تاثیر عصاره گیاه زیرفون(Tilia platyphyllos L.) بر میزان هورمون های جنسی و تغییرات هیستوپاتولوژیک در موش های صحرایی نر سالم و مبتلا به واریکوسل

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

دوره 15، شماره 1 - شماره پیاپی 57، اسفند 1400، صفحه 71-82   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

ریحانه محبعلی¹؛ اکرم عیدی^{* 2}؛ پژمان مرتضوی³؛ محمد امین عدالت منش⁴

¹گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران

²گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران

³گروه پاتولوژی، دانشکده دامپزشکی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران

⁴دانشیار گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران

چکیده

زمینه و هدف: واریکوسل یکی از شایع ترین علل ناباروری در مردان دارد. مطالعات گوناگونی در خصوص درمان واریکوسل و تغییرات هورمونی بیضه ها صورت گرفته است. یکی از درمان های غیرتهاجمی واریکوسل درمان با گیاه زیرفون(Tilia platyphyllos L.) به عنوان یک دارویی در درمان زخم معده، اسپاسم و آرام بخش استفاده می شود. ترکیبات شیمیایی همانند ترپنوئیدها و فلاونوئیدها در گیاه زیرفون شناسایی شده است. هدف بررسی اثر عصاره گیاه زیرفون بر آسیب شناسی بیضه موش های صحرایی سالم و واریکوسلی انجام گرفت.
روش کار: در این تحقیق 48 سر موش صحرایی به صورت تصادفی در 8 گروه تقسیم شدند: کنترل سالم، گروه های سالم دریافت کننده عصاره زیرفون (50، 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن دریافت خوراکی، روزانه)، کنترل نابارور(جراحی واریکوسل)، گروه های واریکوسلی همراه با عصاره زیرفون(50، 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن دریافت خوراکی، روزانه). پس از 60 روز خون­گیری و آزمایشات هورمونی و بافتی بیضه انجام شد و داده ها با آنالیز واریانس یک عاملی ارزیابی شدند.
یافته ها: نتایج نشان داد که میزان هورمون تستوسترون کاهش و میزان هورمون LH و FSH افزایش معناداری در حیوانات کنترل واریکوسل در مقایسه با کنترل سالم نموده است. تیمار عصاره زیرفون از تغییرات هورمون های جنسی جلوگیری کرده و سبب بهبود معناداری در میزان هورمون های جنسی و بافتی حیوانات نابارور شده است.
 نتیجه گیری: ظاهرا زیرفون به عنوان عامل آنتی اکسیدانی در برابر آسیب های القاء واریکوسل در موش صحرایی عمل می کند.

کلیدواژه‌ها

زیرفون؛ واریکوسل؛ بیضه؛ موش صحرایی

اصل مقاله

مقدمه

 

باروری فرآیندی است که تحت تاثیر عوامل مختلفی قرار می گیرد. محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- گناد با کنترل هورمونی در این فرآیند نقش مهمی دارند. اختلال در این محور باعث تغییر در کنترل سنتز هورمون های جنسی و موجب بروز اختلالاتی در سیستم تولید مثلی و ناباروری می شود(33). یکی از شایع ترین ناهنجاری­های ساختاری دستگاه تناسلی در باروری مردان، واریکوسل است که باعث اتساع و پیچش غیرطبیعی وریدهای اسکروتوم در شبکه پمپینیفرم می شود(36). واریکوسل در 15 درصد مردان سالم و تا 35 درصد مردان مبتلا به ناباروری اولیه شناخته شده است(4). واریکوسل از نظر شدت و پیشرفت در سه درجه طبقه بندی می گردد:

درجه 1: وریدها هنگام زور زدن قابل لمس می باشد.

درجه 2: وریدها در حالت ایستاده قابل لمس می­باشد.

درجه 3: وریدها در حالت ایستاده قابل مشاهده می­باشد(15).

