بررسی مقایسه‌ای تاثیر دوستاکسل بر داربست سلولی تخمک موش سوری پس از انجماد شیشه‌ای با دو ماده انجمادی متفاوت

مجله پلاسما و نشانگرهای زیستی

دوره 15، شماره 2 - شماره پیاپی 58، اسفند 1400، صفحه 123-136   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

حامد دانش پژوه¹؛ نسیم حیاتی رودباری^{* 1}؛ مهدی دیانت پور^{* 2}؛ زهرا خدابنده جهرمی³؛ یاسر تهمتنی⁴

¹گروه زیست شناسی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

²دانشیار، مرکز تحقیقات فناوری سلول های بنیادی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، شیراز، ایران و دانشیار، گروه ژنتیک، دانشکده پزشکی، دانشگاه

³استادیار، مرکز تحقیقات فناوری سلول های بنیادی، دانشگاه علوم پزشکی شیراز، شیراز، ایران

⁴گروه سلول های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، موسسه زیست شناسی و فناوری سلول های بنیادی رویان، ACECR، تهران

چکیده

زمینه و هدف: پژوهش حاضر به منظور بررسی مقایسه‌ای تاثیر ماده دوستاکسل بر روی لقاح آزمایشگاهی، درصد زنده‌مانی و داربست سلولی تخمک‌ها پس از انجماد شیشه‌ای با دو ماده انجمادی متفاوت می‌باشد.
روش کار: برای رسیدن به این  منظور موش‌های ماده نژاد NMRI با سن 8 تا 10 هفته با تزریق هورمون‌های PMSG و HCG برای تخمک‌گذاری تحریک شدند. توده سلولی کومولوس اطراف تخمک با استفاده از آنزیم هیالورونیداز 1/0% برداشته و سپس تخمک‌ها به 8 گروه آزمایشی شامل گروه‌های کنترل، دوستاکسل، دوستاکسل+ محلول انجمادی1، دوستاکسل+ محلول انجمادی2، دوستاکسل+ انجماد شیشه‌ای 1، دوستاکسل+ انجماد شیشه‌ای2، انجماد شیشه‌ای 1 و انجماد شیشه‌ای 2 تقسیم گردیدند. تخمک‌های بالغ در محلول‌های انجمادی اتیلن گلیکول و دی‌متیل‌سولفوکساید با غلظت 15 درصد و ساکارز 5/0 مولار در گروه انجمادی 1 و محلول‌های انجمادی اتیلن‌گلیکول 5/7 %، گلیسرول 5/7 % و سوکروز 5/0 مولار در گروه انجمادی دوم منجمد شدند. پس از ذوب شدن، درصد زنده مانی و لقاح آن ها تا مرحله دو سلولی بررسی گردید. رنگ‌آمیزی میکروتوبول‌ها در تخمک‌ها با آنتی‌بادی آلفاتوبولین انجام گردید.
یافته ها: نتایج نشان می‌دهد تفاوت‌های معنی‌داری بین درصد زنده مانی و درصد لقاح گروه‌های انجمادی در مقایسه با گروه کنترل وجود دارد(P<0.05). درصد زنده مانی و درصد لقاح در گروه انجمادی اول نسبت به گروه انجمادی دوم کاهش یافت اما این دو گروه از نظر آماری تفاوت معنی‌داری بایک دیگر نداشتند. هم چنین درصد زنده مانی و درصد لقاح گروه‌های پیش انکوبه شده با دوستاکسل بیشتر از گروه‌های انکوبه نشده بود
نتیجه گیری: با توجه نتایج حاصل دوستاکسل با کاهش آسیب‌های وارده به اسکلت سلولی تخمک می‌تواند در بهبود تکنیک‌های تولید مثلی موثر باشد.

