پریور^{* 2}؛ نسیم حیاتی رودباری³؛ پریچهر یغمایی⁴؛ بهنام صادقی

¹دانشجوی دکترای زیست شناسی علوم جانوری گرایش سلولی - تکوینی، گروه زیست شناسی جانوری، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات تهران، ایران.

²واحد علوم وتحقیقات دانشگاه آزاد

³دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات

⁴علوم و تحقیقات

چکیده

زمینه و هدف: درمان با سلول های بنیادی، رویکردی نوین را در ترمیم و بازسازی اندام ها و بافت ها پدید آورده است. سلول­های بنیادی مزانشیمی(MSCs)، کاندیدهای نویدبخشی برای سلول درمانی محسوب می­شوند. گرچه،  MSCهای مشتق از مغز استخوان قادرند به چندین رده سلولی تمایز یابند، اما مغز استخوان به دلیل فرآیند جداسازی مشکل سلول ها و بازدهی پایین، منبع سلولی مناسبی نیست. هدف از این مطالعه، بررسی مقایسه ای توان ترمیمی MSCهای انسانی حاصل از 3 منبع شامل بافت مغز استخوان و چربی و بافت دسیدوآی پرده جنینی در شرایط in vitro می باشد.
روش کار: سلول های بنیادی مزانشیمی از 3 بافت مغز استخوان، بافت چربی و سلول بافت دسیدوآی پرده جنینی جدا شده، و تا 10 پاساژ سلولی کشت داده شدند و برای فنوتیپ با ایمونوفلورسانس و فلوسیتومتری به منظورتعیین بیان مارکرهای سطحی اختصاصی سلول مزانشیمی( CD11b ، CD34، CD44، CD45، CD73، CD90 و CD105 (، توانایی تمایز به سلول استخوان، چربی و غضروف، رشد سلول ها با محاسبه زمان دو برابر شدن و سطح دو برابر شدن جمعیت لحاظ کیفی وکمی مورد ارزیابی قرار گرفتند.
یافته­ها: علیرغم شباهت ها از نظر بیان آنتی ژن سطحی و توانایی خود نوزایی، سلول های بنیادی مزانشیمی منابع مختلف، تفاوت­های معنی داری را از نظر تکثیر و ظرفیت های تمایز به استخوان چربی و استخوان نشان دادند. DSCs بالاترین ظرفیت تکثیر سلولی را نشان داد و به نظر می رسد که این ویژگی را تا پاساژ 10حفظ می­کند، در حالی که BM-MSCs دارای توانایی تمایز قابل توجهی برای تمایز به استخوان و غضروف، AT-MSC ها بیشترین قدرت تمایز چربی را در بین سایرین نشان دادند. با این توضیحات به نظر می­رسد DSC ها با توجه ویژگی های ذکر شده می­تواند جایگزین مناسبی برای استفاده در سلول درمانی باشند.
نتیجه گیری: از آن­جایی کهDSC ها وAT-MSC ها نیز ویژگی های سلول های مزانشیم را به خوبی BM-MSC نشان می دهند این سلول ها می توانند جایگزین مناسبی برای سلول درمانی باشند.

کلیدواژه‌ها

بافت چربی؛ مغز استخوان؛ سلول استرومای دسیدوآ؛ سلول های بنیادی مزانشیمی؛ روش های ترمیمی

اصل مقاله

 مقدمه

 

در جوامع امروزی، بیمار ی های مختلفی شیوع پیداکرده است و به علت وجود دشوار ی های پیوند و عوارض استفاده از داروهای شیمیایی، پژوهشگران به دنبال راهی بهتر برای درمان این بیماری ها، به سلول درمانی به عنوان بهترین روش درمان روی آورده اند. سلول درمانی، درمان بر اساس سلول های بنیادی است. سلول بنیادی به سلولی گفته می شود که توانایی خودنوسازی و تمایز به سلول های دیگر را داشته باشد(16). سلول های بنیادی به سلول های بنیادی جنینی و سلول های بنیادی بالغین طبقه بندی می شوند. سلول های بنیادی جنینی، سلول های بالقوه چند ظرفیتی (totipotential )بوده واغلب از توده داخل سلولی (mass cell inner )جنین در مرحله بلاستوسیست به دست می آید. این سلول ها دارای ویژگی های خاصی می باشند که از آن جمله می توان به قابلیت تمایز به انواع رده های سلولی ونامیرایی آن ها اشاره نمود. استفاده وکاربرد سلول های بنیادی جنینی از سال 1981 آغاز شده است. برای مطالعه in vitro سلول های جنینی به دو روش عمل می کنند. 1 (کشت سلول های بنیادی جنینی بر سطح سلول های فیبروبلاست جنینی موش که قبلاً توسط اشعه γ  یا میتومایسی ، فعالیت میتوزی آن متوقف شده است. 2) کشت سلول های بنیادی جنینی در حضور LIF Leukemia inhibitory factor ) )که به صورت نوترکیب فراهم گردیده است. از نظر مورفولوژی، کلونی های فشرده ای ازسلول های کوچک با سیتوپلاسم اندک وهستک واضح می باشند. این سلول ها درطی تکثیرهای پی درپی، کاریوتایپ نرمال 46XX,46XY خود را حفظ می کنند. این سلول ها درعین حال که قابلیت حفظ حالت تمایز نیافته رادر شرایط in vitro دارا می باشند، می توانند به گستره وسیعی از سلول های بالغ، تحت شرایط خاص متمایز گردند. این سلول ها درطی 18 تا 12 ساعت تقسیم می شوند. مدت زمان تقسیم دراین سلول ها به تطبیق آن­ها با محیط پیرامون خود در in vitro بستگی دارد(4). از مهم­ترین سلول های بنیادی بزرگسالان که امروزه توجه اکثر محققین را به خود جلب کرده است، می توان به سلول های بنیادی مزانشیم اشاره نمود. سلول های بنیادی مزانشیم در ترمیم بافت هایی با منشاء مزانشیمی مثل استخوان، غضروف، ماهیچه، تاندون و چربی شرکت می کنند و البته این سلول ها به عنوان سلول های حمایت کننده برای سلول­های هماتوپویتیک در مغز استخوان نیز هستند. این سلول ها برای اولین بار توسط فریدن اشتاین (Friedenstei) و پتراکووا( ( Petrakova از مغز استخوان رت به دست آمدند اخیراً سلول های مزانشیم را از منابع فرعی دیگری هم مثل بافت های چربی بافت های جفت، خون محیطی، بافت های پیوندی و بند ناف و ماهیچه های اسکلتی جدا کرده اند(6). سلول های بنیادی مزانشیم انسانی در حقیقت سلول هایی هستند:که بر اساس تعریف انجمن بین المللی سلول درمانی International Society for Cellular Therapy(ISCT)دارای سه ویژگی زیر باشند:

-         در شرایط کشت معمولی در ظروف کشت پلاستیکی به کف ظرف بچسبند؛

-         شاخص های سطحی CD105,CD73وCD90 را بیان کنند و نسبت به بیان شاخص های هماتوپوئتیک بالاخص CD34,CD45 و سایر شاخص ها از قبیل CD19،CD79 ،CD11b ، CD14 و HLA-DR منفی باشند؛

-         می بایست توانایی تمایز به سلول های چربی، غضروف واستخوان را در شرایط آزمایشگاهی داشته باشند(16).

