بررسی عصاره های آبی-آلی برگ و ریشه علف هفت بند (Polygonum aviculare L) بر روی باکتری های بیماری زا مقاوم به آنتی بیوتیک در مدل حیوانی و در شیشه

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

دوره 15، شماره 1 - شماره پیاپی 57، اسفند 1400، صفحه 1-12   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

شهرزاد نصیری سمنانی¹؛ نسترن قاسم پور^{* 2}

¹استادیارگروه میکروبیولوژی،دانشکده علوم پایه- مهندسی، واحد زنجان، دانشگاه آزاد اسلامی، زنجان،ایران.

²دانشجوی دکتری عمومی دامپزشکی، دانشکده دامپیزشکی دانشگاه رازی کرمانشاه، ایران.

چکیده

زمینه و هدف: مقاومت دارویی باکتری ها در بیماری های عفونی باعث گردیده تا استفاده از گیاهان در درمان بیماری ها بیشتر مورد توجه واقع شود. هدف از این پژوهش بررسی اثرات عصاره های آبی-آلی برگ و ریشه علف هفت بند(Polygonum aviculare L) بر روی باکتری های بیماری زا در مدل حیوانی و آزمایشگاهی است.
روش کار: در این مطالعه پس از تهیه عصاره های آبی، اتانولی و استونی بخش های مختلف پودر علف هفت بند، میزان MIC و MBC عصاره ها بر باکتری ها با روش های رقت در براث و انتشار چاهکی در آگارتعیین گردید. مطالعه مدل حیوانی با تزریق صفاقی CFU/ml  5×10⁵ از باکتری ها و 0.5سی سی از انواع عصاره ها با غلظت MIC تعداد کلونی های باکتری های طحالی پس از 7 روز با کشت بر روی محیط مولرهینتون آگار و مقایسه با پروتکل استاندارد شمارش گردید.
یافته­ها: بالاترین میزان MIC و MBC بر روی استافیلوکوکوس اورئوس مربوط به برگ آبی و اتانولی به ترتیب 57 و 38 ، بر روی سودوموناس آئروژینوزا مربوط به ساقه و گل اتانولی به ترتیب 31و 27، بر روی کلبسیلا پنومونیه عصاره اتانولی برگ و ریشه  57 و 120میلی گرم بر میلی لیتر و بر روی استرپتوکوکوس پیوژنز عصاره استونی برگ 227 میلی گرم بر میلی لیتر بود. در مدل حیوانی، عصاره استونی برگ برای استافیلوکوک اورئوس CFU/ml 7.5×10⁶ و عصاره اتانولی ساقه برای سودوموناس آئروژینوزا CFU/ml  8×10⁷ ، برای کلبسیلا پنومونیه و استرپتوکوکوس پیوژنز عصاره اتانولی برگ و ریشه به ترتیب CFU/ml  7.5×10³  و CFU/ml 3.6× 10⁶ بود.
نتیجه گیری: عصاره های علف هفت بند اثر ضد میکروبی روی باکتری های مورد مطالعه دارند.