کلیدواژه‌ها

انجماد شیشه‌ای؛ تخمک؛ محلول انجمادی؛ دوستاکسل؛ کرایوتاپ

اصل مقاله

قدمه

 

انجماد تخمک ممکن است یک جای گزین مهم برای نگهداری باروری در خانم‏هایی باشد که نیاز به تعویق انداختن استفاده از گامت‏های خود به‏ دلایل مختلف از جمله داشتن IVF های ناموفق، وقوع سندرم تحریک بیش از حد تخمدان(OHSS) یا ناتوانی در به دست آوردن اسپرم در روز انجام لقاح هستند و نهایتاً یک انتخاب برای خانم‏های بارور جهت نگه‏داری گامت‏های آن‏ها حتی بعد از اثرات فیزیولوژیک افزایش سن باشد(15). انجماد تخمک باعث تکمیل روش‌های کمکی باروری و گسترش کاربرد آن در بین زنان بارور شده است(21). از میان روش های مختلف انجماد، انجماد شیشه‌ای در حال حاضر موثرترین روش جهت نگهداری تخمک و جنین می‌باشد. انجماد شیشه‌ای فرآیند فیزیکی است که در آن از محلول‌های انجمادی با غلظت بالا استفاده شده و از تشکیل کریستال‌های یخ جلوگیری می‌شود(10). انجماد شیشه ای تخمک یک روش سودمند برای حفاظت از تنوع ژنتیکی در گونه‌های حیوانات در معرض انقراض و حیوانات مزرعه ای می باشد(27). روش کرایوتاپ آخرین روش کشف شده است که در آن از حداقل حجم محلول استفاده شده و نمونه به طور مستقیم در تماس با نیتروژن مایع قرار می‌گیرد(23). تخمک و جنین در طی انجماد دچار صدمات مورفولوژیکی و عملکردی می‏شوند، تنوعی از فاکتورها از قبیل سمیت، غلظت بالای محلول‌های انجمادی، شوک دمایی و استرس‌های اسمزی در طول انجماد شیشه‌ای ممکن است بر تخمک تاثیر بگذارند که این فاکتورها منجر به هم ریختن ارگانل‌ها، تیرگی لایه شفاف و آسیب‌های ژنتیکی می‌شود(31). ضدیخ های مورد استفاده در انجماد شیشه‌ای تخمک ها یا جنین ها نقش قطعی در ممانعت از دهیدراسیون سلولی و تشکیل کریستال یخ بازی می‌کنند اما آن ها هم چنین مسئول آسیب های اسموتیک و سمیت می‌باشند(19). یکی از ضد یخ ها، اتیلن گلیکول است که بسیار موثر و سمیت کمتری برای انجماد تخمک ها دارد. درسال 2008 کارتبرگ و همکاران تشخیص دادند که انجماد با DMSO تمامیت غشای جنین را بهتر از محلول های بدون DMSO حفظ می‌کند. ترکیب DMSO با اتیلن گلیکول دارای حد متوسط حداقل دو فایده دارد: اولاً، انجماد به دلیل خاصیت تشکیل شیشه بهتر و بیشتر از DMSO به تنهایی، تسهیل می شود؛ دوماً،تراوش پذیری هر ضد یخ در حضور دیگری افزایش پیدا می کند بنابر این در این پژوهش می بایست از روش هایی استفاده گردد که به جریانی که محلول‌های انجماد را با هم ترکیب کند بسط داده شود(26). الماسی ترک و روزبهی در تحقیقی در سال2013 با به کار بردن غلظت کمتر ضد یخ(25/1 و 1 مولار) نسبت به غلظت معمول 5/1مولار نتایج مشابهی به دست آوردند، ضمن این که سمیت ضد یخ هایی که در انجماد تخمک یا جنین استفاده می شود نیز کاهش پیدا خواهد کرد(2). مطالعات متعدد نشان داده که محلول انجمادی حاوی ضد یخ اتـیلن گلیکـول بهتـر از ضـد یـخ هـای دیگر نظیر پروپاندیول، گلیسرول و دی متیل سولفاکسید عمل می کند(9). بیان شده است که اتـیلن گلیکـول بـه خـاطر سـمیت کـم، نقـش مهمـی در پایـداری غـشای سـلولی در طـی انجمـاد دارد ضـدیخ بـسته بـه مرحلـه تکاملی تخمک نیز اثرات متفاوتی بر آن دارد. از طرف دیگر انجماد تخمـک در مراحـل تکـاملی مختلف نتایج متفاوتی به دنبال داشته اسـت. کـه از دلایـل آن مـی تـوان بـه انـدازه سـلول، میـزان متابولیت متفاوت، مرحله سیکل سلول، وجود یا نبود گرانول های قشری و میزان لیپید داخل سلولی حساس به سرما اشاره کرد. رهایی زودرس گرانـول هـای قـشری در تخمـک مرحلـه MII موجـب سختی زوناپلوسیدا و کاهش میزان باروری آن می گردد(34). اسکلت سلولی از ساختار سیتوپلاسمی فیبریلی پیچیـده تـشکیل شـده اسـت و هـدف آن حفـظ و اصـلاح شـکل سـلول، دخالـت در ارگانـل هـای سیتوپلاسمی و اگزوسیتوز می باشد. پروتئین های داخل غشایی، میکروتوبول