هرچند که مغز استخوان اولین و شناخته شده ترین منبع سلول های بنیادی مزانشیمی می باشد، اما روش جمع آوری نمونه از مغز استخوان بسیار تهاجمی است. هم چنین تعداد، توان تکثیرو تمایز این سلول ها با افزایش سن کاهش می یابد. بنابراین دسترسی به منابع جایگزین سلول های بنیادی مزانشیمی جهت مطالعات پایه ای و بالینی از اهمیت ویژه ای برخوردار است(16). یک منبع سهل الوصول و ارزشمند بافت چربی است. این نوع بافت حاوی شمار زیادی از سلول های بنیادی مزانشیمی است و به دست آوردن مقادیر زیاد بافت به راحتی ممکن است. مطالعات نشان داده است که سلول های مزانشیمی جدا شده از بافت چربی از نظر ریخت شناسی و حتی بیان نشانگرهای سطحی شبیه همان سلول های جدا شده از مغز استخوان هستند. سلول های مزانشیمی جدا شده از بافت چربی از نظر رفتار سلولی در محیط کشت و قدرت تمایزی به سلول های استخوان، غضروف و چربی تفاوتی با سلول های جدا شده از مغز استخوان نشان نداده اند(5). بافت چربی می تواند با استفاده از روش های مختلفی مانند لیپوساکشن و یا برش بافتی به دست آید که این بافت را نیز با خطراتی مواجه می کند:

-         ورم ناشی از ایجاد حفره در بدن که معمولاً این ورم ماندگار است.

-         سوختگی که به خاطر حرارت بالایی که بدن داده می شود تا چربی ها ذوب شوند و سپس تخلیه شوند.

-         زخم های طولانی مدت که در اثر عمل لیپوساکشن ایجاد می شود.

-         صدمه های مکانیکی به ناحیه ایی که عمل شده است مانند شکم، ران، باسن، سینه.

-         صدمه به عروق لنفاتیک

-         ایجاد فرو رفتگی در بافتی که چربی آن برداشته شده است(6).

پرده جنینی یک منبع بسیار جوان از سلول های بنیادی مزانشیمی است که به دور از مشکلات اخلاقی، خطر ایجاد واکنش های ایمنی و هم چنین سرطانی شدن، مزایای هر دو منبع سلول های بنیادی جنینی و بزرگسال را دارا می­باشد. در این مطالعه سعی بر آن است که هر یک از سلول­های مزانشیمی مشتق شده از بافت مغز استخوان، بافت چربی و پرده جنینی با منشائ مادری را به لحاظ عمکرد و توانایی آن ها در استخوان سازی، غضروف سازی و چربی سازی، بیان مارکرهای سطح سلولی ویژه سلول های مزانشیمی، توانایی تکثیر و سرعت رشد این سلول ها با یکدیگر مقایسه شود.

مواد و روش ها:

تهیه، جداسازی و کشت سلول های مزانشیمی مغز استخوان:

سلول ها:

سلول های مورد استفاده در این پژوهش قبلاً در انستیتو پاستور ایران جداسازی و شناسایی شده و در نیتروژن مایع 196 -درجه نگهداری شده بودند.

ذوب و کشت مجدد سلول ها:

 پس از آماده کردن بن ماری 37 درجه سانتی گراد، سلول ها به سرعت از تانک ازت به داخل بن ماری منتقل شدند. سپس ویالها به زیر هود منتقل شده با کمک پیپت استریل میزان 4 میلی لیتر از محیط کشت با DMEM (Dulbecco's modified eagle medium)  درصد گلوکز پایین،10درصد سرم جنین گاوی، پنیسیلین 100 واحد در سی سی (USA,Sigma (و 100 میکروگرم در سی سی استروپتومایسین (USA,Sigma (با دمای 37 درجه سانتی گراد به درون فالکون های استریل ریخته شد. محتویات ویال ها داخل فالکون ها ریخته و سپس سانتریفوژ شدند تا اثرات سمی موجود در محیط انجماد برداشته شود. در نهایت پلیت های سلولی حاصل از هر فالکون با 1 الی 2 سی سی محیط کشت سوسپانسیون گردیده و مجدداً داخل فلاسک های کشت سلول، کشت گردیدند. سپس فلاسک ها درون انکوباتور با شرایط 37 درجه سانتی گراد و CO2 5 درصد قرار داده تا رشد کنند. پس از 12-6 ساعت محیط رویی سلول ها که حاوی سلول های نچسبیده بود دور ریخته و محیط جدید اضافه و به منظور تکثیر سلولی، ادامه کشت در همان شرایط انجام شد. هر سه روز یک بار محیط سلول ها تعویض گردیدند. پس از چند ساعت بعد از کشت اولیه، اولین سلول های شبه فیبروبلاستی مشاهده و بعد از 8-6 روز80-70درصد سطح ظرف کشت را پوشاندند. سپس سلول ها از پاساژ سوم با کمک EDTA 02/0درصد در Trypsin 25% درصد جدا و با تراکم 5000 سلول در سانتی متر مربع در فلاسک های کشت سلولی کشت داده شدند. به این ترتیب از پاساژ 3 به منظور مراحل بعدی آزمایش استفاده شد.(7)