بیضه ها چندین هورمون جنسی مردانه ترشح می­کنند که روی هم آندروژن ها نامیده می شوند. واریکوسل می­تواند در روند تولید هورمون های جنسی بیضه اختلال ایجاد کند(33). اختلال در محور هیپوفیز- گناد باعث ریفلاکس متابولیت های کلیه یا آدرنال به ورید اسپرماتیک داخلی و افزایش در فشار هیدروستاتیک توام با ریفلاکس وریدی باعث تاثیرات واریکوسل بر عملکرد بیضه می شود(15،16) در سال های اخیر، بسیاری از مطالعات نشان دادند که واریکوسل از دیدگاه­های مختلفی، تأثیر بر اسپرماتوژنز و محورهای هورمونی جنسی داشته است(12). واریکوسل عامل اصلی اختلال در اسپرماتوژنز و شایع ترین علت قابل اصلاح ناباروری مردان است(10). واریکوسل باعث افزایش دمای بیضه ها شده و می تواند عملکرد سلول لیدیگ بیضه را با کاهش پی در پی تولید تستوسترون مختل کند(23،31). اختلال در عملکرد سلول لیدیگ، متعاقباً باعث افزایش سطح هورمون های FSH و LH سرم می شود LH و FSH هورمون های اولیه هیپوفیز هستند که عملکرد بیضه ها را تنظیم می کنند(19). درمان واریکوسل با واریکوسلکتومی می تواند پتانسیل باروری را افزایش دهد(42). واریکو سلکتومی رایج ترین روش درمان ناباروری ناشی از واریکوسل است و دمای اسکروتوم را در مردان نابارور کاهش می دهد. بسیاری از مطالعات گزارش می دهند که واریکوسلکتومی می­تواند با افزایش تستوسترون باعث بهبود عملکرد سلول­های لیدیگ شود و سطح هورمون های FSH و LH را کاهش دهد(6). با توجه به عوارض واریکوسلکتومی که شامل ایجاد هیدروسل(آب آوردگی بیضه) و آتروفی بیضه است، ضرورت درمان ناباروری با عارضه واریکوسل نیاز به روش های درمانی جدید و غیر تهاجمی را مطرح ساخته و آن استفاده از عوامل آنتی اکسیدانی است که می تواند در درمان این گونه بیماران موثر واقع شود. آنتی اکسیدان ها ترکیبات با موادی بوده که باعث خنثی کردن و سرکوب تشکیل رادیکال های آزاد اکسیژن(ROS) و یا ممانعت از اعمال آن­ها می­شوند. با این حال، درمان آنتی اکسیدانی نیز به عنوان یک روش جدید می تواند به جای روش جراحی واریکوسلکتومی در نظر گرفته شود(39). اخیراً مطالعاتی با هدف درمان جایگزین برای بهبود شرایط واریکوسل انجام شده است. این مطالعات اثرات مثبت قابل توجه داروها و عصاره های گیاهی در درمان ناباروری مردان مبتلا به واریکوسل را اثبات کرده اند(6). استفاده از گیاهان دارویی در بسیاری از کشورهای توسعه یافته و در حال توسعه به سرعت در حال افزایش است(21). تاکنون تحقیقات بسیاری با استفاده از عصاره های گیاهی مختلف بر روی محور هورمونی گناد و پارامترهای بیضه انجام شده است. که عصاره های گیاهی نقش موثری در محور هیپوتالاموس- هیپوفیز- گناد دارند که سبب تغییراتی در میزان هورمون های تستوسترون، LH و FSH می شوند و در نهایت باعث افزایش پارامترهای بیضه ای می شوند(22). هورمون FSH بر تنظیم عملکرد سلول­های سرتولی عمل اسپرماتوژنز را تنظیم می کند و هورمون LH فعالیت سلول های لایدیگ را کنترل می­کند(13). مطالعات زیادی نشان داده است که ارتیاط معنی داری بین سطح هورمون تستوسترون سرم و واریکوسل وجود دارد(7،30). سطح سرمی هورمون تستوسترون در افراد مبتلا به واریکوسل به طور معناداری پایین تر از افراد عادی بوده است(40). با توجه به درگیری بیضه در بیماری واریکوسل و احتمال تغییر عملکرد سلول های لیدیگ، احتمال تغییر در ترشح هورمون ها وجود دارد(18). واریکوسل از طریق افزایش غیرطبیعی دمای بیضه ها منجر به کاهش سطح هورمون تستوسترون می شود. واریکوسل هم چنین می تواند سطح تستوسترون را از طریق استرس اکسیداتیو و اختلال در سنتز آندروژن ها کاهش دهد. کمبود تستوسترون منجر به کاهش عملکرد جنسی، اختلال نعوظ و انزال، افسردگی، اختلال خواب، حساسیت به سندرم متابولیک، کم خونی، افزایش لپتین و اختلال وازوموتور می شود(20،45). Kaneko و همکارانش در سال 2007 واریکوسلکتومی بر روی افراد انجام دادند. آن ها دریافتند که رشد بیضه(جلوگیری از آتروفیه شدن بیضه) در پسران پس ازواریکوسلکتومی ایجاد شده است. سطح هورمون FSH در پسران با رشد قابل توجه بیضه، کم­تر از پسران بدون رشد بیضه ای بوده است. بهبود غلظت اسپرم در مردان پس از واریکوسلکتومی مشاهده شد. سطح هورمونیFSH سرم ممکن است پارامتر مناسب برای رشد و عملکرد بیضه ها پس از واریکوسلکتومی باشد(27). سطح هورمون های FSH و LH سرم قبل از واریکوسلکتومی بیشتر بوده است(38). گیاه زیرفون با نام علمی(Tilia platyphyllos)، درختی از تیره پنیرکیان(Malvaceae) راسته پنیرک سانان(Malvales) است. بیشتر در جنگل های نیمکره شمالی در اروپا، آسیا، مرکز و شرق شمال امریکا می باشد(17).گیاه زیرفون به عنوان گیاهی برای سم زدایی بدن معرفی کرده اند. هم چنین از نظر خواص دارویی و درمانی طی تحقیقاتی که انجام شده دارای اثرات آرامبخشی، اشتهاآور، مدر(47) ضد اسپاسم، خلط آور، درمان میگرن و سرفه(14) و هم چنین دارای اثرات موثری در بی خوابی، روماتیسم(48) می باشد. این ویژگی به دارا بودن انواع مختلف ترکیبات فیتوشیمیایی شامل ویتامین ها، کاروتنوئیدها، ترپنوئیدها، آلکالوئیدها، فلاونوئیدها، لیگنان ها، فنل های ساده و اسیدهای فنولی و غیره مربوط می شود(43). مواد موثره در گل زیرفون ازجمله فلاونوئیدها سبب کاهش خطر ابتلا به اختلال های مختلف از جمله سرطان و بیماری­های قلبی - عروقی می شود. فعالیت آنتی اکسیدانی، ضدالتهابی و ضدتوموری در گیاهانی از جمله گیاه زیرفون دیده می شود(8). بنابراین فعالیت آنتی اکسیدانی گیاه زیرفون با مقادیر بالای ترکیبات فنلی، به ویژه مشتقات کوئرستین(ایزوکوئرستین- روتین و آستراگالین و فلاونوییدهای اصلی برگ، کوئرستین3-7- دی رامنوزید و کامپفرول-3-7 دی رامنوزید هستند) ارتباط مستقیمی دارد. با این وجود، اثر قوی پاک کننده رادیکال های آزاد گیاه زیرفون، به ویژه گلیکوزیدهای کوئرستین(روتین، کوئرسیترین و ایزوکوئسیترین)، گلیکوزیدهای کامپرول و اسیدهای فنلی(کافئین، اسیدهای کوماریک و کلروژنیک) قبلاً نشان داده شده است. هم چنین، گل زیرفون حاوی موسیلاژ، p- کوماریک اسید، کامپفرول، ترپنویی و کوئرستین و روغن های فرار مانند سیترال، سترونلول، ائوژنول و لیمونن است(28). گیاه زیرفون پتانسیل زیست شناختی بالایی از لحاظ فعالیت آنتی اکسیدانی، ضدالتهاب و ضد توموری دارد و اثر سمیت سلولی ندارد(25). آنتی اکسیدان ها با منشاء گیاهان دارویی ممکن است اثر خود را بر سیستم های بیولوژیکی را کاهش داده اند. گیاهان دارویی مقادیر قابل توجهی از آنتی اکسیدان ها نظیر فلاونوئیدها، فنول ها، ترکیبات فنولی و آلکالوئیدها را تولید می کنند که بدن را از استرس اکسیداتیو محافظت می کنند. نتایج بررسی های انجام شده حاکی از آن است که گیاه زیرفون حاوی فلاونوئیدها می باشد(47) و هم چنین با تحقیقاتی که Yayalaci و همکارانش در سال 2014 انجام دادند از نقش آنتی اکسیدانی گیاه زیرفون در برابر استرس اکسیداتیو گزارش می کند(46). در تحقیق حاضر تاثیر عصاره گیاه زیرفون بر آسیب شناسی هورمون های بیضه در موش های صحرایی نر سالم و مبتلا به واریکوسل بررسی شد.