ها، میکروفیلامنت هـای اکتین و فیلامنت های بینابینی ترکیبات اصلی اسکلت سلولی می باشند. کـل ترکیبـات ذکـر شـده بـه انواع مختلف تحریکات حساس هستند و قابلیت تبـدیل سـریع بـه زیـر واحـد‌های خـود را دارنـد. Vincent و همکـارانش نـشان دادنـد کـه ضـدیخ DMSO منجـر بـه صـدمات قابـل توجـه در میکروفیلامنت های تخمک مورین(Murine) می شـود کـه ارتبـاط مـستقیمی بـا غلظـت آن دارد(32). به هر حال آسیب به فیبرهای سیتواسکلتن(CSF) تخمک ها در طول انجماد شیشه‌ای، علت اصلی آرایش دوک غیر عادی و کاهش زنده مانی تخمک های منجمد- ذوب شده است(26). اخیراً گزارش شده که پایداری CSF قبل از انجماد شیشه ای ممکن است جهت کاهش تخریب CSF در اووسیت ها مفید باشد(22). در واقع چندین عامل پایدار کننده سیتواسکلتن از قبیل سیتوکالازینB,D (CB,CD)) و پاکلیتاکسل برای محافظت اووسیت ها از آسیب CSF در طول انجماد شیشه ای مورد استفاده قرار می گیرد. به هر حال به خوبی شناخته شده که انکوبه کردن اووسیت های بالغ با پاکلیتاکسل می‌تواند آسیب CSF را بعد از انجماد- ذوب کاهش داده و تکامل جنینی را در انسان ها(12)، موش(28) و خوک(35) بهبود بخشد. میکروتوبول ها از مهم ترین ترکیبات اسکلت سلولی هستند که در فرآیندهای مهم سلول از جمله در حرکات، تقسیم سلولی، نقل و انتقالات درون سلولی نقش دارند. با توجه به این که میکروتوبول‌ها و دیگر فیبرهای اسکلت سلولی تخمک ممکن است در طول انجماد شیشه‌ای دچار آسیب شده و در نتیجه باعث شکست در فرایند لقاح پس از ذوب شدن گردند، پایداری رشته‌های دوکی برای انجماد شیشه‌ای موفق تخمک از اهمیت بسیاری برخوردار می‌باشد .(7) یکی از روش‌های مورد استفاده برای حفظ تخمک در مقابل آسیب سلولی در طول انجماد شیشه‌ای استفاده از مواد پایدار کننده مانند سیتوکالازین B و D، پاکلیتاکسل (35) و دوستاکسل می‌باشد. دوستاکسل یک عضو تازه شناخته شده از رده داروهای ضد سرطانی است که رده پاکلیتاکسل را نیز در بر می‌گیرد(4،17). دوستاکسل تجمع میکروتوبول‌های توبولین را تسهیل می‌کند و با بالا بردن نرخ پلیمریزاسیون توبولین به میکروتوبول‌های پایدار، از جدا شدن دایمر‌های از قبل تشکیل شده میکروتوبول‌ها جلوگیری و باعث تثبیت آن ها می‌گردد. این تثبیت مانع از آرایش فعال و طبیعی شبکه میکروتوبول‌ها شده که خود منجر به توقف تقسیم سلولی می‌گردد(35،36).به هر حال تغییر فعالیت های دو داروی دوستاکسل و پاکلیتاکسل متفاوت است. دوستاکسل، نرخ و وسعت پلیمریزاسیون توبولین به میکروتوبول های پایدار(MT) را بالا برده و زمانی که در معرض دمای خیلی پایین قرار می گیرند، از دپلیمریزاسیون MT ممانعت می‌کند. نرخ گسترش پلیمریزاسیون افزایش یافته توبولین توسط دوستاکسل دو برابر پاکلیتاکسل می باشد(36). تمایل اتصالی دوستاکسل برای جایگاه اتصال MT 9/1 fold بیشتر از پاکلیتاکسل می باشد(13). به علاوه دوستاکسل، کاهش 2 بار بیشتر از غلظت قطعی GTP- tubulin مورد نیاز برای پلیمریزاسیون توبولین را در مقایسه با پاکلیتاکسل القا می کند(9،14). دوستاکسل ممکن است از پاکلیتاکسل در پایداری CSF اووسیت ها در طول انجماد شیشه ای و بهبود قابلیت زنده مانی آن ها بعد از انجماد-ذوب موثرتر باشد. به هر حال سمیت دوستاکسل روی اووسیت های موش هرگز گزارش نشده است و اثرات انکوبه کردن اووسیت های موش بالغ(IVM) با دوستاکسل قبل از انجماد شیشه ای روی پایداری CSF و بقا اووسیت بعد از انجماد-ذوب و نرخ های تکوین جنینی متعاقب آن گزارش نشده است(14). با توجه مطالعه انجام شده و با توجه به این که تاکنون گزارش اندکی در مورد اثرات دوستاکسل بر روی انجماد شیشه‌ای تخمک موش مشاهده شده است، هدف از پژوهش حاضر مقایسه تاثیر دوستاکسل بر روی تخمک‌ها، درصد زنده مانی و درصد لقاح تخمک‌ها تا مرحله دوسلولی و هم چنین تاثیر دوستاکسل بر ساختار اسکلت سلولی تخمک می‌باشد.