کلیدواژه‌ها

عفونت بیمارستانی؛ عصاره های علف هفت بند؛ اثرات ضد میکروبی؛ بیماری های عفونی

اصل مقاله

ترکیب شیمیایی پلی گونوم آویکولار(Polygonum avicular) شامل اسید اگزالیک، اسید استیک، فرمیک، تانن، نیترات پتاسیم، گلوکز، اسانس، سیلیس، اکسی متیل آنتراکینون، رزین، ساکارید و موسیلاژ می باشد(15). میوه ها حاوی 18 درصد پروتئین، 71 درصد کربوهیدرات، 64 درصد چربی و9.1٪ فیبر؛ همراه با 7/0میلی گرم ویتامین B2، 670 میلی گرم کلسیم، 420 میلی گرم فسفر، 7/12میلی گرم آهن در هر 100 گرم است(26). این گیاه مدر بوده و خاصیت قابض داشته و در مواردی که احتباس ادرار هم چنین برای دفع سنگ کلیه و در درمان اسهال، بند آوردن خون ریزی و بهبود زخم از آن استفاده می گردد (4). ثابت شده است که این گیاه دارای مقادیر زیادی آنتی اکسیدان می باشد. در تحقیقی که در سال 2006 صورت گرفته مشخص شد که پلی گونوم آویکولارو دارای مقادیر زیادی فنولیک فلاوونوئید می­باشد(11). در برخی ازبیماری ها مانند پارکینسون، بیماری های قلبی و عروقی و سرطان میزان بسیارزیادی رادیکال های آزاد تولید نموده و به کار گیری عصاره این گیاه با وجود مقادیر بسیار زیاد آنتی اکسیدان ها می­تواند نتایج خوبی برای درمان این بیماری ها به همراه داشته باشد(16). گیاه در اسهال خونی و برای کنترل خونریزی، علاوه بر این، برای درمان آسم، برونشیت، سل ریوی، اگزما، روده التهاب، ادم، معده درد، میگرن، زخم، درد سیاتیک، کمردرد، درد نقرس، روماتیسم، سوختگی و تاول از این گیاه نیز استفاده می شود. در کنترل تب، ترشحات معده، ترشحات زنانه، گلوکز خون، یبوست، درد استفاده شده و استفاده بیش از حد از آن منجر به اگزما، کهیر، حساسیت پوستی و تشنج می شود(19، 11، 2). مطالعات نشان داده اند که ساقه گیاه سرشار از فنولیک بوده و ترکیبات فلاونوئیدی(کاتچین، اپی کاتچین ایزوپروتئین، جنیستئین، کامفرول و کوئرستین) در ساقه، دانه، شاخساره و گل ها(19، 11، 5) موجود است. اثر کوئرستین یکی از ترکیبات فلاونوئید اصلی با آنتی اکسیدان بالا این به طور گسترده در اسانس اندام هوایی گیاه به عنوان آنتی اکسیدان بدون کربوهیدرات، کارآمدتر از گلیکوزیدها می باشد(14). مطالعات هم چنین نشان داده اند که اثر آنتی اکسیدانی کوئرستین حدود شش برابر بیشتر از ویتامین C است. آنتی اکسیدان(کوئرستین) در پیاز قرمز انگور، مرکبات، سیب، چای نیز یافت می شود. اثرات ضد ویروسی، ضد باکتریایی و ضد التهابی این ترکیب ثابت شده است(18، 6). اثرات درمانی کوئرستین در بیماری های قلبی عروقی (CVDs)، سرطان‌ها، آسم، اگزما و ناباروری گزارش شده است(18). مطالعات نشان داد که این گیاه حاوی مواد فعال زیستی است که می توان از آن در عدم رشد تومور و متاستاز به ریه، جلوگیری از تکثیر سلولی ملانوما استفده نمود(27) و می تواند اثر ضد میکروبی قوی داشته باشد(15). محققان پیشنهاد نموده­اند که ممکن است مکمل رزوراترول اثر ضد دیابتی در برابر دیابت نوع 2 داشته باشد(28). هم چنین گرزیک و همکاران دریافتند که عصاره ی اتانولی ریزوم و گل دارای پلی فنل(+)-کاتچین و (-)-اپیکاتچین حفاظت کننده در برابر همولیز گلبول قرمز ناشی از 2،20-azobis (2-amidinopropane) دی هیدروکلراید (AAPH) باشد(10). استافیلوکوکوکس­ها یکی از مقاوم ترین باکتری هایی هستند که دارای پراکندگی بسیار بالایی دارند. این باکتری ها از جمله اولین پاتوژن های انسانی پوست و غشاهای مخاطی می باشند(13). در میان گونه های مختلف این جنس، استافیلوکوکوس اورئوس مهم ترین پاتوژن سلامت عمومی است که مقاومت بالایی در برابرعوامل ضد میکروبی دارد(14). خانواده انتروباکتریاسیه بزرگ ترین و ناهمگون ترین مجموعه از باسیل های گرم منفی همه جازی مهم در پزشکی است. بیماری های عفونی، یکی از چالش های بزرگ علم پزشکی در قرن بیست و یکم است و به تبع آن، تولید آنتی بیوتیک های جدید روز به روز افزایش می یابد. در عین حال، گسترش روزافزون مقاومت باکتریایی به آنتی بیوتیک ها، درمان بیماری های عفونی را مشکل و پرهزینه کرده است؛ از این رو، امروزه محققان به سمت جایگزین های گیاهی روی آورده اند که ضمن دارا بودن اثرات ضدباکتریایی، فاقد عوارض جانبی ناشی از مصرف داروهای شیمیایی نیز هستند(1). گیاهان دارویی منابع غنی طبیعی ضد باکتری هستند از این گیاهان برای کنترل و درمان بسیاری از بیماری ها در طب سنتی استفاده می شود(1). از بین داروهای گیاهی، استفاده از گیاهانی که دارای خاصیت آنتی اکسیدانی هستند در درمان بیماری هایی نظیر پارکینسون، آلزایمر، انواع سرطان ها، بیماری های قلبی - عروقی و غیره افزایش یافته است. این گیاهان با دارا بودن مقادیر بالای آنتی اکسیدان-های طبیعی میتوانند در روند تولید و عملکرد رادیکال های آزاد اختلال ایجاد نموده و نتایج امیدبخشی را در درمان این بیماریها داشته باشند(11). آنتی اکسیدان های طبیعی ترکیبات پلی فنلی، فلاونوئید، تانن و آنتوسیانین که در قسمت های مختلف نظیر برگ، ساقه، میوه، ریشه و حتی بذر گیاهان دارویی یافت می شوند(2). از این رو، با استخراج متابولیت های ثانویه ی گیاهی مانند اسانس ها و عصاره ها از قسمت های مختلف گیاهان دارویی می توان به خواص ضدباکتری، ضدقارچ، ضدانگل، ضدویروس و آنتی- اکسیدانی آن ها دست یافت. خاصیت آنتی اکسیدانی گیاهان دارویی به میزان ترکیبات پلی فنولی موجود در آن ها بستگی دارد(4). هدف از این پژوهش بررسی عصاره های درمانی آبی- آلی برگ و ریشه علف هفت بند(Polygonum aviculare L.) بر روی باکتری های بیماری زا مقاوم به آنتی بیوتیک در مدل حیوانی و در شیشه است.

مواد و روش‌ها

نمونه گیاهی مورد استفاده

در این تحقیق از برگ و ریشه گیاه علف هفت بند در اواخر فصل بهار از استان زنجان جمع آوری و پس از جدا کردن قسمت های زاید و شناسایی کاملا" در سایه خشک و پودر آن در شیشه های درب دار مات برای مصارف بعدی نگهداری گردید.

عصاره گیری

تهیه ی عصاره آبی، اتانولی، استونی برگ و ریشه علف هفت بند

75 گرم از برگ  و ریشه آسیاب شده علف هفت بند در 800 میلی لیتر آب مقطر، 300 میلی لیتر اتانول 80% و 300میلی لیتراستون100% مخلوط و پس از گذشت 48 ساعت صاف گردید. برای جدا سازی ناخالصی های موجود عصاره از سانتریفیوژ یخچال دار دور( 2500rpm و به مدت 20 دقیقه با دمای 4 درجه سانتی گراد) استفاده گردید. عصاره ی صاف شده با دستگاه تقطیر در خلاء میزان 40 میلی لیتر تغلیظ شده و پس استریل در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری گردید(12).