تهیه، جداسازی و کشت سلول های مزانشیمی مشتق از بافت چربی

در این مطالعه آزمایشگاهی (in vitro)، برای جداسازی سلول‌های بنیادی مزانشیمی جدا شده از چربی، مقدار 5 گرم بافت چربی شکمی با اخذ رضایت‌نامه کتبی از بیمارانی که جهت انجام لیپوساکشن مراجعه کرده بودند استفاده شد. نمونه چربی اخذ شده در محلول فسفات بافر سالین  (Gibco, Life Technologies, USA) حاوی آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین-استرپتومایسین (Gibco, Life Technologies, USA) 1% تحت شرایط استریل از بیمارستان به آزمایشگاه منتقل و پس از چندین بار شستشو با فسفات بافر سالین و سرم فیزیولوژی به قطعات کوچک تبدیل شد. سپس سلول‌های بنیادی مزانشیمی به وسیله هضم با آنزیم کلاژنازI 2/0 % از بافت چربی استخراج گردید. به این صورت که ابتدا به ازای هر یک گرم چربی 5/1 میلی‌گرم آنزیم کلاژناز I به آن اضافه و به مدت 45 تا 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس به مدت 10 دقیقه با سرعت 1800 دور در دقیقه تحت سانتریفیوژ قرار گرفته و در نهایت رسوب سلولی در محیط کشت Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, USA) حاوی آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین/استرپتومایسین 1% و سرم جنین گوساله (Gibco, Life Technologies, USA) 10% به فلاسک مخصوص کشت سلول منتقل و در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد حاوی دی‌اکسید کربن 5% و رطوبت 95% قرار داده شدند. پس از گذشت 24 ساعت، سلول‌های معلق با تعویض محیط از فلاسک حذف شدند. محیط کشت سلول‌ها هر 3 روز یک بار تعویض گردید. سلول‌ها پس از تریپسینه شدن به مرحله پاساژ سوم انتقال یافتند و جهت استفاده آماده شدند(1).

تهیه، جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی مشتق از بافت پرده جنینی:

نمونه پرده جنینی بعد از عمل سزارین و جداسازی از جنینی و پس از دریافت رضایت کامل مادر، به آزمایشگاه کشت سلول منتقل گردید. برای شستشو پرده آمنیون درون بشـر حــاوی آنتـی‌بیوتیک هـــا(پنی سیلیـن و استـرپتومــایسین) و PBS قرار داده خواهد شد. پرده آمنیون(پرده آمنیون شفاف وبدون عروق است) از کوریون جدا و و با قیچی استریل به قطعه های کوچک تقسیم و سپس قطعه ها درون فلاسک چیده خواهد شدند. به فلاسک حاوی قطعات بافت پرده جنینی انسان محیط کشت Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, USA)  حاوی آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین/استرپتومایسین 1% و سرم جنین گوساله (Gibco, Life Technologies, USA) 10% به فلاسک مخصوص کشت سلول منتقل و در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد حاوی دی‌اکسید کربن 5% و رطوبت 95% قرار داده شدند. پس از گذشت 24 ساعت، سلول‌های معلق با تعویض محیط از فلاسک حذف شدند. محیط کشت سلول‌ها هر 3 روز یک بار تعویض گردید. سلول‌ها پس از تریپسینه شدن به مرحله پاساژ سوم انتقال یافتند و جهت استفاده آماده شدند(8).

تعیین درصد زنده بودن سلول ها(test Viability

با استفاده از آنزیم تریپسین سلول های مزانشیم را کف فلاسک جدا و حدود 50 میکرولیتـر از سوسپانسـیون سـلولی به دست آمده را بـا 50 میکرولیتر از رنگ تریپان بلو 4/0 %مخلوط کرده پس از 30 ثانیه، 10 میکرولیتر از این مخلوط را برداشته و با استفاده از لام نئوبار در خانه ­های مربوط به شـمارش سلـول هـای سـفید شمارش شدند. رنگ تریپان بلو در سـلول هـا ی مـرده نفـوذ کرده و آن­ها را آبی رنگ می کند اما وارد سـلول هـا ی زنـده نمی شود. به این ترتیب درصد سلول هـای زنـده بـه دست آمد(18).

بررسی مارکرهای سطح سلولی :

برای مشخص شدن MSCS جدا شده از بافت های مغز استخوان، چربی و پرده جنینی از فلوسایتومتری استفاده می شود. در این روش از 250000 سلول استفاده شد، فلاسک 75T که حاوی این سلول ها در پاساژ 3 بود را بعد از شستشو با PBS و تریپسینه کردن، سانتریفیوژ کرده و بعد از شمارش با 3-2 میلی لیتر محلول PBS سانتریفیوژ و سوسپانسیون رویی دور ریخته و با استفاده از 250 میکرولیتر PBS سلول ها هموژن گردید. از سوسپانسیون مذکور، مقدار 50 میکرولیتر و از هر یک از آنتی بادی­های مونوکلونال کونژوگه به رنـگ هـا ی فلورسـنت نیز مقدار 5 میکرولیتر به هر لوله افزوده خواهد شد. بـه مـوازات، سلول ها با آنتی بادی ایزوتایـپ کنتـرل نیز مجـاور شدند. سپس لوله ها به مدت 30 دقیقه در دمای یخچال انکوبه و سپس با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری آنالیز شدند(7). فلوسایتومتری بر اساس پراکنده سازی نور توسط سلول ­های مورد آزمایش و انتشار فلورسانس از آن ها استوار است. نشر فلورسانس با استفاده مستقیم از فلوروکرو م های متصل شونده به اجزای سلولی یا ترکیبی از رنگ فلورسنت با آنتی بادی های مونوکلونال حاصل می شود. این آنتی بادی های کونژوگه با فلورسانس می توانند مولکول های سطحی و یا ترکیبات داخلی سلول ها را ردیابی کرده و به آن ها متصل شوند و شناسایی انواع سلول های موجود در یک جمعیت سلولی متنوع را توسط فلوسایتومتری امکان پذیر می سازند ودر نهایت با توجه به جمعیتی از سلول ها که این مارکرها را بیان کرده اند نتایج را به صورت درصد نسب به کل جمعیت سلولی مورد آنالیز ارائه می دهد.

لیسـت آنتی بادی ها شـامل :

 CD73-PE ، CD90-FITC ، CD29-PE ، CD44-FITC IgG1- ، CD45-FITC ، CD11b-PE ، CD105-FITC PE-IgG1/FITC و  PE-CD34

بررسی توان تمایزی سلول ها

القا سلول های بنیادی مزانشیمی به استئوسیت در شیشه

بدین منظور از سلول های پاساژ 3 استفاده و با دانسیته 5000 سلول بر سانتی متر مربع سلول ها در ظروف 12 خانه ای کشت شدند. پس از مرحله confluency محیط سلول­ها با محیط تمایز به استئوسیت جایگزین شدند که این (Fetal bovine  1درصد0FBS ،DMEM شامل محیط فسفات- 2 اسید آسکوربیک– L 50 µg/ml حاوی serum) 10 ،(Sigma,USA) -7 (Sigma,USA) دگزامتازون M 10mM و بتا گلیسرول فسفات (USA,Sigma (بود. هر 3-2 روز یکبار محیط کشت تعویض شد و به مدت 21 روز سلول ها تحت تأثیر محیط القاکننده تمایز به استئوسیت قرار گرفتند. به عنوان گروه کنترل، محیط برخی از خانه ها با محیط معمولی با 1درصد DMEM گلوکز پایین، 10 درصد سرم جنین گاوی و آنتیبیوتیک جایگزین شد(3).