مواد و روش ها

آماده سازی عصاره

در پژوهش تجربی حاضر، برگ گیاه زیرفون از عطاری خریداری شد و سپس آسیاب گردید و به صورت پودر تهیه شد. پودر حاصله با استفاده از اتانول 80 درصد عصاره گیری شد و محصول حاصله توسط روتاری (Rotary) تغلیظ گردید(41).

حیوانات آزمایشگاهی

تعداد 48 سر موش های صحرایی نر بالغ(Rat) نژاد ویستار(Wistar) با وزن حدود 220-250 گرم از انستیتو پاستور خریداری گردید و در شرایط استاندارد(12 ساعت تاریکی و 12 ساعت روشنایی و دمای 2±23 درجه سانتی گراد و رطوبت 40 تا 60 درصد و دسترسی آزاد به آب و غذا) نگهداری شدند.

القای واریکوسل در حیوانات

برای القاء واریکوسل در بیضه چپ موش های صحرایی نر از روش ترنر(Turner) استفاده شد(44). پس از القاء بیهوشی با تزریق درون صفاقی(IP) مخلوط کتامین 10 درصد(دوز 50 میلی گرم بر کیلوگرم، مرک، آلمان) و زایلازین 2 درصد(دوز 10 میلی گرم بر کیلوگرم، مرک، آلمان) موش ها به پشت قرار داده و یک برش میدلاین عمودی در شکم در حدود 4-3 سانتی متر ایجاد شد. پس از مشاهده ورید کلیوی چپ و محل ورود ورید اسپرماتیک داخلی به آن، به آرامی اطراف آن آزاد گردید و یک آنژیوکت شماره 20 به موازات ورید قرار داده شد و با نخ بخیه سیلک 0-4 روی ورید کلیوی چپ گره زده شد. طبق متد Koksal قطر ورید کلیه چپ حدود 50% کاهش خواهد داد. سپس محل برش با نخ بخیه 0-3 در دو لایه (عضله و پوست) بخیه زده شد.

گروه های مورد مطالعه

موش ها در 8 گروه 6 تایی: کنترل سالم، کنترل نابارور(جراحی واریکوسل)، گروه تجربی سالم و گروه تجربی نابارور دسته بندی شدند

گروه کنترل سالم که فقط آب و غذا دریافت کردند.

گروه کنترل نابارور تحت عمل واریکوسل قرار گرفتند و هیچ گونه تیماری دریافت نکردند.

گروه های تجربی سالم، عصاره اتانولی گیاه زیرفون را در دوزهای 50، 100، 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن موش به صورت گاواژ(در حجم 5/0 میلی لیتر) دریافت کردند(11).

گروه های تجربی نابارور، علاوه بر القاء واریکوسل، عصاره گیاه زیرفون با دوز 50، 100 و200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن موش به صورت گاواژ(در حجم 5/0 میلی لیتر) دریافت کردند. مدت تیمار 60 روز بود(46). سپس نمونه های خونی از قلب حیوانات گرفته شده و با دور rpm 3000 به مدت پنج دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس سرم آن ها در دمای 80- درجه سانتی گراد گرفته شده و اندازه گیری سطح هورمون های FSH، LH و تستوسترون با کیت الایزا(ELISA Kits) اندازه گیری شد(32).سپس بیضه ها از ناحیه اپی دیدیم جدا شدند. بیضه ها به ظرف های حاوی محلول فیکساتور بوئن انتقال یافتنه و هر کدام کدگذاری شدند و مطابق با روش های معمول بافت شناسی از نمونه های مورد نظر بلوک های پارافینی تهیه شد. برش و رنگ آمیزی هماتوکسیلین هاریس – ائوزین(H & E) انجام شد. تغییرهای هیستوپاتولوژیک( وضعیت لوله های اسپرم ساز، تعداد اسپرماتوسیت، اسپرماتوزوآ و اسپرماتید) بررسی شد. بافت بیضه براساس شاخص جانسون ارزیابی گردید(26).

10- اسپرماتوژنزیس کامل همراه با لوله های اسپرم ساز سازمان یافته است.

9- تعداد زیادی اسپرماتوزوآ مشاهده می شود، ولی سازمان یابی اسپرماتوژنزیس و لوله ها کامل نیست.

8- فقط تعدادی اسپرماتوزوآ مشاهده می شود.

7-تعداد زیادی اسپرماتوسیت بدون حضور اسپرماتوزوآ مشاهده می شود.

6- فقط تعدادی اسپرماتید مشاهده می شود.

5- تعداد زیادی اسپرماتوسیت بدون حضور اسپرماتید مشاهده می شود.

4- فقط تعداد کمی اسپرماتوسیت مشاهده می شود.

3- فقط اسپرماتوگونی مشاهده می شود.

2- هیچ جرم سلی مشاهده نمی شود.

1- نه جرم سلی و نه سلول سرتولی مشاهده نمی شود.

تحلیل آماری

داده های به دست آمده با استفاده از نرم افزار SPSS-20 و توسط آزمون آنالیز واریانس یک طرفه(one-way ANOVA) و پس آزمون توکی(Tukey) بررسی گردید. نتایج به صورت میانگین± انحراف از معیار ارائه گردید. ملاک استنتاج آماری 05/0≥ p در نظر گرفته شد.