مواد و روش‌ها

پژوهش حاضر در مرکز تحقیقات فناوری سلول‌های بنیادی واقع در برج پژوهشی محمد رسول الله دانشگاه علوم پزشکی شیراز انجام شد. بدین ترتیب که تعداد 50 سر موشNMRI با سن 8 تا 10 هفته‌ای از انستیتوپاستور تهیه و به اتاق حیوانات منتقل شد. پس از گذشت دو هفته و سازگاری موش با شرایط آزمایشگاه، برای تحریک تخمک گذاری به موش‌های ماده 10 واحد هورمون pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) و سپس 10 واحدHCG(human chorionic gonadotropin) به صورت داخل صفاقی تزریق کرده و برای برداشت تخمک بالغ در مرحله متافاز دوم 12تا 15 ساعت بعد از تزریق HCG، حیوان را قطع نخاع کرده و کمپلکس تخمک‌ها و کومولوس‌ها از لوله فالوپ خارج شدند. سپس توده تخمک‌ها به همراه کومولوس را در معرض آنزیم هیالورونیداز 01/0 درصد قرار داده، تا کومولوس‌ها از اطراف تخمک‌ها جدا شوند. تخمک‌های به دست آمده 3 بار در محیط پایه G-MOPS شستشو داده شده و تنها تخمک‌های دارای ظاهر طبیعی که در مرحله متافاز دوم قرار داشتند، برای ادامه بررسی انتخاب شدند(20). جهت بررسی‌های مقایسه‌ای دو محلول انجمادی اتیلن گلیکول و دی متیل سولفوکساید با غلظت 15 درصد و ساکارز 5/0 مولار(گروه اول) و اتیلن گلیکول 5/7%، گلیسرول 5/7% و سوکروز 5/0 مولار(گروه دوم) تهیه گردید. سپس تخمک‌ها به 8 گروه آزمایشی به ترتیب زیر تقسیم شدند:

1)گروه کنترل: تخمک‌ها در معرض هیچ ماده‌ای قرار نگرفتند.

2)گروه دوستاکسل: تخمک‌ها به مدت 20 دقیقه با دوستاکسل 05/0 میکرومولار پیش انکوبه شدند(7).

3)دوستاکسل + محلول انجمادی 1: تخمک‌ها با دوستاکسل 05/0 میکرومولار برای 20 دقیقه پیش انکوبه شده و سپس در معرض محلول‌های انجمادی گروه اول(اتیلن‌گلیکول و دی‌متیل‌سولفوکساید با غلظت 15 درصد و ساکارز 5/0 مولار) قرار داده شدند، اما منجمد نشدند.

4)دوستاکسل + انجماد شیشه‌ای 1: تخمک‌ها با دوستاکسل 05/0 میکرومولار برای 20 دقیقه پیش انکوبه شده، سپس در معرض محلول‌های انجمادی گروه اول قرار داده شده و منجمد شدند.

5)انجماد شیشه‌ای1: تخمک ها بدون این که در معرض دوستاکسل قرار بگیرند در محیط‌های انجمادی گروه اول انجماد شیشه‌ای شدند.