 ارزیابی تمایز استئوسیت:

در تمایز استئوژنیک، سلول ها دو بار با محلول  saline buffered Phosphate (PBS)  شستشو شدند. سپس در پارافرمالدئید 4درصد برای مدت 60 دقیقه قرار گرفته و فیکس شدند. پس از اتمام زمان ذکر شده، سلول ها مجدداً با محلول PBS کاملاً شستشو داده شدند. سپس سلول ها با رنگ آلیزارین رد s 2درصد با 4/1 pH= به مدت 20 دقیقه رنگ آمیزی شدند و در انتها رنگ اضافی با آب مقطر خارج گردید. پس از رنگ آمیزی، رسوبات کلسیم که محصول سلول های استخوانی هستند در ظرف کشت 12 خانه ای مورد بررسی قرار گرفتند.

القا سلول های بنیادی مزانشیمی به آدیپوسیت در شیشه

 سلول های پاساژ 3 با دانسیته 5000 سلول بر سانتی متر مربع در ظرف های 12 خانه ای کشت شدند و پس از این که سلول ها به سطح پوشانندگی رسیدند، محیط آن ها با محیط القاکننده تمایز به آدیپوسیت جایگزین شد. این محیط Mمحتوی FBS 10درصد،DMEM-LG  شامل- 7 10 ایزوبوتیل-3.5mM  دگزامتازون 1-متیل گزانتین (Sigma,USA) (USA,Sigma ، 1 واحد از ترکیب انسولین- ترانسفرین- سلنیت سدیم (Gibco) و 10mM ایندومتاسین (USA,Sigma ) بود که سلول ها به مدت 21 روز تحت تأثیر القا قرار گرفتند. هر سه روز یک بار تعویض محیط صورت گرفت. به عنوان گروه کنترل، محیط برخی از خانه ها با محیط معمولی یعنی DMEM با درصد گلوکز پایین، 10 درصد سرم جنین گاوی و آنتی بیوتیک جایگزین شد(3). ارزیابی تمایز آدیپوسیت. سلول ها بعد از دو بار شستشو با محلول PBS و تثبیت شدن با پارافرمالدهید 4درصد به کمک رنگ اویل رد(با غلظت 3/0 درصد ایزوپروپانول 60درصد) به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق، رنگ آمیزی و سپس با آب مقطر شستسشو شد. واکوئل های چربی در سلول ها مورد بررسی قرار گرفتند.

القا سلول های بنیادی مزانشیمی به کندروسیت درشیشه

 سلول ها از فلاسک کشت با دانسیته 200000 سلول بر سانتی متر مربع به تیوب 15 میلی لیتری از جنس پروپیلن منتقل و در دور rpm 2000 و به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شدند و توده کوچک سلولی در ته تیوب تشکیل شد و بعد، محیط القاکننده تمایز به غضروف که شامل محیط محتوی  10 درصدFBS6/1درصد، DMEM-LG کشت- 6/1اسید آسکوربیک- L 50µg/m ،(Sigma,USA)دگزامتازون رشد فاکتور10ng/ml ،(Sigma,USA) فسفات- 2 ترانسفورمینگ بتا (USA,Sigma (و1 واحد از ترکیب انسولین- ترانسفرین- سلنیت سدیم (Gibco (بود به مدت چهار هفته به سلول ها اضافه شد. در این مدت هر سه روز یک بار محیط سلول­ها تعویض شد. به عنوان گروه کنترل، محیط برخی از کشت­ها با محیط معمولی یعنی DMEM با درصد گلوکز پایین، 10 درصد سرم جنین گاوی و آنتی بیوتیک جایگزین شد(12). ارزیابی تمایز کندروژنیک. نمونه ها به روش روتین بافتی پردازش و برش های 5 میکرومتری از آن ها تهیه شد. به این ترتیب که پلیت سلولی موجود در انتهای تیوپ پلی پروپیلن به مدت 2 ساعت در پارافرمالدهید10درصد فیکس شد، سپس با استفاده از الکل و گزیلل به ترتیب آبگیری و شفاف سازی و در پارافین قالب گیری شده، با استفاده از میکروتوم، برش­های 5 میکرومتری تهیه گردید. سپس رنگ تولوئیدن بلو با غلظت 1/0درصد به مدت 2 دقیقه به مقاطع بافتی افزوده شد. در انتها رنگ اضافی با آب مقطر شسته شد. هسته، اسید موکوپلی ساکاریدها و موکوپلی ساکاریدهای سولفاته مترشحه از سلول های غضروفی به وسیله میکروسکوپ نوری تحت بررسی قرار گرفت.

محاسبه تعداد دو برابر شدگی جمعیتی(PDN) و زمان دو برابر شدن جمعیت(PDT) :

تعداد دو برابر شدگی جمعیت برای سلول های مزانشیم جدا شده از هر 3 منبع بافت مورد استفاده در این تحقیق از پاساژهای سوم تا دهم بررسی شد. بدین ترتیب که سلول ها با تراکم 10³×2 سلول (N0)در چاهک های پلیت 6 خانه به صورت 3بار تکرار کشت داده شد هر سه روز یک بار محیط کشت تعویض شد. در هر بار پاساژ پس از جداسازی سلولی، ضمن برآورد درصد سلول های زنده، تعداد آن ها نیز با استفاده از لام نئوبار شمارش شد .سپس میزان دوبرابر شدن جمعیت(PDN) و زمان دوبرابر شدن سلول های مزانشیم(PDT) با استفاده از فرمول زیر قابل محاسبه می باشد. سلول ها جدا شده و شمارش شدند.(N) و بر اساس فرمول (N0/N) Log2=PDNدو برابر شدن جمعیت سلولی محاسبه گردید. و با تقسیم زمان تقسیم بر دو برابر شدگی جمعیت زمان دو برابر شدن جمعیتی محاسبه گردید(18).