نتایج

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تیمار عصاره گیاه زیرفون در دوزهای 50، 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن تغییر معناداری بر سطح هورمون تستوسترون، LH و FSH موش های سالم در مقایسه با کنترل سالم ایجاد ننموده است. نتایج تحقیق نشان داد که میزان هورمون تستوسترون در حیوانات کنترل واریکوسل شده در مقایسه با کنترل سالم کاهش معناداری (001/0≥ p ) نموده است. نتایج تیمار عصاره گیاه زیرفون در دوزهای 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن بر سطح هورمون تستوسترون در مقایسه با کنترل واریکوسل افزایش معناداری (001/0≥ p ) نموده است. نتایج تحقیق نشان داد که سطح هورمون LH و FSH در حیوانات کنترل واریکوسل شده در مقایسه با کنترل سالم افزایش معناداری (001/0p<، (01/0≥ p ) نموده است. نتایج تیمار عصاره گیاه زیرفون در دوزهای 100 و 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن برسطح هورمون LH و FSH در مقایسه با کنترل واریکوسل کاهش معناداری (001/0p< ، 01/0≥ pو 05/0≥ p ) نموده است(جدول 1). هم چنین نتایج بافت شناسی در 3 گروه کنترل سالم، گروه کنترل نابارور تحت عمل واریکوسل و گروه تجربی نابارور که عصاره گیاه زیرفون با دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن دریافت کردند به این صورت است. در گروه کنترل سالم ضایعه خاصی در بافت بیضه مشاهده نشد. اسپرماتوژنزیس کامل همراه با لوله های اسپرم ساز سازمان یافته مشاهده شد و در داخل لوله های اسپرم – ساز، اسپرماتوسیت، اسپرماتید و اسپرماتوزوآ مشاهده شد. همچنین سلول های بینابینی قابل مشاهده می باشند(شکل 1- الف و ب). هم چنین در گروه کنترل نابارور در داخل لوله های اسپرم ساز تقریبا تمامی سلول­ها دژنره شده و فقط تعداد کمی اسپرماتوگونی مشاهده شد(شکل 1- پ و ت ). در گروه تجربی نابارور تیمار شده با عصاره زیرفون با دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن در لوله های اسپرم ساز تعداد زیادی اسپرماتوسیت بدون حضور اسپرماتوزوآ و تعداد قابل توجهی اسپرماتید مشاهده شد(شکل 1- ث و ج). ارزیابی بافت بیضه براساس شاخص جانسون نشان داد که شاخص جانسون در گروه های حیوانات کنترل سالم و تجربی سالم تیمار شده با عصاره زیرفون با دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن، عدد 10 است. شاخص جانسون در حیوانات کنترل نابارور به میزان معناداری (001/0≥ p ) در مقایسه با کنترل سالم کاهش یافته است و هم چنین تیمار عصاره زیرفون با دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن در حیوانات تجربی نابارور سبب افزایش معنادار(001/0≥ p ) شاخص جانسون در مقایسه با کنترل نابارور شده است(جدول 2).در این تحقیق اولین بار است که گیاه زیرفون برای هورمون های جنسی چه مردان استفاده شده است. تحقیقی بسیار جدید می باشد که در هیچ مقاله ای ازش استفاده نشده است.

 

 

جدول 1- بررسی اثر تیمار عصاره زیرفون با دوزهای 50، 100 و 200 میلی گرم/کیلوگرم وزن بدن بر میزان فعالیت هورمون­هایFSH ، LH و تستوسترون در سرم موش های سالم و موش های واریکوسل شده.

 

گروه ها	هورمون FSH میلی واحد بر میلی لیتر	هورمون LH میلی واحد بر لیتر	هورمون تستوسترون (نانوگرم بر دسی لیتر)
گروه ا (کنترل سالم)	5/2 ± 31	19/0 ± 5/6	36/0 ± 2/8
گروه 2 (عصاره 05/0 میلی گرم بر کیلوگرم)	4/8 ± 24	76/1 ± 3/6	23/1 ± 9/7
گروه 3 (عصاره 1/0 میلی گرم بر کیلوگرم)	4/9 ± 22	3/2 ± 5/6	33/0 ± 1/8
گروه 4 (عصاره 2/0 میلی گرم بر کیلوگرم)	5/2 ± 23	22/0 ± 9/6	19/1 ± 5/7
گروه 5 (واریکوسل)	9/4 ± 62 ***	8/2 ± 1/12 ***	09/1 ± 1/2 ***
گروه 6 (واریکوسل با عصاره 05/0 میلی گرم بر کیلوگرم)	8/4 ± 32 **	42/1 ± 7/11 ***	19/0 ± 8/2 ***
گروه 7 (واریکوسل با عصاره 1/0 میلی گرم بر کیلوگرم)	8/5 ± 19 +	20/0 ± 2/10 ** +	27/0 ± 7/5 ** +++
گروه 8 (واریکوسل با عصاره 2/0 میلی گرم بر کیلوگرم)	9/6 ± 21 ++	41/0 ± 1/7 +++	36/1 ± 8/7 +++

داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارایه شده اند. 001/0p< *** و 01/0p< ** اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می دهد و 001/0 p<+++ ، 01/0p< ++ و 05/0p< + اختلاف از گروه کنترل نابارور را نشان می دهد

 

جدول 2- اثر تیمار عصاره اتانولی زیرفون بر ارزیابی هیستولوژی بافت بیضه در موش های صحرایی سالم و نابارور واریکوسل شده

گروه	امتیاز بافتی براساس شاخص جانسون
کنترل سالم	0/0 ± 10
کنترل نابارور (واریکوسل)	4/0 ± 6/3 ***
تجربی نابارور همراه با عصاره زیرفون دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن	5/0 ± 7 +++

داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارایه شده اند. 001/0p< *** اختلاف از گروه کنترل سالم را نشان می دهد و 001/0 p<+++ اختلاف از گروه کنترل نابارور را نشان می دهد

 

 

 

 

 

شکل 1- مقاطعی از لوله های اسپرم ساز بیضه با بزرگنمایی  (x400،x100 ).

الف) گروه کنترل سالم، لوله های اسپرم ساز (پیکان) و در بین آنها سلول های بینابینی (نوک پیکان) با بزرگنمایی x100 مشاهده می شود و در شکل ب) گروه کنترل با بزرگنمایی x400 نشان داده شده است که سلول های اسپرماتوسیت (پیکان) اسپرماتید (نوک پیکان سفید) و تعداد زیادی اسپرماتوزوآ (نوک پیکان سیاه) دیده می شود. در شکل پ) گروه کنترل نابارور (واریکوسل)، تخریب شدید لوله های اسپرم ساز (پیکان) با بزرگنمایی x100  در شکل ت) همچنین تخریب شدید سلول های لوله (نوک پیکان)  دیده می شود. تعداد کمی اسپرماتوسیت (پیکان) با بزرگنمایی x400 مشاهده می شود. در شکل ث) بافت بیضه در گروه تجربی واریکوسلی که دریافت کننده عصاره زیرفون با دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن می باشد که تخریب اندک لوله های اسپرم ساز (پیکان) با بزرگنمایی x100 مشاهده می شود و در شکل ج) که تعداد زیادی اسپرماتوسیت (پیکان)  و تعداد زیاد اسپرماتید (نوک پیکان) با بزرگنمایی x400 نشان می دهد.  