تهیه سویه های باکتری

در این تحقیق از چهار سویه باکتری های استرپتوکوکوس پیوژن، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس تهیه شده از بانک میکروبی مرکز تحقیقات بیولوژی دانشگاه آزاد اسلامی واحد زنجان استفاده گردید. از کلونی‌های حاصل از کشت‌های استوک باکتری های مورد مطالعه بر روی محیط مولر هینتون آگار که پس از 24 ساعت رشد می‌کردند(در این حالت باکتری ها در فاز لگاریتمی رشد قرار دارند) در محیط مولر هینتون براث سوسپانسیونی تهیه و برابر 5/0 مک ‌فارلند به طریقه مشاهده چشمی درمنبع نور، استاندارد شد. برای تهیه لوله‌های استاندارد مک فارلند از جدول 1 استفاده و محلول های تهیه شده مک فارلند در لوله‌های دردار و در تاریکی تا مدت 6 ماه قابل استفاده می‌باشند و در موقع استفاده باید لوله ها به خوبی تکان داده شوند. در کدورت 5/0 مک فارلند تعداد باکتری هاCFU/ml 10⁸× 5/1 می‌باشد. کدورت باکتریایی 5/0 مک فارلند را به نسبت 1:300 رقیق تا تعداد باکتری ها 10⁵ ×5 CFU/ml  شود(جدول 1)(20).

 

 

 

جدول 1- لوله استاندارد مک فارلند

4	3	2	1	5/0	شماره مک فارلند
4/0	3/0	2/0	1/0	05/0	کلرید باریم 1%
6/9	7/9	8/9	9/9	95/9	اسید سولفوریک 1%
12	9	6	3	5/1	غلظت تقریبی CFU ⁄ ml108 ×1
5/21	4/26	6/35	6/55	3/74	مقدار جذب در طول موج 600 نانومتر
669/0	582/0	451/0	257/0	132/0	مقدار جذب در طول موج 600 نانومتر

 

بررسی اثرات ضد میکروبی علف هفت بند در شرایط آزمایشگاهی

روش انتشار چاهکی در آگار

از سوسپانسیون میکروبی که برابر با استاندارد 5/0 مک فارلند بر روی آگار کشت و چاهک ‌ها از رقت‌های 1:2، 1:4 تا 1:32 عصاره های علف هفت بند به مقدار 100 میکرولیتر پر گردید. پلیت ها در 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه و در نهایت هاله عدم رشد باکتری ها بر روی پلیت در اطراف چاهک ‌ها اندازه‌ گیری و سه بار تکرار شد. برای بررسی اثر ضد میکروبی رقت های مختلف انواع عصاره های علف هفت بند بر روی استرپتوکوکوس پیوژن، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس ابتدا محیط مولر هینتون آگار تهیه شد و به ضخامت 5-4 میلی متر در پلیت‌ها تقسیم گردید. سپس چاهک‌هایی به قطر تقریبی 5 میلی‌ متر در پلیت‌ها حفر شد. لازم به ذکر است به دلیل عدم رشد باکتری استرپتوکوکوس پیوژن روی محیط مولرهینتون آگار، برای این باکتری از محیط کشت بلاد آگار استفاده گردید(22، 21).

روش ماکرودایلوشن برای تعیین MIC و MBC

MIC در حقیقت کم ترین بازدارنده از رشد یک ماده ضد میکروبی است که اگر عامل ضد میکروبی از محیط حذف شود باکتری ها مجدداً قادر به رشد خواهند بود. MBC به حداقل غلظت ماده ضد میکروبی گفته می‌شود که بتواند 9/99 درصد از باکتری ها را نابود کند و اگر از آن کشت ثانویه انجام شودکم تر از 1/0 درصد باکتری های اولیه رشد کنند. برای تعیین MIC و MBC انواع عصاره های علف هفت بند بر روی استرپتوکوکوس پیوژن، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس ‌ابتدا رقت های 1:2 تا 1:32 عصاره در مولر هینتون براث دوبل را تهیه و سپس با افزودن 1 میلی لیتر از سوسپانسیون میکروبی، غلظت ‌های نهایی عصاره 1:2 تا 1:32 به دست آمد. لوله‌ها در 37 درجه سلسیوس تا 24 ساعت گرما گذاری(لوله های مربوط به بروسلا در شرایط 10-7 درصد CO2 تا 3 روز گرما گذاری شدند). پس از 24 ساعت لوله‌ها بررسی و یک ساب کالچر بر روی مولر هینتون آگار نیز داده شد. این بررسی سه بار تکرار و در کنار لوله‌های تست برای تعیین MIC و MBC عصاره های علف هفت بند، کنترل مثبت شامل باکتری در محیط فاقد عصاره برای مقایسه کدورت لوله‌های تست گذاشته شد(20).