6)دوستاکسل + محلول انجمادی 2: تخمک‌ها با دوستاکسل 05/0 میکرومولار برای 20 دقیقه پیش انکوبه شده و سپس در معرض محلول‌های انجمادی گروه دوم(اتیلن گلیکول 5/7 %، گلیسرول 5/7% و سوکروز 5/0 مولار) قرار داده شدند، اما منجمد نشدند.

7)دوستاکسل + انجماد شیشه‌ای 2: تخمک‌ها با دوستاکسل 05/0 میکرومولار برای 20 دقیقه پیش انکوبه شده، سپس در معرض محلول‌های انجمادی گروه دوم قرار داده شده و منجمد شدند.

8)انجماد شیشه‌ای2: تخمک‌ها بدون اینکه در معرض دوستاکسل قرار بگیرند در محیط‌های انجمادی گروه دوم انجماد شیشه‌ای شدند(7).

انجماد شیشه‌ای و ذوب

جهت انجماد شیشه‌ای از کرایوتاپ به عنوان یک ابزار ویژه که از نوار فیلمی نازک و باریک ساخته شده و به یک نگه دارنده پلاستیکی سخت متصل است، استفاده شد. در انجماد شیشه‌ای، از محلول انجمادی حاوی محلول‌های ضد یخ با غلظت 15٪ اتیلن‌گلیکول + 15٪ دی‌متیل‌سولفوکسید + 5/0مولار ساکارز در محیط پایه در گروه اول و و اتیلن‌گلیکول 5/7%، گلیسرول 5/7 % و سوکروز 5/0 مولار درگروه دوم استفاده شد. محلول‌های تعادلی حاوی نیمی از غلظت ضد یخ‌ها  بدون ساکارز بود. به طور خلاصه، 15 تخمک در محیط پایه(G-Mops) حاوی 05/0 میکرومولار دوستاکسل به مدت 20 دقیقه قرار گرفتند. تخمک‌ها در اولین قطره تعادلی به مدت 3 دقیقه قرار داده شدند. سپس، آن ها به مدت 1 دقیقه در محلول انجمادی نگهداری شدند. سرانجام، تخمک‌ها به سرعت در سطح کرایوپ قرار گرفتند. تخمک‌ها در گروه‌های 15 تایی بر روی کرایوتوپ قرار گرفتند. محلول‌های اضافی اطراف تخمک‌ها به طور کامل برداشته شد. سپس، کرایوتاپ به سرعت درون نیتروژن مایع غوطه‌ور شد.پروسه ذوب کردن تخمک‌ها پس از انجماد با قرار دادن مستقیم کرایوتاپ در محلول حاوی ساکارز 1 مولار به مدت یک دقیقه و سپس غلظت‌های رقیق شده ساکارز(75/0 ، 5/0 و 25/0مولار) هر کدام به مدت سه دقیقه انجام شد. جهت جدا کردن تخمک‌های سالم از انواع آسیب دیده پس از ذوب، تخمک‌ها در زیر استریومیکروسکوپ بررسی شدند. تخمک‌هایی که دارای اووپلاسم یک دست، فضای مناسب زیر زرده‌ای و لایه شفاف بودند، برای انجام لقاح آزمایشگاهی انتخاب و تخمک‌های با اووپلاسم تیره کنار گذاشته شدند(3).

لقاح آزمایشگاهی

برای انجام لقاح آزمایشگاهی ابتدا اسپرم‌ها از دم اپیدیدیم موش‌های نر(12 تا 8 هفته) جدا شدند. اسپرم‌ها به مدت یک ساعت و نیم در محیط کشتHam ‘s F10 حاوی 5 میلی گرم سرم آلبومین گاوی(سیگما) در 37 درجه سانتی گراد برای انجام واکنش ظرفیت‌پذیری قرار داده شدند. سپس غلظت نهایی یک میلیون اسپرم در یک میلی لیتر به محیط G-IVF حاوی 15 تخمک اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 6 ساعت انکوبه شد. تخمک‌ها در محیط کشت تا مرحله پرونوکلئوس پیش برده و پس از انجام لقاح آزمایشگاهی، درصد تشکیل جنین‌های دو سلولی بررسی شد(20).