 

بحث و نتیجه­گیری

در مطالعه ای که توسط Raboch و همکارانش در سال 1975 بر روی 45 بیمار مبتلا به اختلال عملکرد جنسی و 108 مرد با عملکرد جنسی طبیعی به عنوان گروه شاهد انجام شد، مشخص گردید هورمون تستوسترون در مبتلایان به اختلال جنسی کمتر از گروه طبیعی بود(35). که با تحقیق حاضر هم خوانی داشته و واریکوسل باعث کاهش هورمون جنسی تستوسترون شده است. در سال 2011 محققین دریافتند که جراحی واریکوسلکتومی احتمال بیشتری در بارداری مردان ایجاد می کند. واریکوسلکتومی در بیماران نابارور موفق بوده و باعث کاهش غلظت سرمی هورمون هایLH  و FSH می شود(9). در تحقیقاتی که بر روی بیمارانی که تحت واریکوسلکتومی قرار گرفته بودند، مشخص گردید که سطح هورمون تستوسترون بهبود یافته است و هم چنین کاهش سطح هورمون های LH و FSH در همه بیماران پس از واریکوسلکتومی مشاهده گردید که می تواند به دلیل افزایش سطح تستوسترون باشد که با تحقیق حاضر هم خوانی داشته است و گیاه زیرفون با خاصیت آنتی اکسیدانی خود باعث بهبود ناباروری شده است و سطح تستوسترون را افزایش و  LHو FSH را کاهش داده است(4،29).تحقیقات نشان داده است که ارتباطی بین ناباروری ناشی از واریکوسل و استرس اکسیداتیو در موش صحرایی نر هست که باعث افزایش غلظت اکسیدان ها و کاهش غلظت آنتی اکسیدان ها در مردان نابارور می شود(1،34). واریکوسل باعث افزایش تولید رادیکال های آزاد(ROS) و کاهش خاصیت آنتی اکسیدانی می شود که منجر به استرس اکسیداتیو شده و اختلال در عملکرد هورمون های جنسی مردان و بافت بیضه و اسپرم ها می شوند(2). آسیب اکسیداتیو با بیماری واریکوسل همراه است، بنابراین درمان با آنتی اکسیدان­ها(گیاه زیرفون) به عنوان یک روش درمانی مناسب در انواع اختلالات ناباروری در نظر گرفته می شود. در تحقیقاتی که Yayalaci  و همکارانش در طول 50 روز تیمار با گیاه زیرفون(T. platyphyllos) خاصیت آنتی اکسیدانی در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از اتانول نشان دادند که اثر محافظتی کبدی در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از اتانول با اندازه‌گیری آسیب کبدی از طریق آنزیم‌های نشانگر سرمی آنزیم‌های AST، ALT و سطوح آنزیم‌های LDH ،TPRO، TALB و TCHOL مورد ارزیابی قرار گرفت، نشان داد که زیرفون نمی تواند نقش آنتی اکسیدانی در موش ها داشته باشد. ولی با بررسی نتایجی که در بافت های مختلف بدن به دست آورد می توان گفت اثر آنتی اکسیدانی در بافت های مختلف دارد. در بافت کبد افزایش معنی داری CAT در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) نسبت به گروه کنترل و افزایش معنی داری گروه 4(2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) نسبت به سایر گروه ها را نشان داده که نتیجه خاصیت آنتی اکسیدانی گیاه زیرفون می باشد. در بافت مغز افزایش معنی داری گروه 4(2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) در سطح فاکتوری GPX نسبت به سایر گروه ها و افزایش معنی داری گروه 2(اتانول 20 درصد)، در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) و گروه 4(2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) نسبت به گروه کنترل را نشان داده است. هم چنین کاهش معنی داری MDA گروه 4(2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) نسبت به گروه کنترل و گروه 2(20 درصد اتانول) ، افزایش معنی داری CAT در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) نسبت به گروه کنترل و افزایش معنی داری گروه 4(2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) نسبت به گروه 2(20 درصد اتانول) را نشان داده است. در بافت کلیه افزایش معنی داری GPX و CAT در گروه 3 و 4 نسبت به سایر گروه­ها که نشان از خاصیت آنتی کسیدانی عصاره زیرفون می­باشد. در بافت قلب افزایش معنی داری GSH در گروه 2(اتانول 20 درصد)، در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) و گروه 4(2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) نسبت به گروه کنترل و هم چنین افزایش معنی داری GPX در گروه 3 و 4 نسبت به گروه کنترل و افزایش معنی داری گروه 4 نسبت به گروه اتانولی و افزایش CAT در گروه 3 و 4 نسبت به گروه کنترل. هم چنین کاهش معنی داری MDA در گروه 4 نسبت به کنترل و گروه اتانولی را نشان می دهد و در اریتروسیت ها سطح گلوتاتیون (GSH) افزایش معنی داری در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) نسبت به گروه کنترل دارد و هم چنین افزایش معنی داری گروه 4 (2 درصد عصاره گیاه زیرفون همراه با 20 درصد اتانول) نسبت به گروه 2 (20 درصد اتانول) داشته است. کاهش جزئی مالون دی آلدئید(MDA) در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) نشان داده و هم چنین افزایش جزئی کاتالاز(CAT) در گروه 3(2 درصد عصاره گیاه زیرفون) نسبت به گروه کنترل نشان داده است(46). که با تحقیق حاضر هم خوانی دارد که تیمار با عصاره گیاه زیرفون توانسته اثرات مثبتی بر روی هورمون های بیضه داشته باشد.در تحقیقاتی که در سال 2014 انجام دادند، مشخص گردید که عصاره گیاه زیرفون به عنوان از بین برنده رادیکال آزاد با خواص آنتی اکسیدانی قوی می باشد(46). هم چنین طبق تحقیقاتی که همتی برجنی و همکارانش در سال 2020 انجام دادند نشان دادند که عصاره زیرفون با خاصیت آنتی اکسیدانی، از تغییرات بافتی بیضه جلوگیری کرده است. تغییرات هیستوپاتولوژیک(وضعیت لوله های اسپرم ساز، تعداد اسپرماتوسیت، اسپرماتوزوآ و اسپرماتید) بررسی شد. بافت بیضه براساس شاخص بافت شناسی جانسون ارزیابی گردید. نتایجشان نشان داد که در گروه کنترل سالم، سلول های اسپرماتوسیت و اسپرماتوزوآ و اسپرماتید به صورت طبیعی مشاهده می­شود ولی در گروه کنترل نابارور، بیشتر جمعیت سلولی لوله ها از بین رفته بود و تعداد بسیار اندکی اسپرماتوگونی باقی مانده است. در حیوانات تیمار شده با عصاره زیرفون با دوزهای 50، 100، 200 و 400 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن که سلول های