بررسی اثرات ضد میکروبی عصاره های علف هفت بند  بر روی استرپتوکوکوس پیوژن، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس، در مدل حیوانی

در این تحقیق از موش های BALB/c ماده بالغ با سن 8-6 هفته‌ای به وزن تقریبی 5± 25 گرم استفاده شد. موش‌ها پس از تهیه در قفس های مخصوص نگهداری حیوانات آزمایشگاهی در شرایط استاندارد تحت مراقبت قرار گرفتند. 96 عدد موش ماده  BALB/cرا در 4 دسته 16 تایی یعنی برای هر باکتری یک دسته که شامل 4 گروه است، تقسیم گردید. برای هر دسته عمل تزریق را جداگانه انجام داده شد. برای تهیه سوسپانسیون میکروبی جهت ایجاد عفونت در موش ها، از کشت 48 ساعته باکتری مورد نظر، سوسپانسیون 5/0 مک فارلند که حاوی 10⁸× 5/1 باکتری در هر میلی لیتر است، تهیه کرده و آن را به نسبت 1:300 در نرمال سالین استریل رقیق تا رقت سوسپانسیون میکروبی جهت تزریق، به تعداد 10⁵ × 5 باکتری در هر میلی لیتر برسد. در روز اول به هر گروه، تعداد CFU/ml  10⁵ × 5 باکتری به صورت داخل صفاقی تزریق شد. در روز بعد، 500 میکرولیتر نرمال سالین به موش های گروه اول، 5/0 میلی لیتر عصاره آبی برگ علف هفت بند معادل با غلظت MBC به موش های گروه دوم، 5/0 میلی لیتر عصاره اتانولی برگ معادل با غلظت MBC به گروه سوم و 500 میکرولیتر عصاره استونی برگ معادل با غلظت MBC به گروه چهارم، 500 میکرولیتر عصاره اتانولی ریشه علف هفت بند معادل با غلظت MBC به موش های گروه پنجم به صورت داخل صفاقی تزریق شد. پس از 7 روز، موش ها با بیهوشی در دسیکاتور حاوی اتر کشته و طحال حیوانات در شرایط استریل خارج و در فسفات بافر سالین استریل به مقدار 5 میلی لیتر هموژنیزه و از سوسپانسیون هموژنیزه طحالی، بر روی محیط مولر هینتون آگار با پورپلیت کردن کشت انجام گرفت. پلیت های در 37 درجه سلسیوس تا 24 ساعت گرما گذاری شدند. پس از آن شمارش کلونی ها صورت گرفت(21). نکته: باکتری استرپتوکوکوس پیوژن قادر به رشد بر روی محیط مولر هینتون آگار نمی باشد، پس برای این باکتری از محیط بلاد آگار استفاده گردید.

تحلیل آماری

تمامی یافته های حاصل از این پژوهش، با آزمون آماری One Way ANOVA تست توکی با سطح احتمال05/0≥ p در نرم افزار آماری SPSS 18 مورد تجزیه و  تحلیل آماری قرار گرفتند و نمودارهای مورد نیاز با نرم افزار Excell 2007 رسم گردیدند.

نتایج

نتایج بررسی اثر ضد میکروبی عصاره ها بر روی استرپتوکوکوس پیوژن، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس به روش انتشار چاهکی در آگار

نتایج مربوط به قطر هاله عدم رشد در پلیت برای استافیلوکوکوس اورئوس و سودومونانس ائروژینوزا نشان می دهند که در غلظت های خالص تا 153/0 میلی گرم بر میلی لیتر عصاره برگی برای باکتری های استافیلوکوکوس اورئوس و سودومونانس ائروژینوزا قطر هاله عدم رشد بیش از 10 میلی متر است که این مطلب نشان دهنده اثر ضد میکروبی قوی عصاره برگ آبی بر روی باکتری ها در غلظت های خالص تا 306/0 میلی گرم بر میلی لیترعصاره برگ اتانولی بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس قطر هاله عدم رشد بیش از 10 میلی لیتر است. در غلظت های خالص تا 23/0 میلی گرم بر میلی لیتر عصاره ریشه اتانولی و عصاره استونی برگ بر روی باکتری استافیلوکوکوس قطر هاله عدم رشد کمتر از 10میلی متر است. بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره ها بر روی استرپتوکوکوس پیوژنز و کلبسیلا پنومونیه، به روش انتشار چاهکی در آگار نشان داد که عصاره های خالص اتانولی برگ و ریشه و هم چنین عصاره خالص استونی ریشه روی کلبسیلا پنومونیه اثر ضد میکروبی دارد. اما هیچ کدام از عصاره ها با رقت های مختلف یا خالص درآگار بر استرپتوکوکوس پیوژنز اثر ضد میکروبی ندارد(جدول 2).

نتایج تعیین MIC و MBC عصاره های علف هفت بند بر باکتری های استرپتوکوکوس پیوژن، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس به روش رقت در براث 

عصاره های اتانولی برگ بر روی استافیلوکوکوس اورئوس و ریشه بر سودومونانس آئروژینوزا و نیز عصاره خالص استونی ریشه روی کلبسیلا پنومونیه اثر ضد میکروبی دارد و اختلاف معنی داری نسبت به گروه کنترل مشاهده می شود. اما هیچ کدام از عصاره ها بارقت های مختلف یا خالص در آگار بر استرپتوکوکوس پیوژنزاثر ضد میکروبی ندارد(جدول 3).

نتایج بررسی اثر ضد میکروبی عصاره های هفت بند بر روی موش های BALB/c آلوده با باکتری های استرپتوکوکوس پیوژنز، کلبسیلاپنومونیه، سودومونانس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس

در این بررسی، تعداد باکتری های رشد کرده بر روی مولرهینتون آگار(برای باکتری استرپتوکوک پیوژن، محیط بلاد آگار) 24 ساعت پس از کشت سوسپانسیون طحالی تهیه شده از موش های Balb/c آلوده به سویه های باکتریایی که به عصاره های اتانولی، استونی و آبی برگ وریشه علف هفت بند(بهترین MBC) و گروه کنترل با نرمال سالین استریل تیمار شده بودند، انجام گردید تحلیل آماری نشان داد که بر روی کلبسیلا پنومونیه عصاره های اتانولی و آبی برگ به ترتیب درمدل حیوانی اثر ضد میکروبی بیشتری نسبت به عصاره استونی دارند و برروی استرپتوکوکوس پیوژنز، عصاره اتانولی ریشه اثر ضد میکروبی بیشتری نسبت به سایرعصاره ها داشت. عصاره های اتانولی برگ و آبی ریشه به ترتیب موثرترین عصاره بر روی استافیلوکوکوس اوروئوس و سودومونانس آئروژینوزا می باشد(جدول 4).