رنگ آمیزی اسکلت سلولی تخمک با آلفاتوبولین

امروزه متداول‏ترین روش ارزیابی مورفولوژیکی اووسیت میکروسکوپ نوری می‏باشد، ولی این روش جهت تشخیص صلاحیت لقاح و تکامل اووسیت روش کافی نمی‏باشد(25). لذا تکنیک‏های میکروسکوپ الکترونی از آن جهت که می‏توانند اطلاعات وسیعی را از فراساختار سلول و ارگانل‏های آن فراهم نمایند بسیار ارزشمند است(37). تغییرات فراساختاری گرانول‏های قشری، زوناپلوسیدا و سیتوپلاسم اووسیت‏های انسانی که در معرض آب‏گیری و آب‏دهی مجدد قرار گرفتند گزارش شده است و این نشان‏دهنده این است که میکروسکوپ الکترونی می‏تواند خط اول ابزار مورد بررسی باشد(16). در پژوهش حاضر رنگ‌آمیزی تخمک‌ها مطابق روش آدونا و همکاران در سال 2008 با اندکی تغییر انجام گرفت. جهت رنگ‌آمیزی، 2 ساعت پس از ذوب تخمک‌ها را در انکوباتور قرار داده، سپس با محلول حاوی پارافرمالدهید 4% و تریتون X100 6/0 % + بافر فسفات به مدت 30 دقیقه ثابت سازی شدند. پس از آن، تخمک‌ها در ترکیبی از سرم بز 5% + سرم آلبومین گاوی 2% + بافر فسفات به مدت 45 دقیقه برای از بین بردن باندهای غیر اختصاصی قرار داده شدند(تمامی مراحل ذکر شده تاکنون در روشنایی انجام شد، اما از این مرحله به بعد آزمایش باید در تاریکی ادامه یابد). سپس تخمک‌ها با آنتی بادی آلفاتوبولین که به میزان 1 به 100 در بافر فسفات رقیق شده به مدت یک ساعت انکوبه شدند. شستشو با تویین20 با غلضت 1/0 درصد انجام شد(3 بار تکرار). در نهایت تخمک‌ها با پروپیدیوم یدید با غظت 10 میکروگرم در یک میلی‌لیتر به مدت 15 دقیقه مجدداً رنگ‌آمیزی و تخمک‌ها در زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی شدند.

تجزیه و تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 21 انجام شد. از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA)(Tukey) برای تعیین تفاوت بین میانگین مقادیر بقای تخمک‌ها و لقاح استفاده شد.