اسپرماتید و اسپرماتوزوآ و بقیه رده های اسپرم ساز سالم مشاهده می­شوند. حیوانات نابارور تیمار شده با عصاره اتانولی زیرفون در دوزهای 200 و 400 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن که در داخل لوله تعداد زیادی سلول های اسپرماتوسیت و تعداد قابل توجهی اسپرماتید دیده می­شود و به صورت معناداری سبب بهبود شاخص بافتی در بیضه حیوانات نابارور شده است. مطالعه هیستوپاتولوژیک در بافت بیضه نشان داد که عصاره گیاه زیرفون به صورت معناداری باعث کاهش ناباروری و از الگوی طبیعی بافت بیضه محافظت می کند(24) که در راستای نتایج تحقیق حاضر است. طی تحقیقاتی که Jabeur و همکارانش در سال 2017 انجام دادند مشخص شد که فعالیت ضد التهابی در دو عصاره هیدرواتانولی گیاهی T. platyphyllos ، E. giganteum. وجود دارد ولی اثر بخشی عصاره  T. platyphyllos بیشتر بوده است، بنابراین ممکن است منبع غنی از ترکیبات فنلی با پتانسیل ضد التهابی در نظر گرفته شود. در واقع فعالیت ضد التهابی در غلظت 22±225 میکروگرم بر میلی‌لیتر از عصاره هیدرواتانولی T. platyphyllos برای مهار 50 درصدی تولید NO موثر بوده است، در حالی که برای E. giganteum استفاده از 20±239 میکروگرم در میلی‌لیتر لازم و ضروری می باشد. به طور کلی، T. platyphyllos  پتانسیل آنتی اکسیدانی بالاتری نسبت به E. giganteum نشان داد، هم به عنوان مهارکننده رادیکال های آزاد و هم به عنوان مهارکننده پراکسیداسیون لیپیدی، که این نتایج به وضوح تایید می­شد. این فعالیت بیولوژیکی مستقیماً با فراوانی نسبی در ترکیبات فنلی مرتبط بود. برای عصاره گیاهیT. Platyphyllos با اثرات آنتی اکسیدانی بالاتر گزارش شد که نتیجه غلظت بالایی از ترکیبات فنلی می باشد. T. platyphyllos پتانسیل زیست فعال بالاتری را نشان داد که از نظر آنتی اکسیدانی ارزیابی شد(اثرات مهار رادیکال آزاد - 105 میکروگرم در میلی لیتر و مهار پراکسیداسیون لیپیدی 56 میکروگرم بر میلی لیتر)، اثرات ضد التهابی(225 میکروگرم در میلی لیتر، 50 درصد از تولید اکسید نیتریک را مهار می کند) و فعالیت ضد تومور(در سینه- 224 میکروگرم در میلی لیتر، ریه- 247 میکروگرم در میلی لیتر، دهانه رحم - 195 میکروگرم در میلی لیتر و سلول های کبدی - 173 میکروگرم در میلی لیتر) بود. بدون داشتن سلول های سرطانی اثرات سیتوتوکسیک(بیش از 400 میکروگرم در میلی لیتر) می­باشد. این خواص بیولوژیکی با محتوای و ترکیب آن در ترکیبات فنلی همبستگی مثبت داشت. محتوای فلاونوئید به طور قابل توجهی بالاتر از محتوای اسیدهای فنولیک در هر دو نمونه بود، به ترتیب 4/50 میلی گرم بر گرم و 65/11 میلی گرم بر گرم برای عصاره هیدرواتانولی گیاه T. platyphyllos و 7/21 میلی گرم بر گرم و 98/4 میلی گرم بر گرم برای عصاره هیدرواتانولی گیاه E. giganteum می باشد که کمتر از T. platyphyllos است. با توجه به آزمایشاتی که بر روی عصاره هیدرواتانولی این دو گیاه انجام شد مشخص گردید اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد توموری هر دو نتایج بسیار مثبتی دارند ولی نتایج قطعی به دست آمد از T. platyphyllos پتانسیل بیولوژیکی بالاتری نسبت به E. giganteum نشان داد، زیرا محتوای و ترکیب آن در ترکیبات فنلی به طور مستقیم با پتانسیل­های مشاهده شده در ارتباط است. سمیت سلولی هر دو عصاره گیاهی در سلول های کبدی غیر توموری(PLP2) نشان نداده اند و هم چنین در رده‌های سلولی تومور(کارسینوم پستان-MCF-7، کارسینوم سلول های غیرکوچک ریه-NCI-H460، کارسینوم گردن رحم HeLa و کارسینوم سلول‌های کبدی HepG2 مورد بررسی قرار گرفت و نتایج یک بار دیگر نشان داد که T. platyphyllos موثرتر از E. giganteum، برای تمام رده های سلولی تومور آزمایش شده است. خواص سیتوتوکسیک عصاره های مذکور قبلاً در ادبیات ذکر نشده بود(25). Angeles-López و همکارانش در سال 2013 نشان دادند که عصاره آبی T. americana در دوز خوراکی100و 300 میلی گرم بر کیلوگرم به مدت 15 روز به خوکچه هندی تجویز شد. T. americana دارای اثرات محافظت کننده عصبی در برابر آسیب های عصبی ناشی از ایسکمی داشته و فلاونوئیدها و هم چنین ترکیبات غیرقطبی دخیل هستند(5). طی تحقیقاتی که Rodríguez-Magaña و همکارانش در سال 2019 انجام دادند نشان دادند که از بین 4 گیاه مورد تحقیق، عصاره متانولی T. americana Var فعالیت هیپوگلسیمی با دوز 500 میلی گرم دارد که نشان از فعالیت آنتی اکسیدانی بر روی موش های آزمایشگاهی بوده است و این عصاره در مقایسه با سایر عصاره‌های مورد مطالعه فعالیت بالاتری( 85/8 میلی گرم بر میلی لیتر ) را نشان می دهد و سمیت متوسطی دارند(37). نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تیمار عصاره اتانولی گیاه زیرفون تا حد زیادی می تواند آسیب های وارد شده به بافت بیضه را کاهش دهد و باعث بهبود هورمون های جنسی شود. نتایج ارزیابی هورمون های جنسی و بافت بیضه در مطالعه انجام شده نشان داد که احتمالاً عصاره گیاه زیرفون تا حد زیادی با خاصیت آنتی اکسیدانی می تواند آسیب­های وارد شده را در شرایط استرس اکسیداتیو ناشی از واریکوسل بر پارامترهای هورمونی و بافت بیضه را کاهش دهد و باعث سرکوب رادیکال های آزاد اکسیژن(ROS) شده و باعث افزایش و بهبود هورمون تستوسترون و کاهش هورمون های LH و FSH در موش­های مبتلا به واریکوسل تحت تاثیر دوز مناسب عصاره گیاه زیرفون شود. هم چنین به نظر می رسد عصاره زیرفون اثرات ناشی از واریکوسل را در بافت بیضه به میزان قابل توجهی کاهش دهد این نتایج معنادار می تواند برای اثرات وابسته به دوز عصاره گیاه زیرفون بر روی هورمون های جنسی و بافت بیضه در موش های صحرایی نر مبتلا به واریکوسل تجربی به عنوان اطلاعاتی اساسی قلم­داد گردد. هم چنین تیمار با عصاره گیاه زیرفون به میزان قابل توجهی اثرات محافظتی در عملکرد بیضه ناشی از واریکوسل در موش های صحرایی نر را افزایش داده است. تحقیق حاضر نشان داد که کاربرد بالینی احتمالی عصاره گیاه زیرفون برای درمان برخی اختلالات بیضه ارائه داده شده است.