نتایج:

مورفولوژی سلولی :

سلول ها، روزانه با میکروسکوپ کنتراست مشاهده شد. مورفولوژی سلول های کشت اولیه سلول های چسبنده، جمعیت سلولی هتروژن بود. در این زمان، سلول هایی با مورفولوژی متفاوت از قبیل پهن، دوکی و چندوجهی مشاهده شد. در پاساژهای بالاتر تعداد سلول های دوکی شکل بیشتر شد. به طوری که در پاساژ سوم اکثریت سلول ها دوکی شکل بودند(شکل 1).مارکرهای سلول مزانشیمی شامل CD44، CD73، CD90 و CD105 با میزان مثبت بالا در همه سه نوع MSC بیان شد. با این وجود، هیچ نشانه ای از نشانگرهای سلول های هماتوپویئتیک شامل CD11b، CD34 و CD45 در تمام منابع مختلف MSCs نمایش داده نشد. CD90 در BM-MSC ها نسبت به AD-MSC ها و DSC میزان بیان بالاتری داشت. CD44 در DSC به مقدار قابل ملاحظه ای نسبت به BM-MSC و AD-MSC بیان شده است (شکل 2) .  

بررسی توانایی تمایز

براساس نتایج ما، سلول های مزانشیم جدا شده از هر سه منبع می تواند به سه شکل از استئوسیت ها، آدیتوسیت ها و کندروسیت ها تمایز پیدا کند(شکل 3). اولین نشانه های تغییرات ریخت شناسی و تمایز به استخوان یک هفته پس از القای تمایز مشاهده گردید، بدین ترتیب که در مناطقی از تک لایه سلولی، توده های سلولی در روز هفتم تشکیل شد و به تدریج بزرگ تر و در روز 21 تعداد فراوانی توده در ظرف کشت قابل مشاهده بود. در این زمان، کشت تمایزی سلول، خاتمه داده و سلول ها از نظر ترشح ماتریکس معدنی با روش آلیزارین قرمز ارزیابی شدند که حاصل آن قرمز شدن توده های مذکور بود. در کشت کنترل که سلول ها در معرض محیط معمولی فاقد مواد القاکننده تمایز به استخوان قرار داشتند، توده های سلولی تشکیل نشد و این کشت با آلیزارین قرمز رنگ نشد. بر اساس نتایج ما BM-MSC ها بالاترین میزان تمایز را برای استئوسیت ها نسبت به AD-MSC و DSC نشان دادند که به واسطه رسوب کلسیم در شکل 3 با رنگ آمیزی آلزارین رد نشان داده شده است. اولین قطرات چربی 3 روز پس از آغاز کشت در برخی از سلول ها مشاهده شد. این قطرات به تدریج در سایر سلول ها نیز ظاهر شد، به طوری که در پایان دوره تمایز(روز 21) ، اغلب سلول ها حاوی قطرات چربی بودند شکل قطرات چربی، به دنبال رنگ آمیزی اویل رد، قرمزرنگ شدند، در مقابل در سلول های کنترل که به مدت 21 روز در محیط فاقد مواد چربی زا قرار داشتند، قطره چربی تشکیل نشد. با استفاده از رنگ آمیزی اویل رد، تمایز آدپیوژنز در AD-MSC و BM-MSC و DSCs دیده می شود. در برش های تهیه شده از کشت تمایز به غضروف، که با تولوئیدین آبی رنگ آمیزی شدند، مناطق بنفش رنگ مربوط به نواحی تمایز یافته به غضروف را نشان میدهد در حالی که نقاط آبی رنگ مناطق تمایز نیافته را نشان میدهد. از آن جا که رنگ آمیزی بنفش از طریق تولوئیدین آبی نشان دهنده تمایز کندروستیک است، BM-MSC بیشترین پتانسیل برای تمایز کندروستیک و سپس DSCs و AD-MSC به ترتیب بالاترین توانایی تمایز به غضروف را نشان دادند.

تعداد دو برابر شدگی جمعیتی(PDN) و زمان دو برابر شدن جمعیت(PDT) :

همان طور که در نمودار1 نشان داده شده است. DSCs نسبت به BM-MSC و AD-MSC در طول زمان های P1 تا P10 به طور مضاعف زمان دو برابر شدن جمعیت را کمتر نشان می دهند(05/0≥P). میانگین زمان دو برابر شدن جمعیت برای سلول های DSC در پاساژ 1 تقریبا 18 ساعت بود و تا پاساژ 10 نیز این زمان تغییر قابل ملاححظه ای مشاهده نشده بود.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1-مورفولوژی AD-MSC، BM-MSC و DSC در پاساژ 3.

همه سلول هامورفولوژی مشابه فیبروبلاست یعنی فرم دوکی شکل و چسبنده را نشان دادند.

 

 

شکل 2-نمودار فلوسیتومتری ، نشان دهنده میزان بیان CD44، CD73، CD90، CD105 در سلول های مزانشیمی جداشده از مغز استخوان، بافت چربی و پرده جنینی. HLADR، CD34، CD11b، CD45 در تمام نمونه ها منفی گزارش شدند.

 

با این حال، زمان دو برابر شدن جمعیت برای BM-MSC ها و AD-MSC ها به ترتیب 35 و 40ساعت بود و پس از پاساژ ششم افزایش قابل توجهی مشاهده می شود. همان طور که در نمودار2 نشان داده شده است، سطح دو برابر شدن جمعیت، برای DSC تقریبا ثابت بود، در حالی که برای BM و AD در طی پاساژ سلولی کاهش یافت.

 

 

شکل3-مقایسه قابلیت تمایز به 3 رده استخوان ، چربی و غضروف در سلول های مزانشیم جداشده از مغز استخوان، بافت چربی و پرده جنینی. 1)مورفولوژی سلول ها با استفاده ازمیکروسکوپ فاز کنتراست (2)، رنگ آمیزیoil Red نشان دهنده تمایز چربی (3) و رنگ آمیزی رنگ آلیزارین رد که نشان دهنده تمایز استئوژنیک است (4) رنگ آمیزی تولوئیدین آبی نشان دهنده تمایز غضروفی است.

 

نمودار1-زمان دو برابر شدن جمعیت (PDT). مقایسه زمان دو برابر شدن جمعیت  AD-MSC، BM-MSC وDSC ..

 

 

نمودار2- مقداردو برابر شدن جمعیت (PDL). مقایسه تعداددو برابر شدن جمعیت  AD-MSC، BM-MSC وDSC  .