نتایج

پس از ذوب شدن تخمک‌ها، نرخ بقاء و لقاح هر گروه به طور جداگانه با گروه کنترل مقایسه شدند. جدول 1 نتایج به دست آمده از انجماد شیشه ای تخمک ها را در گروه انجمادی اول به طور خلاصه نشان می دهد. نتایج نشان می دهد درصد بقاء گروه کنترل با گروه vitrification 1 دارای اختلاف معنی‌دار بوده(P<0.05) و میزان بقا در گروه انجمادی، به طور قابل توجهی پایین تر از گروه کنترل بود(033/0 = P) ولی بقیه گروه ها از نظر درصد بقاء اختلاف معنی داری با یک دیگر نداشتند(P>0.05). مطابق جدول 1 نرخ بقاء تخمک های منجمد-ذوب شده در گروه D+Vitrification در مقایسه با گروه Vitrification به طور معنی داری بالاتر بود(P=0.001). میزان بقای تخمک‌های منجمد / ذوب شده در گروه دوستاکسل + انجمادی نسبت به گروه انجماد(947/0 = P) بیشتر بود ، اما تفاوت معنی‌داری مشاهده نشد. هم چنین در بقای تخمک‌ها بین گروه دوستاکسل و گروه دوستاکسل + محلول انجمادی تفاوت معنی‌داری وجود نداشت(533/0=P). تخمک ها پس از انجماد- ذوب در گروه های آزمایشی و کنترل تحت عمل لقاح آزمایشگاهی قرار داده شدند. پس از انجام لقاح آزمایشگاهی، درصد تشکیل جنین های دو سلولی بررسی شد. جدول 1 نشان می دهد که کاهش معنی‌داری در نرخ لقاح هر گروه در مقایسه با گروه کنترل وجود دارد(05/0≥ P). نتایج نشان داد که میزان لقاح هر گروه نسبت به گروه کنترل کاهش معنی‌داری نشان داد(001/0 = P)، میزان تشکیل جنین‌های 2 سلولی بعد از لقاح آزمایشگاهی در هر دو گروه انجماد(دوستاکسل + انجماد شیشه‌ای و انجماد شیشه‌ای) نسبت به گروه‌های غیر انجمادی(کنترل و دوستاکسل) به طور معنی داری پایین تر بود(جدول 1). در مجموع می توان گفت زیر گروه های انجمادی از نظر درصد بقاء فاقد اختلاف معنی دار و از نظر درصد لقاح دارای اختلاف معنی دار می‌باشند. جدول 2 نتایج انجماد شیشه‌ای تخمک در گروه انجمادی دوم را نشان می‌دهد. همان‌گونه که در جدول 2 مشاهده می کنید درصد بقاء گروه هایDocetaxel, Vitrification2, D+VS2, D+Vitrification2 نسبت به گروه کنترل کاهش یافته و دارای اختلاف معنی داری با گروه کنترل می باشند(P<0.05). درصد زنده مانی گروهDocetaxel+ Vitrification2 با گروه کنترل، دوستاکسل و Vitrification2 (P=0.05 دارای اختلاف معنی دار بوده(P<0.05)، در حالی که گروه Vitrification2 با گروه کنترل، دوستاکسل،D+VS2 (P<0.05) و D+Vitrification2 (P=0.05) دارای اختلاف معنی دار بود(P<0.05). گروه کنترل از نظر درصد لقاح آزمایشگاهی دارای تفاوت معنی دار با بقیه گروه ها (D+vitrification 2 و Vitrification2 و D+VS2 و دوستاکسل) میباشد(P<0.05). گروه دوستاکسل دارای اختلاف معنی دار با گروه های کنترل،D+ Vitrification2,Vitrification 2 می‌باشد(P<0.05)، در حالی که با گروه های Vitrification2 و D+Vitrification2 دارای اختلاف معنی دارتری می باشد(P<0.001). گروه D+ VS2 دارای اختلاف معنی دار با گروه های D+ Vitrification2,Vitrification2 می باشد(P<0.05). گروه D+Vit2 دارای اختلاف معنی دار با گروه های کنترل، دوستاکسل و D+VS2 می باشد(P<0.001) و گروه Vitrification2 با گروه های کنترل، دوستاکسل و D+VS2 دارای اختلاف معنی دار می باشد(P<0.001). جدول 3 مقایسه درصد بقاء و لقاح گروه های مختلف آزمایشی با یک دیگر را نشان می‌دهد مطابق جدول 3 درصد بقاء گروه های مختلف آزمایشی دارای اختلاف معنی دار با یک دیگر می باشد(P<0.05). هم چنین درصد لقاح گروه ها نیز دارای اختلاف معنی دار با یک دیگر می باشد(P<0.001). همان طور که در جداول 1و 2 و3 مشاهده می شود درصد بقاء تخمک های منجمد شده در گروه آزمایشی اول(1/81) نسبت به گروه دوم(75/82) کمتر بود اما این دو گروه از نظر آماری تفاوت معنی داری با یک دیگر نداشتند(P>0.05). هم چنین درصد تشکیل جنین های دو سلولی در گروه های انجمادی اول و دوم به ترتیب (2.15 62.26± و  4.6± 60.4) می باشد. این درصد نیز در گروه انجمادی اول نسبت به دوم کمتر بوده و از نظر آماری تفاوت معنی داری با یک دیگر نداشتند(P>0/05).