تشکر و قدردانی

مطالعه حاضر بخشی از یک پایان نامه دکترای تخصصی فیزیولوژی از دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم تحقیقات فارس بود. از معاونت تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات فارس،  دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران و دانشگاه آزاد اسلامی واحد شیراز برای حمایت از این تحقیق کمال تشکر و قدردانی داریم. 

مراجع

1.Abd-Elmoaty, M., Saleh, R., Sharma, R., Agarwal, A. (2010). Increased levels of oxidants and reduced antioxidants in semen of infertile men with varicocele. Fertil Steril, 94(4);1531-1534.

2.Agarwal, A., Sharma, RK., Desai, NR., Prabakaran, S., Tavares, A., Sabanegh, E. (20090. Role of oxidative stress in pathogenesis of varicocele and infertility. Urology, (3); 461-469.

3.Alizadeh, M ., Nasebakht, A., Valizadeh, R. (2018). Apreliminary evaluation of serum level of testosterone, LH, and FSH in patients with varicocele after varicocelectomy as a kidney-related disease. Ther Clin Risk Manag, 4(14); 1585-1590.

4.Alsaikhan, B., Alrabeeah, K., Delouya, G., Zini, A. (2016). Epidemiology of varicocele. Asian J Androl, 18(2);179–181.

5.Angeles-López, GE., González-Trujano, ME., Déciga-Campos, M., Ventura-Martínez, R. (2013). Neuroprotective evaluation of Tilia americana and Annona diversifolia in the neuronal damage induced by intestinal ischemia. Neurochem Res, 38(8); 1632-1640.

6.Azizollahi, G., Azizollahi, S., Babaei, H., Kianinejad, M., Baneshi, M., Nematollahimahani, S. (2013). Effects of supplement therapy on sperm parameters, protamine content and acrosomal integrity of varicocelectomized subjects. J Assist Reprod Genet, 30(4); 593-599.

7.Bong, GW., Koo, HP. (2004). The adolescent varicocele: to treat or not to treat. Urol Clin North Am, 31(3);509-15.

8.Cárdenas-Rodríguez, N., González-Trujano, M., Aguirre-Hernández, E. (2014). Anticonvulsant and antioxidant effects of Tilia americana var. mexicana and flavonoids constituents in the pentylen etetrazole induced seizures. Oxid Med Cell Longev, 2014; 329172.

9.Chen, SS., Chen, LK. (2011). Predictive factors of successful varicocelectomy in infertile patients. Urol Int, 86(3);320–324.

10.Chiba, K., Fujisawa, M. (2016). Clinical outcomes of varicocele repair in infertile men: a review. World J Mens Health, 34(2); 101–109.

11.Coballase-Urrutia, E., Cárdenas-Rodríguez, N., Carolina González-García, M. (2017). Biochemical and molecular modulation of CCl 4-induced peripheral and central damage by Tilia americana var. mexicana extracts. Saudi Pharm J, 25(3); 319-331.

12.Cüce, F., Demiray, Ö., Küçük, U., Olgun Küçük, H. (2016). Varicocele: tissue stress in the etiology. Turk JMed Sci, 46(4); 1014–1017.

13.Divya, V., Girish Kumar, V., Nandel, S., Ramchandra, SG. (2014). Dynamics of spermatogenesis. Annual Research & Review Biology, 4(1); 38-50.

14.Duke, JA. (2002). Handbook of Medicinal herbs. 2th ed. CRC Press, 467-8.

15.ElBardisi, H., Arafa, M., Rengan, AK. (2005). Varicocele among infertile men in Qatar. Andrologia, 49(4);

16.El-Sakka, AI., Hassoba, HM., Sayed, HM., Tayeb, KA. (2005). Pattern of endocrinal changes in patients with sexual dysfunction. J Sex Med, 2(4); 551-8.

17.Evarte-Bundere, G. (2014). Analysis of some limiting ecological factors on the example of the distribution of the genus Tilia L. cultivated in Latvia. Estonian Journal of Ecology, 63(3);185-202.

18.Francavilla, S., Bruno, B., Martini, M. (1986). Quantitative evaluation of Leydig cells in testicular biopsies of men with varicocele. Arch Androl, 16(2);111-7.

19.Fujisawa, M., Dobashi, M., Yamasaki, T. (2001). Significance of seruminhibin B concentration for evaluating improvement in spermatogenesis after varicocelectomy. Hum Reprod, 16(9); 1945–1949.