بحث و نتیجه گیری

عصاره برگ های علف هفت بند دارای اثر باکتری کشی بر روی طیف وسیعی از باکتری های گرم منفی( اشریشیا کلی، انتروباکتر فکالیس، کلبسیلا پنومونیه، پروتئوس میرابیلیس، سودوموناس آئروژینوزا ، سالمونلا پاراتیفی و سالمونلا تیفی) و باکتری های گرم مثبت ( باسیلوس سوبتیلیس و استافیلوکوکوس اورئوس) را دارد. دراین تحقیق خاصیت میکروب کشی این گیاه روی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی را به وجود طیف گسترده ترکیبات ضد میکروبی در آن دانستند(25، 21). در تحقیق انجام شده اخیر نیز از روش انتشار چاهکی برای بررسی اثرات ضد میکروبی عصاره­های علف هفت بند استفاده شده اندازه گیری قطر هاله عدم رشد، حاکی از مقاوم بودن استرپتوکوکوس پیوژنز در برابر انواع عصاره ها است در حالی که کلبسیلا پنومونیه در برابر عصاره خالص اتانولی برگ حدود 15 میلی متر،عصاره خالص اتانولی ریشه حدود 14 میلی متر و عصاره خالص استونی ریشه حدود 11 میلی مترهاله عدم رشد ایجاد می کند که نشان گر حساسیت کلبسیلا پنومونیه نسبت به این عصاره­ها می باشد. نتایج به دست آمده از این تحقیق تفاوت تأثیر عصاره ها در محیط آگار و محیط براث را نشان می دهد، به طوری که فقط عصاره های خالص در محیط آگار بر روی کلبسیلا پنومونیه موثر بوده و عصاره ها در محیط آگار بر روی استرپتوکوکوس پیوژنز، موثر نبودند ولی در محیط براث حتی با وجود رقت عصاره ها روی هر دو باکتری موثر بودند. این مسئله حاکی از آن است که سرعت و میزان حلالیت عصاره ها در محیط، روی خاصیت ضد میکروبی عصاره ها اثر می گذارد و نشان می دهد این عصاره ها توانایی انتشار خوب در آگار را ندارند. مقایسه نتایج MIC و MBC عصاره های علف هفت بند با روش ماکرودیلوشن در محیط کشت مولر هینتون براث و نتایج مدل حیوانی در کلبسیلا پنومونیه نشان می دهد که نتایج شرایطازمایشگاهی و مدل حیوانی با یک دیگر مطابقت دارد ، به این معنی که در نتایج MIC نیز مشاهده شد که عصاره اتانولی وآبی برگ مؤثرترین عصاره ها در روش رقت در براث نسبت به عصاره استونی بود وهمین طور در مدل حیوانی نیز عصاره اتانولی و آبی برگ مؤثرترین عصاره ها نسبت به عصاره استونی بود.:

 

 

جدول 2- اثرات عصاره های آبی -آلی برگ و ریشه علف هفت بند بر روی قطر هاله عدم رشد باکتری های بیماری زا مقاوم به انتی بیوتیک

قطر هاله عدم رشد(میلی متر)
نوع عصاره	عصاره برگ
	خالص	1:2	1:4	1:8	خالص	1:2	1:4
استافیلوکوکوس اورئوس
عصاره اتانولی (92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	18/3 ± 27	65/2 ± 23	2/2 ± 20	-	45/2 ± 20	3/2 ± 17	45/0 ± 7
عصاره استنی (92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	45/2 ± 15	12/1 ± 10	46/0 ± 5	-	-	-	-
عصاره آبی (224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)	3/1 ± 29	75/0 ± 20	59/0 ± 12	98/0 ± 5	-	-	-
سودومونانس ائروژینوزا
عصاره اتانولی (920/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	59/1 ± 10	-	-	-	1/1 ± 12	95/0  ± 7	-
عصاره استنی (92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	-	-	-	-	-	-	-
عصاره آبی (224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)	56/0 ±21	46/0 ± 18	5/0 ± 5/14	04/0 ± 5	-	-	-
کلبسیلا پنومونیه
عصاره اتانولی (920/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	11/1 ± 15	-	-	-	81/0 ± 14	-	-
عصاره استنی (92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	-	-	-	-	81/0 ± 11	-	-
عصاره آبی (224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)	-	-	-	-	-	-	-
استرپتوکوکوس پیوژنز
عصاره اتانولی (920/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	-	-	-	-	-	-	-
عصاره استنی (92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	-	-	-	-	-	-	-
عصاره آبی (224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)	-	-	-	-	-	-	-

 

 

 

 

 

جدول 3- اثرات عصاره های آبی -آلی برگ و ریشه علف هفت بند بر عملکرد عصاره، حداقل غلظت بازدارنده (MIC) و( MBC ) باکتری های بیماریزا مقاوم به انتی بیوتیک

اندام
نوع عصاره	اتانولی(92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	استونی(92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	آبی(224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)	اتانولی(224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)	استونی(92/0 میلی گرم برمیلی لیتر)	آبی(224/1 میلی گرم بر میلی لیتر)
سودومونانس ائروژینوزا
MIC(mg/ml)	230	460	612	475	253	217
MBC(mg/ml)	460	460	612	475	253	325
استافیلوکوکوس اورئوس
MIC(mg/ml)	57	115	153	118	435	253
MBC(mg/ml)	115	230	306	237	435	506
کلبسیلا پنومونیه
MIC(mg/ml)	57	-	71	120	482	-
MBC(mg/ml)	113	-	142	240	482	-
استرپتوکوکوس پیوژنز
MIC(mg/ml)	453	227	568	241	-	-
MBC(mg/ml)	453	452	568	482	-	-