 

 

 

بحث ونتیجه گیری

سلول درمانی شاخه ای از پزشکی ترمیمی است که در آن از تزریق سلول های فرآوری شده در خارج از بدن برای پیوند اعضا، بیماری های پوستی، غضروفی، خودایمنی، عصبی، سرطان ها و بیماری های قلبی استفاده می شود. از مهم ترین سلول های بنیادی بزرگسالان که امروزه توجه اکثر محققین را به خود جلب کرده است می توان به سلول های بنیادی مزانشیم اشاره کرد. سلول های بنیادی مزانشیمی سلول های بالغ غیرهماتوپویتیکی چند ظرفیتی و خودنوساز هستند(9). این سلول ها اولین بار از مغز استخوان جدا شده و بیشترین مطالعات بر روی این سلول ها انجام شده و به عنوان استاندارد طالیی در مطالعات سلولی و سلول درمانی به حساب می آیند. حدوداً بیش از یک دهه مطالعات تجربی(مدل های حیوانی) مورد استفاده قرار گرفته اند. این سلول ها با توجه به خواص تعدیل کنندگی از طریق عوامل و فاکتورهای سرکوب کننده سیستم ایمنی و توان ترمیمی آن ها، استفاده گسترده ای در درمان بیماری های ایمونولوژیک، بیماری های مزمن و خود ایمنی و غیر ایمنولوژیک، مهندسی بافت، ترمیم، بیماری های تخریب کننده و بدخیم از جمله سرطاندارند. یکی از بزرگترین چالش های استفاده از سلول مزانشیم مغز استخوان در سلول درمانی روند پردرد بودن و پر هزینه بودن استخراج سلول ها می باشد که استفاده از این سلول ها را به عنوان کاندید برای پیوند آلوگرافت با محدودیت مواجه کرده است. به طور نرمال پس از جداسازی سلول­های مزانشیم از بافت مورد نظر ،سلول ها را تا پاساژ 3 کشت می دهند وسپس به بیمار تزریق می کنند. لزوم انجام این کار این است که سلول مزانشیم از سایر سلول ها خالص سازی شود و هم چنین تزریق سلول مزانشیم جوانی که هم به لحاظ سرعت تکثیر و هم به لحاظ توانایی در تمایز به رده های مختلف سلولی(استخوان، غضروف و چربی) و خاصیت بنیادینگی سلول نیز حفظ شود. اما معمولاً کم بودن تعداد سلول های کشت داده شده در طول 3 پاساژ به عنوان یک محدودیت مطرح می شود. بنابراین محققین پیوسته به دنبال یک منبع جایگزین با بیشترین بازده می باشند که علاوه بر این که تعداد سلول های بیشتری وجود داشته باشد، سلول ها به لحاظ کروموزومی هم نرمال ، هم چنین این سلول ها از بافت بالغ، قابل دسترس و مشکلات اخلاقی و مشکلات ایجاد تراتوما را نیز به همراه نداشته باشد(6). هرچند که سلول های مزانشیم عمدتاً از مغز استخوان جداسازی می شوند، اما امروزه می توان آن ها را از سایر بافت ها نظیر بافت چربی، جفت، مایع آمنیوتیک، بند ناف و پرده جنینی استخراج و جدا کرد. در دسترس ترین منبعی که برای استفاده از این سلول­ها پیشنهاد می شود همان مغز استخوان است. گرچه این سلول ها از منابع دیگری مثل کبد ، خون نوزادان، خون بند ناف و مایع آمینیوتیک بافت چربی و پرده جنینی نیز قابل جداسازی هستند. این سلول ها 001/0تا 1/0 درصد از جمعیت سلول های هسته دار مغز استخوان انسان را تشکیل می دهنـد، از اسـتخوان ایلیاک کرست جدا شده و قابلیت جدا سازی از اسـتخوان های تیبیا و فمور را هم دارند و جالب این کـه توانـایی ازدیـاد و تکثیر در محیط آزمایشگاهی را به خوبی نشان داده اند. ولی در سال های اخیر به دلیل محدودیت هایی که استفاده از سلول های مزانشیمی مشتق شده از بافت مغز استخوان به همراه داشته از جمله دسترسی مشکل و روند پردرد استخراج مغز استخوان از بیمار استفاده از این سلول ها برای برای فرد غیر از اهدا کننده میسر نمی باشد و استفاده از این منبع سلول مزانشیمی را با محدودیت هایی مواجه کرده است لذا توجه محققین به سمت بافتی جایگزین به عنوان منشا سلول مزانشیمی جلب شده است(6). هدف ما در این مطالعه مقایسه ویژگی های فنوتیپی، توانایی تکثیر و تمایز به سه رده سلول های چربی ، استخوان و غضروف در 3 رده سلول مزانشیم جدا شده از بافت های مغز استخوان، چربی و پرده جنینی بود.در این راستا بافت چربی جایگاه ویژه ای را در این خصوص پیدا کرده است.این سلول ها توانایی تمایز به غضروف، استخوان، عضله و چربی را در حضور فاکتورهای تمایزی و شرایط کشت مناسب دارا هستند. هم چنین در مقایسه با سلول های مشابه مشتق از بافت های دیگر از جمله مغز استخوان، دارای ویژگی ها و مزایای فراوانی هستند که از جمله آن ها می توان به دسترسی آسان این سلول ها از بیمار در مقادیر نسبتاً فراوان با استفاده از روش لیپوساکشن اشاره نمود. بنابر این امکان استفاده از این سلول ها به فرد دیگر با محدودیت های کمتری مواجه می باشد(15). یکی دیگر از بافت های پیشنهادی بافت های خارج جنینی می باشد. از آن جایی که جنین در داخل رحم مادر به عنوان یک موجود نیمه بیگانه حفظ می شود و بافت های خارج جنینی توانایی سرکوب پاسخ ایمنی مادر بر علیه جنین را دارد ، بنابراین سلول های مزانشیم مشتق شده از بافت پرده جنینی با منشا مادری علاوه بر این که جز سلول های مزانشیمی بافت بالغ محسوب می شود و خطرات و مشکلات استفاده از سلول­های بنیادی جنینی از جمله احتمال بروز عارضه تراتوما و مسائل اخلاقی را در بر ندارد، میتواند گزینه مناسبی برای رفع چالش رد پیوند در سلول درمانی نیز محسوب شود(11). ونگ و همکارانش در سال2004 سلول های مزانشیم را از ژله وارتون بند ناف انسان جدا کردند و نشان دادند که این سلول ها نسبت به CD10 CD44 بیان مثبت دارند و قادر هستند به سلول های چربی و استخوان تمایز یابند(2). بر اساس نتایجی که از این مطالعه به دست آورده شده است، میزان بیان بالایی از CD44 را در سلول های مزانشیم استخراج شده از پرده جنینی را مشاهده می گردد، مارکر CD44 از آن جایی که مارکر اصلی اتصال سلولی می باشد، گواه این موضوع می باشد که سلول های مزانشیم جدا شده از پرده جنینی این ویژگی اتصال سلولی که از مهم ترین خواص سلول های مزانشیم است را در خود نگه می دارد. هم چنین در این مطالعه م به بررسی میزان توانایی تمایز سلول های بنیادی به 3 رده اصلی استخوان، چربی و غضروف پرداخته شده است، که توانایی تمایز را در هر 3 رده مشاهده نمود، علاوه بر آن با توجه به این که هر سلول مزانشیم از چه منبع جدا می شود توانایی تمایز را به صورت متفاوت نشان می دهد که این موضوع بر می گردد به ریز محیط سلول های مزانشیمی که از هر منبع گرفته می شود. به عنوان مثال سلول های مزانشیم که از بافت چربی گرفته می شود توانایی تمایز به بافت چربی