20-Gat, Y., Gornish, M., Belenky, A., Bachar, GN. (2004).Elevation of serum testos‌terone and free testosterone after embolization of the internal spermatic vein for the treatment of varicocele in infertile men. Hum Reprod, 19(10);2303–2306.

21.Goel, RK., Prabha, T., Kumar, MM., Dorababu, M., Singh, G. (2006). Teratogenicity of Asparagus racehorses Willd, Root. A herbal medicine Indian Jexp Bio, 44(7);503-570.

22.Hatami, L., Estakhr, J. (2013).The Effects of hydroalcoholic extract of Matricaria recutita on the hormonal pituitary-testis axis and testis tissue changes of mature male rats. Journal of Fasa University of Medical Sciences Spring, 3(1); 56-62.

23.Hayden, RP., Tanrikut, C. (2016). Testosterone and varicocele. Urol Clin North Am, 43(2); 223–232.

24.Hemmati Borujeni, N., Eidi, A., Mortazavi, P., Oryan, Sh. (2020). Effect of Tilia platyphyllos on cadmium chloride – induced testicular damage in adult male wistar rats. Research in Medicine, 44(1); 270-275.

25.Jabeur, I., Martins, N., Barros, L., Calhelha, R., Vaz, J., Achour, L. (2017). Contribution of phenolic composition to the antioxidant, anti-inflammatory and antitumor potential of Equisetum giganteum L. and Tilia platyphyllos Scop. Food Funct, 8(3); 975-984.

26.Johnsen ,SG. (1970). Testicular biopsy score count—a method for registration of spermatogenesis in human testis: normal values and result in 352 hypogonadal males. Hormones 1; 2-25.

27.Kaneko, T., Sasaki, S., Yanai, Y., Umemoto, Y., Kohri, K. (2007). Effect of microsurgical repair of the varicocele on testicular function in adolescence and adulthood. Int J Urol, 14(12); 1080–1083

28.Karioti, A., Chiarabini, L., Alachkar, A., Fawaz Chehna, M., Vincieri, F., Bilia, R. (2014). HPLC-DAD and HPLC-ESI-MS analyses of Tiliae flos and its preparations. J Pharm Biomed Anal, 100; 205-214.

29.Li, F., Yue, H., Yamaguchi, K. (2012). Effect of surgical repair on testosterone production in infertile men with varicocele: a meta-analysis. Int J Urol, 19(2); 149–154.

30.Liu, JJ., Dong, Q., Yang, YR. (2007). Effects of experimental varicocele on the testosterone level in the serum and testis of rats. Zhonghua Nan Ke Xue, 13(4); 335-7.

31.Luo, DY., Yang, G., Liu, JJ., Yang, YR., Dong, Q. (2011). Effects of varicocele on testosterone, apoptosis and expression of StAR mRNA in rat Leydig cells. Asian J Androl, 13(2); 287–291.

32.Merve, B., Sinem, I., Gozde, K. (2017). Reproductive toxicity after levetiracetam administration in male rats: Evidence for role of hormonal status and oxidative stress. PLoS One, 12(4); e0175990.

33.Morovvati, H., Moradi, H.R., Adibmoradi, M., Sheybani, MT., Salar Amoli, J. (2016). Effects of wheat sprout extract on the quality of sperm in rats exposed to lead. Journal, 12(3); 76-85.

34.Mostafa, T., Anis, T., Imam, H., El-Nashar , A., Osman, I. (2009). Seminal reactive oxygen species–antioxidant relationship in fertile males with and without varicocele. Andrologia,  41; 125-9.

35.Raboch, J., Mellan, J., Starka, L. (1975). Plasma testosterone in male patients with sexual dysfunction. Arch Sex Behav, 4(5); 541-5.

36.Redmon, JB., Carey, P., Pryor, JL. (2002). Varicocele- the most common cause of male factor infertility? Hum Reprod Update, 8(1);53-58.

37.Rodríguez-Magaña, MP., Cordero-Pérez, P., Rivas-Morales, C. Hypoglycemic activity of Tilia americana, Borago officinalis, Chenopodium nuttalliae, and Piper sanctum on Wistar Rats. J Diabetes Res, 2019; 1-6.

38-Salem HK, Mostafa T. Preserved testicular artery at varicocele repair. Andrologia, 41(4); 241–245.

39.Staub, C., Johnson, L. (2018). Review: Spermatogenesis in the bull. Animal, 12(1); 27-s35.

40.Tadayyon, F., Mellat, M., Khorrami, MF., Shahdoost, AA., Haghdoost, FS. (2011). Comparing the serum level of testosterone and the relative frequency of premature ejaculation in patients with varicocele and normal population. Journal of Isfahan Medical School Original Article, 28(124); 2032-2038.

41.Tiago, F., Elisabete, N-G., Sara, M. (2021). Toxicological and anti-tumor effects of a linden extract ( Tilia platyphyllos Scop.) in a HPV16-transgenic mouse model. Food Funct, 12(9); 4005-4014.

42.Tiseo, BC., Esteves, SC., Cocuzza, MS. (2016). Summary evidence on the effects of varicocele treatment to improve natural fertility in subfertile men. Asian J Androl, 18(2); 239–245.

43.Toker, G., Aslam, M., Zesilada, E., Memisolu, M., Ito, S. (2001). Comparative evaluation of the flavonoid content in officinal Tiliae flos and Turkish lime species for quality assessment. J Pharm Biomed Anal, 26; 111–21.

44.Turner, TT. (2001). The study of varicocele through the use of animal models. Hum Reprod Update, 7(1); 78-.84

45.Wein, A., Kavoussi, L., Partin, A., Peters, C. (2011). Campbell Walsh Text Book of Urology. 10th ed. Philadelphia: Elsevier, 810–820.

46.Yayalacı, Y., Celik, I., Batı, B. (2014). Hepatoprotective and antioxidant activity of linden (Tilia platyphyllos L.) infusion against ethanolinduced oxidative stress in rats. J Membr Biol, 247(2); 181-188.

47. Zargari ,A. (1997). Medicinal plants, Tehran, Tehran University Publications., 7th edition; Vol. 1, 399-402.

48.Zeppa, S., Vallorani, L., Potenza, L. (2000). Estimation of fungal biomass and transcript levels in Tilia plathyphyllos Tuber borchii ectomycorrhizae. FEMS Microbial Lett, 188(2); 119-124