 

جدول 4- اثر عصاره های علف هفت بند بر روی میانگین رشد باکتری های مقاوم به انتی بیوتیک در طحال موش های آلوده

	استافیلوکوکوس اورئوس	سودومونانس آئروژینوزا	کلبسیلاپنومونیه	استرپتوکوکوس پیوژنز
کنترل	73/1 ± 107× 9/2	1/3 ± 1010 × 06/5	1/1 ± 1010 × 3/7	4/1 ± 1012 × 7
برگ اتانولی	51/1 ± 104 × 5/7	2/3 ± 105 × 2/6	5/1 ± 103 × 5/7	-
برگ آبی	-	-	-	-
برگ استونی	5/1 ± 106 × 36/5	-	-	3/2 ± 108 × 7/5
ریشه آبی	-	28/2 ± 103 × 8/2	1 ± 104 × 2	-
ریشه اتانولی	-	-	-	3 ± 107 ×3/6

 

 

مقایسه بررسی نتایج روش انتشار چاهکی در آگار و مدل حیوانی روی باکتری های مورد آزمایش، تأثیر زیاد عصاره ها در مدل حیوانی را تأیید می کند که نشان دهنده توانایی کم انتشار در آگار عصاره ها و قدرت زیاد آن ها در استفاده بالینی است. در سال 2001 Gonzalez Bengne  و همکارانش عصاره علف هفت بند را روی التهاب لثه در مردان بررسی کردند گزارش نمودند که اثرات ضد باکتریایی و ضد التهابی عصاره در شستشوی دهان قابلیت باکتری کشی بر روی باکتری­های گرم مثبت و گرم منفی دارند. نتیجه کلی که از این تحقیق به دست آمد این بود که عصاره علف هفت بند دارای خواص ضد التهاب ، آنتی گلیکولیتیک می باشد و به عنوان دهان شویه در کنترل التهاب لثه موثر می باشد . نتایج پژوهش ما هم نشان دهنده آن است که می توان بیان نمود که این عصاره ممکن است با تخریب ساختار دیواره موجب از بین بردن باکتری شود(9). در سال2010 در مصر Hediat M.H.salam وNajat Marraiki به تاثیر عصاره های آبی و آلی علف هفت بند روی با کتری های گرم مثبت و گرم منفی پرداختند در این تحقیق عصاره های استونی، اتانولی، کلروفورمی و آبی گیاه تهیه شد. قطر منطقه مهاری علیه باکتری های گرم منفی که شامل اشر یشیاکلی، پروتئوس میرابلیس، سودوموناس آئروژینوزا، سالمونلا تیفی، شیگلا فلکسنری و باکتری های گرم مثبت که شامل استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس، استریتو کوکوس و کاندیدا آلبیکانس با متد انتشار دیسک کاغذی ارزیابی شد. هم چنینMIC و MBC عصاره ها نیز بررسی گردید که نتایج زیر به دست آمد(12). بیشترین تاثیر( قطر منطقه مهاری28 میلی متر) توسط عصاره های کلروفرمی ساقه علیه پروتئوس میرابیلیس مشخص شده در حالی که کم­ترین تاثیر(قطر منطقه مهاری2 میلی متر) مربوط به عصاره های آبی علیه استافیلوکوکوس اورئوس مشخص شده. عصاره­های برگ ها عموماً کم ترین تاثیر را علیه میکروارگانیسم های آزمایش شده در مقایسه با عصاره­های ساقه داشتند. در این تحقیق اثر عصاره اتانولی برگ، ریشه این گیاه تاثیر معنی داری نسبت سایر گروه ها دارد. استافیلوکوکوس اورئوس بالاترینMIC  (mg/ml18) و بالاترینMBC  (mg/ml20) را داشت در حالی که با سیلوس سو بتیلیس کمترین MIC و MBC را داشت(18 میلی گرم بر میلی لیتر) این عصاره ها روی قارچ ها هم موثر بودند به جز کاندیدا آلبیکانس. آسپرژیلوس فلاووس ، بالاترین مقدارMIC (mg/ml8) و بالا ترینMBC (mg/ml10) را در عصاره برگ داشتند در حالی که پایین ترین مقدار MIC و MBC را آسپرژیلوس نایجر نشان داد(mg/ml8) و نیز Hediat گزارش نمودکه اثر عصاره کلروفرمی برگ این گیاه نسبت به عصاره ساقه بیش تر است که با نتایج اثر عصاره برگی نسبت به عصاره ریشه­ای این پژوهش هم خوانی دارد(28، 12). در بررسی اثرات ضد میکروبی عصاره های گیاه به لیمو بر روی استرپتوکوکوس پیوژنز وکلبسیلاپنومونیه مشخص شد که میزان MIC و MBC عصاره های این تحقیق نشان داد که عصاره اتانولی بهترین اثر را روی کلبسیلا پنومونیه دارد که بانتایج ما هم خوانی دارد. در ضمن اثر عصاره های به لیمو بر روی استرپتوکوکوس پیوژن بهتر از تأثیر این عصاره ها روی کلبسیلاپنومونیه