را بسیار بیشتر از سایر سلول ها نشان می دهد. سلول­های مزانشیمی که از بافت مغز استخوان گرفته می شود توانایی استخوانی شدن را بیشتر از سایر سلول ها نشان می دهد.Anker t ̓In  و همکارانش در سال 2004، اولین بار نشان دادند که پرده ی آمنیون شامل تعداد زیادی سلول­های بنیادی مزانشیمی با توانایی تمایز به آدیپوژنیک و استئوژنیک است(2). پرده جنینی 3 لایه آمنیون، کوریون و بخش دیسیجوآ دارد، که از این 3 لایه فقط بخش دیسیجوآ سلول هایی با منشا مادری دارد، از آن جایی که استفاده از سلول های بنیادی با منشا جنینی خطرات ایجاد تراتوما را به دنبال دارد، در این مطالعه از بخش دسیجوآ استفاده شد. این سلول ها را بعد از این که اطمینان پیدا شد تمامی سلول ها منشا مادری دارند مارکر های سطح سلولی و توانایی تمایزی به استخوان غضروف و چربی را در آن ها بررسی گردید. Alviano  و همکارانش موارد به دست آمده توسط Anker t ̓In و همکارانش را که در مورد ظرفیت تمایز سلول های مزانشیمی استخراج شده از پرده جنینی به آدیپوژنیک و استئوژنیک بود، را مورد تایید قرار دادند(2). علاوه بر این، lans-portsmann و همکارانش درسال 2006 نشان دادند که سلول های مزانشیم جدا شده از جفت، قادر به تمایز به دودمان کندروژنیک و میوژنیک و نوروژنیک بودند و همچنین با تفاوتهای عمده در میان انواع سلول ها در ارتباط با منابع مختلف جنینی جفت، کوریون، آمنیون هستند(6). در این مطالعه به بررسی توانایی تمایز سلول ها به 3 رده استخوان و چربی و غضروف پرداختیم که با اثبات این که سلول های مزانشیم جدا شده از پرده خواص اصلی و کلیدی سلول مزانشیم را دارا می باشد در قدم بعدی از آن ها برای مطالعات بیماری­های مختلف از جمله MS نیز استفاده می گردد و توانایی تمایز به سلول عصبی را نیز بررسی می شود. Viano  و همکارانش Alدر سال 2007سلول های مزانشیمی را از پرده آمنیون جـدا کـردنـد و دریــافتند کـه قدرت رشد و تکثیـرسلول های مزانشیمی مشتق شده از پرده جنینی در شرایط آزمایشگاهی نسبت به مغز استخوان بیشتر است. در آنالیز فلوسایتومتری سلول های مزانشیمی مشتق شده از پرده جنینی مشخصات فنوتیپی برای آن ها که مارکرهای ویژه ای MSCها هستند ، CD166 ,CD44 ,CD29 ,CD73 ,CD105، مثبت و برای CD45, CD34 مارکرهای سلول های خونساز و CD14 مارکر سایر سلول­هـا، منفی بودند . Mihu و همکارانش در سال 2009 سلول های مزانشیمی را از پرده آمنیون جدا کردند و نشان دادند که این سلول ها نسبت به CD29 ,CD73 ,CD105 ,CD49مثبت و برایCD4 و CD14،CD34 منفی هستند(10). در این مطالعه با بررسی زمان 2 برابر شدن سلول ها با توجه به این که مدت زمانی که طول می کشد تا سلول ها 2 برابر شوند در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی از سلول های مزانشیم مغز استخوان و چربی بسیار پایین تر است، بنابر این نتیجه گرفته می شود که این سلول ها به لحاظ اقتصادی نیز بسیار به صرفه می باشند زیرا در مدت زمان کوتاه تری به سلول های بیشتری دست پیدا می گردد. در این مطالعه با بررسی توانایی تمایز به استخوان، چربی و غضروف ،بر روی سلول های مزانشیم استخراج شده از سلول های چربی، مغز استخوان و پرده جنینی مشاهده شد که بیشترین توانایی تمایز به استخوان و تشکیل رسوب کلسیم مربوط به سلول های مزانشیم استخراج شده از مغز استخوان می باشد. بیشترین توانایی تمایز به چربی و تشکیل وزیکول های چربی در سلول های مزانشیم استخراج شده از بافت چربی می باشد. تجزیه و تحلیل منحنی های رشد در طول پاساژهای مختلف نشان داد که DSC دارای قوی ترین پتانسیل تکثیر است که به دنبال AD-MSCs و BM-MSCs است. گزارش های قبلی نشان داده است که AD-MSC ها ظرفیت تکثیر بیشتری در مقایسه با BM-MSC ها را نشان می دهند(4). در مطالعه انجام شده توسط پنگ و همکاران، AD-MSCs زمان دو برابر شدن جمعیت را به 45/2 ساعت نشان داد که به طور معنی داری کمتر از BM-MSC ها بود که برابر با 61/2 ساعت بود(6). هم چنین لازم به ذکر است که AD-MSC های جدا شده از نواحی مختلف بدن دارای ظرفیت های تمایزی متفاوت هستند(15، 14، 6). علیرغم این یافته ها، برخی معتقدند که تفاوت های رشد ممکن است به تفاوت بین اهدا کنندگان مربوط باشد. به این ترتیب سلول­های چربی هرچقدر از بافت های چربی اهداکنندگان جوان تر دریافت شود سرعت تکثیر و توانایی تمایز بهتری را نشان می دهند(11). نتایج این پژوهش به وضوح نشان داد که AD-MSC ها و BM-MSC ها به آدیپوسیت ها به خوبی تمایز می یابند که با نتایج Rebelatto و همکاران متفاوت است(17، 14). با این حال، DSCs نسبت به آدیپوسیت ها کمی متفاوت است. از نظر استئوژنز، نتایج نشان داده شد که BM-MSCs و AD-MSCs بیشترین تمایز تمایز را نشان دادند که با یافته­های گزارش شده توسط Shafiee  و Zhang و همکاران مطابقت داشت(17، 13). DSC کمترین قدرت را در تمایز استئوژنیک نیز نشان داد. شدت غضروفی شدن در BM-MSC ها بالاتر از سایرین بود و AD-MSCs و DSCs بالاترین شد. بر اساس نتایج بافت شناسی هر 3 منبع تحت شرایط القایی مناسب از توان بالایی جهت تمایز به بافت استخوان و غضروف برخوردارند. در حالی که بر خلاف سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان و چربی بر اساس نتایج رنگ آمیزی Oil red  سلول های بنیادی مزانشیمی پرده جنینی تحت شرایط لیپوژنیک از توان بسیار پایینی برای تمایز به بافت چربی برخوردارند. نتایج آزمایش فلوسیتومتری نشان می دهد که سلول های شبه فیبروبلاستی جدا شده از پرده جنینی در مقایسه با مغز استخوان و چربی به میزان بالاتری مارکرهای سطحی سلول های بنیادی مزانشیمی شامل CD 105, CD 90, CD 73, CD 44 را بیان می کنند. بیان مارکرهای اختصاصی سلول های رده خون ساز شامل CD 45, CD 11b, CD 34 درهر3 منبع بسیار پایین می باشد. به طور خلاصه بر اساس نتایج این تحقیق بر خلاف سلول های بنیادی مزانشیمی که به تدریج پس از9 پاساژسلولی توان تکثیر خود را به میزان زیادی از دست می دهند، سلول های بنیادی مزانشیمی پرده جنینی توان خود نوزایی را طی پاساژهای متعدد حفظ می کنند. از آن جا که در سلول درمانی همواره با یستی تعداد زیادی از سلول های فعال از نظر متابولیک در دسترس باشند، توان تکثیر بالا در طی پاساژهای متعدد به عنوان یک مزیت برای این منبع سلولی محسوب می شود.