است، اما در تحقیق انجام شده اخیر اثر عصاره های علف هفت بند روی کلبسیلا پنومونیه بهتر از استرپتوکوکوس پیوژنز می باشد. اما تأثیر عصاره به لیمو بر روی استرپتوکوکوس پیوژنز بهتر از اثر آن روی کلبسیلا پنومونیه است. که نشان می دهد باکتری های گرم منفی در مقابل ترکیبات ضد میکروبی در مقایسه با باکتری­های گرم مثبت مقاوم تر بودند که ممکن است به دلیل وجود غشای خارجی در ساختمان دیواره سلولی باشد. اما در این تحقیق نتایج به دست آمده از میزان MIC  وMBC  انتشار چاهکی ومدل حیوانی،کلبسیلا پنومونیه با وجود گرم منفی بودن نسبت به استرپتوکوکوس پیوژنز که گرم مثبت است حساسیت بیشتری به عصاره ها دارد. این مسئله گویای آن است که فقط وجود غشای خارجی تنها دلیل مقاوم بودن باکتری ها به عصاره ها نیست بلکه عوامل دیگری هم تأثیر گذارند. مقایسه نتایج مدل حیوانی تاثیر بهینه عصاره های اتانولی به لیمو روی کلبسیلاپنومونیه را تأیید می کند که مطابق با نتایج مربوط به عصاره اتانولی علف هفت بند بر روی کلبسیلاپنومونیه است. در هر دو مطالعه تأثیر ضعیف عصاره های آبی در مدل حیوانی مشاهده شده است(8). نتایج مدل حیوانی عصاره های اوکالیپتوس و نانوذرات نقره که بر روی استرپتوکوکوس پیوژنز وکلبسیلاپنومونیه انجام گرفت تأثیر بهتر عصاره­های اتانولی وتأثیر ضعیف عصاره های آبی را تأیید می کند(22). اکثر مطالعات نشان می دهد که حساسیت باکتری های گرم منفی در مقابل ترکیبات ضد باکتریایی در مقایسه با باکتری های گرم مثبت کم­تر است که ممکن است به خاطر وجود غشای خارجی در ساختمان دیواره سلولی شان باشد. اثر مواد ضد میکروبی در غلظت کشنده ممکن است مستقیماً بر غشاء(نفوذپذیری و ساختار غشاء ) یا بر متابولیسم سلول باشد(26). اما در مطالعه اخیر دیده شد حساسیت کلبسیلا پنومونیه با وجود گرم منفی بودن و داشتن کپسول بزرگ نسبت به استرپتوکوکوس پیوژنز بیشتر بودکه شاید مؤید وجود مکانیسم های کشندگی دیگری در عصاره ها می باشد. اثرضد میکروبی عصاره­های برگ و ریشه علف هفت بند در برابر باکتری کلبسیلا پنومونیه که گرم منفی بوده وبه بیشتر آنتی بیوتیک ها مقاوم می باشد واز طرفی دارای کپسول بزرگی است که در برابر فاگوسیتوز مقاومت می کند، بسیار ارزشمند است. بنابر این می توان از این عصاره ها در برابر باکتری های شایع کپسول دار و مقاوم به آنتی بیوتیک های سنتتیک که عوارض جانبی فراوانی هم دارند بررسی بیشتری شود. نتایج این بررسی نشان داد که عصاره های آبی، اتانولی و استونی استخراج شده از گیاه دارویی علف هفت بند در شرایط آزمایشگاهی و مدل حیوانی دارای فعالیت ضد میکروبی و باکتری کشی علیه باکتری های کلبسیلا پنومونیه و استرپتوکوکوس پیوژنز می باشند. با توجه به نتایج به دست آمده، MIC وMBC انواع عصاره های آبی و اتانولی و استونی برگ وریشه علف هفت بند برای میکروارگانیسم های مذکور متفاوت بوده و سه میکروارگانیسم نتیجه یکسانی نشان ندادند،کلبسیلا پنومونیه نسبت به استرپتوکوکوس پیوژنز حساسیت بیشتری به رقت های مختلف عصاره ها از خود نشان داد نیز به تمامی عصاره ها در همه رقت ها مقاوم بود. در این مطالعه مشخص شد که کلبسیلا پنومونیه به عصاره­های برگ استونی و ریشه آبی و استرپتوکوکوس پیوژنز به عصاره های ریشه استونی وریشه آبی مقاومند. در کلبسیلا پنومونیه عصاره های برگ اتانولی و برگ آبی، و در استرپتوکوکوس پیوژنز عصاره های برگ استونی و ریشه اتانولی به ترتیب بهترین اثر ضد میکروبی را نسبت به عصاره های دیگر دارند. این عصاره ها در مقابل باکتری های گرم مثبت و منفی اثر دارد و از بین این باکتری ها روی باکتری گرم منفی بیش ترین تأثیر را دارد و اثر ضد باکتریایی در کم ترین غلظت کاهش می یابد.