 

مراجع

 

1.Alabdulkarim, Y., Ghalimah, B., Al-Otaibi, M., Al-Jallad, H.F., Mekhael, M., Willie, B. (2017). Recent advances in bone regeneration: The role of adipose tissue-derived stromal vascular fraction and mesenchymal stem cells. Journal of Limb Lengthening & Reconstruction, 3(1) 4.

2.Araújo, A.B., Salton, G.D., Furlan, J.M., Schneider, N., Angeli, M.H., Laureano, Á.M. (2017). Comparison of human mesenchymal stromal cells from four neonatal tissues: amniotic membrane, chorionic membrane, placental decidua and umbilical cord. Cytotherapy, 19(5); 577-585.

3.Casado‐Díaz, A., Anter, J., Müller, S., Winter, P., Quesada‐Gómez, J.M., Dorado, G. (2017). Transcriptomic analyses of adipocyte differentiation from human mesenchymal stromal‐cells (MSC). Journal of Cellular Physiology, 232(4); 771-784.

4.Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cortenbach, I., Marini, F. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society For Cellular Therapy Position Statement, Cytotherapy, 8(4); 315-317.

5.Galleu, A. , Riffo-Vasquez, Y., Trento, C., Lomas, C., Dolcetti, L., Cheung, T.S. (2017). Apoptosis in mesenchymal stromal cells induces in vivo recipient-mediated immunomodulation. Science Translational Medicine, 9(416); eaam7828.

6.Jin, H.J., Bae, Y.K., Kim, M., Kwon, S.-J., Jeon, H.B., Choi, S.J. (2013). Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood as sources of cell therapy, International Journal of Molecular Sciences, 14(9); 17986-18001.

7.Li, H., Ghazanfari, R., Zacharaki, D., Lim, H.C., Scheding, S. (2016). Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Annals of the New York Academy of Sciences, 1370(1); 109-118.

8.Moll, G., Ankrum, J.A., Kamhieh-Milz, J., Bieback, K., Ringdén, O., Volk, H.-D. (2019). Intravascular mesenchymal stromal/stem cell therapy product diversification: time for new clinical guidelines, Trends in Molecular Medicine .

9.Pereira, M.R.d.J., Pinhatti, V.R., Silveira, M.D.d., Matzenbacher, C.A., Freitas, T.R.O.d., Silva, J.d. (2018). Isolation and characterization of mesenchymal stem/stromal cells from Ctenomys minutus. Genetics and Molecular Biology, 41(4); 870-877.

10.Pfeiffer, D., Wankhammer, K., Stefanitsch, C., Hingerl, K., Huppertz, B., Dohr, G. (2019). Lang, amnion-derived mesenchymal stem cells improve viability of endothelial cells exposed to shear stress in eptfe grafts. The International Journal of Artificial Organs, 42(2); 80-87.

11.Rizzuto, G.A., M. Kapidzic, M. Gormley, A.I. Bakardjiev, Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface, JoVE (Journal of Visualized Experiments) (113) (2016) e54237-e54237.

12.Romanov, Y.A., Darevskaya, A., Merzlikina, N., Buravkova, L. (2005). Mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue: isolation, characterization, and differentiation potentialities. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 140(1); 138-143.

13.Sharma, R.R., Pollock, K., Hubel, A., McKenna, D. (2014). Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices. Transfusion, 54(5); 1418-1437.

14.Shi, Y.-Y., Nacamuli, R.P., Salim, A., Longaker, M.T. (2005). The osteogenic potential of adipose-derived mesenchymal cells is maintained with aging. Plastic and Reconstructive Surgery, 116(6); 1686-1696.

15.Schipper, B.M., Marra, K.G., Zhang, W., Donnenberg, A.D., Rubin, J.P. (2008). Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Annals of Plastic Surgery, 60(5); 538-544.

16.Squillaro, T., Peluso, G., Galderisi, U. (2016). Clinical trials with mesenchymal stem cells: an update, Cell Transplantation, 25(5); 829-848.

17.Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A.I. (1995). Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5‐azacytidine, Muscle & Nerve, 18(12); 1417-1426.

18.Wilson, A., Chee, M., Butler, P., Boyd, A.S. ( 2019). Isolation and characterisation of human adipose-derived stem cells. Immunological Tolerance, Springer, pp; 3-13.