 

مراجع

1.Al-Aboudi, A., Afifi, F.U. (2011). Plants used for the treatment of diabetes in Jordan: A review of scientific evidence. Pharmceutical Biology, 49; 221-239.

2.Ahmadvand, H.; Amiri, H.; Dalvand, H. Bagheri, S.H. (2013). Various antioxidant properties of essential oil and hydroalcoholic extract of Artemisa persica. Journal of Birjand University of Medical Sciences, 20(2); 68-78.

3.Asgari Jahromi, M.; Movahedin, M.; Amanloo, M.; Mowla, G.; Mazaheri, Z., Batouli, H. (2013). The effects of Calli gonum extract on sperm parameters and the rate of apoptosis in aged male mice testis tissue. Modares Journal of Medical Sciences: Pathobiology, 16(1); 25-38.

4.Asgari Jahromi, M., Movahedin, M., Amanloo, M., Mowla, G., Mazaheri, Z., Batouli, H. (2013). The effects of Calli gonum extract on sperm parameters and the rate of apoptosis in aged male mice testis tissue. Pathobiology Research, 16; 41-54.

5.Badria, F.A., Ameen, M., Akl, M.R. (2007). Evaluation of cytotoxic compounds from Calligonum comosum L. growing in Egypt. Zeitschrift für Naturforschung C, 62; 656-660. 6.Bleys, J., Miller, E.R. Pastor-Barriuso, R., Appel, L.J., Guaiiar, E. (2006). Vitamin mineral supplement progression of atherosclerosis: a meta-analysis of randomized controlled trials. American Journal of ClinicalNutrition, 84; 880-887.

7.Cerutti, PA. (1994). Oxy-radicals and cancer. Lancet, 344; 862-863.

8.Ghassempuor, N., Nasiri Semnani, Sh. (2020). Evaluation of the antimicrobial effect of Lemon verbena leaves extracts on Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae and Brucella melitensis in vitro and animal model study. The Quartrely Journal of Animal Physiology and Development, 51(13);87-98.

9.Gonzalez Begne, N., Yslas, E., Reyes, V. (2001). Clinical effect of a Maxican sanguinaria extract (Polygonum avicular L.) on gingivitis. Journal of Ethnopharmacology, 74; 45-51.

10.Grzesik, M., Naparlo, K., Bartosz, G., Sadowska-Bartosz, I. (2018). Antioxidant properties of catechins: Comparisonwith other antioxidants. Food Chem., 241; 480–492. [CrossRef]

11.HSU, CY. (2006). Antioxidant activity of extract from Polygonum aviculare L. Biol Res, 39; 281-288.

12.Hediat, M.H. (2008). Salama and najat marraiki, antimicrobial activity and phytochimical analysis of Polygonum aviculare L.(polygonceae). Naturally Growing in Egypt, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3); 2008-2015.

13.Japooni, A., Alborzi, A., Orafa, F., Rasouli, M., Farshad, S. (2004). Distribution patterns of methicillin resistance genes (mecA) in Staphylococcus aureus isolated from clinical specimens. Iranian Biomedical Journal, 8; 173-178.

14.Justesen, U., Knuthsen, P. (2001). Composition of flavonoids in fresh herbs and calculation of flavonoid intake by use of herbs in traditional Danish dishes. Food Chemistry, 73(2); 245-50

15.Kumagai, H.; Kawai, Y.; Sawano, R.; Kurihara, H.; Yamazaki, K.; Inoue, N. (2005). Antimicrobial substances from rhizomes of the giant knotweed Polygonum sachalinense against the fish pathogen Photobacterium damselae subsp piscicida. Z. Naturforsch. C, 60; 39–44. [CrossRef] [PubMed]

16.Kähkö nen, MP., Hopia, A., Vuorela, HJ., Rauha, J., Pihlaja, K., Kujala, T. (1999). Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. J Agric Food Chem, 47; 3954-3962.

17.Kruawan, K., Kangsadalampai, K. (2006). Antioxidant activity, phenolic compound contents and antimutagenic activity of some water extract of herbs. Thai J Pharm Sci, 30; 28-35.

18.Knekt, P., Kumpulainen, J., Järvinen, R., Rissanen, H., Heliövaara, M., Reunanen, A. (2002). Flavonoid intake and risk of chronic diseases. American Journal of Clinical Nutrition, 76; 560-8.

19.Liu, X.M., Zakaria, M.N.M., Islam, M.W., Radhakrishnan, R., Ismail, A. and Chen, H.B. 2001. Anti-inflammatory and anti-ulcer activity of Calligonum comosum in rats. Fitoterapia, 72: 487-491.

20.Mohsennezhad, F. (2009). Antibacerial activity of Eukalyptus extracts on methicillin resistance Staphylococcus aureus. Research Journal of Biological Sciences, 4(8); 905-908

21.Naeini, A., Khosravi, A., Tadjbakhsh, H., Ghazanfari, T., Yaraee, R., Shokri, H. (2010). Evaluation of the immune stimulatory activity of Ziziphora tenuior extracts. Comp Clin Pathol, 19; 459-463.

22.Paudel Chhetri, H., Yogol, NS., Sherchan, J., Anupa, KC., Panna Thapa, SM. (2008). Phytochemical and antimicrobial evaluations of  some medicinal plants of nepal. Kathmandu University Journal of Science, Engineering and Thechnology, 1(5); 49-54.

23.Rathore, V.S., Singh, J.P., Bhardwaj, S., Nathawat, N.S., Kumar, M., Roy, M.M. (2015). Potential of native shrubs Haloxylon salicornicum and calligonum polygonoides for restoration of degraded lands in arid western Rajasthan, India. Environmental Management, 55(1); 205-216.

24.Shariatifar, N. (2012). Quantitative and qualitative study of phenolic compounds and antioxidant activity of plant pulicaria gnaphalodes. HMS, 17(4); 35-41. [in Persian]

25.Srinivasan, D., Perumalsamy, L.P., Nathan, S., Sures, T. (2001). Antimicrobial activity of certain Indian medicinal plants used in folkloric medicine. J.Ethnopharam, 49; 217-222.

26.Srivastava, R.L. (2006). Food from forests in arid zone. Compiled by: Non-wood forest products division, Arid Forest Research Institute, Jodhpur, Designed & Published by: R.L. Srivastava (Director, AFRI), Printed by Rajputana Stationery Mart, Jodhpur.

27.Smith, MA., Perry, G., Sayre, LM., Anderson, VE., Beal, MF., Kowall, N. (1996). Oxidative damage in Alzheimer’s. Nature, 382; 120-121.

28.Zhu, X.Y.; Wu, C.H.; Qiu, S.H.; Yuan, X.L.; Li, L. (2017). Effects of resveratrol on glucose control and insulin sensitivity in subjects with type 2 diabetes: Systematic review and meta-analysis. Nutr. Metab., 14; 60. [CrossRef].