رنگ آمیزی اسکلت سلولی تخمک با آلفاتوبولین

رنگ آمیزی تخمک در گروه‌های کنترل و آزمایشی انجام گرفت. آرایش میکروتوبول و کروموزوم‌های واقع بر دوک تقسیم در گروه های کنترل و آزمایش در شکل 1 آورده شده است. همان‌گونه که در شکل نشان داده شده است، انجماد شیشه‌ای باعث به هم ریختگی ساختار دوک و کروموزوم‌ها در تخمک موش می‌گردد(شکل1 B,C). با توجه به شکل در گروه کنترل کروموزوم‌ها به صورت خوشه‌ای قرار گرفته و میکروتوبول‌ها از یک قطب به قطب دیگر با آرایش نرمال کشیده شده اند و هم چنین از قطب‌های دوک به سمت کروموزوم‌ها امتداد پیدا کرده اند. در گروه انجمادی اول دوک تقسیم آرایش غیر نرمال نسبت به گروه کنترل را نشان می‌دهند که میکروتوبول‌ها به صورت یک دوک تیپیک سازمان‌دهی نشده‌اند و کروموزوم‌ها به صورت غیر نرمالی پراکنده شده‌اند. در گروه انجمادی دوم دوک تقسیم آرایش نرمال ولیکن با فشردگی بیشتر نسبت به گروه کنترل را نشان می‌دهند. کروموزوم‌ها به صورت خوشه‌ای قرار گرفته اما نسبت به گروه کنترل پخش شدگی دارند، میکروتوبول‌ها از یک قطب به قطب دیگر با آرایش نرمال کشیده شده اند و هم چنین از قطب‌های دوک به سمت کروموزوم‌ها امتداد پیدا کرده که پیش انکوبه کردن تخمک‌ها با دوستاکسل 05/0میکرومولار به مدت 20 دقیقه قبل از انجماد در هر دو گروه انجمادی در ممانعت از آسیب‌های وارده به سیتواسکلتن تخمک موثر می‌باشد(شکل 1-C,D). نتایج تجزیه و تحلیل آماری نشان می‌دهد نسبت تخمک‌های با آرایش نرمال میکروتوبول در گروه‌های پیش انکوبه شده با دوستاکسل 05/0 میکرومولار(دوستاکسل+  انجماد شیشه ای) قبل از انجماد شیشه‌ای به طور معنی‌داری بالاتر از گروه‌های انکوبه نشده(انجماد شیشه‌ای) می‌باشد(05/0< P). هم چنین نسبت تخمک‌های با کروموزوم پراکنده در گروه‌های پیش انکوبه شده با دوستاکسل به طور معنی‌داری پایین تر از گروه‌های انکوبه نشده می‌باشد(05/0< P).در واقع نسبت تخمک‌های با آرایش نرمال میکروتوبول به طور معنی‌داری در گروه‌های غیر انجمادی بالاتر از گروه‌های انجمادی می‌باشد(05/0< P) و نسبت تخمک‌های با کروموزوم پراکنده در گروه‌های غیر انجمادی پایین تر از گروه‌های انجمادی می‌باشد(05/0< P) ولی بین دو گروه انجمادی اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد(05/0> P)(جدول4).

 

 

 

 

جدول1- نتایج انجماد شیشه‌ای تخمک با استفاده از کرایوتاپ در گروه انجمادی اول.

No. (%) of oocytes fertilization (two cell)	No. (%) of surviving oocytes after vitrification	Treatment group
80/71(88.6 ± 3.2) a	126/124 (98.4 ± 1.5) a	Fresh Control	1
99/83( 82.8 ± 5.2) b	132/122 (92.6 ± 3.2) ab	Docetaxel	2
150/115 ( 76.95 ± 2.03) b	134/113 (84.1 ± 3.3) ab	Docetaxel  + VS1	3
115/75 (65.3 ± 3.2) b	132/111( 85 ± 3.8) ab	Docetaxel  + Vitrification 1	4
105/61( 60.4 ± 4.6) b	123/98( 81.1 ± 5.8) b	Vitrification 1	5
0.001	0.028	P valu

* حروف متفاوت در هر ستون نشان دهنده معنی دار بودن اختلاف در(P<0.05) می‌باشد.

جدول2-نتایج انجماد شیشه‌ای تخمک در گروه انجمادی دوم.

No. (%) of oocytes fertilization (two cell)	No. (%) of surviving oocytes after vitrification	Treatment group 2
94/84 (89.47 ± 2.003) a	133/130 (97.79 ± 0.73) a	Fresh Control	1
83.86±1.55) b )99/83	136/124 ( 91.15±1.23) b	Docetaxel	2
121/97 (80.22± 0.83) b	146/130 (88.99±1/27) b	Docetaxel  + VS2	3
98/65 ( 66.26±1.45) b	138/121 (87.68± 0.43) b	Docetaxel  + Vitrification2	4
98/61 (62.26± 2.15) b	145/120 (82.75±1.33) b	Vitrification 2	5
0.000	0.000	P valu

* حروف متفاوت در هر ستون نشان دهنده معنی دار بودن اختلاف در(P<0.05) می‌باشد.

جدول3- مقایسه درصد بقا و درصد لقاح گروه های مختلف آزمایشی با یکدیگر.

ANOVA
		Sum of Squares	Df	Mean Square	F	Sig.
survival.rate	Between Groups	856.609	7	122.373	2.580	.036
	Within Groups	1280.700	27	47.433
	Total	2137.309	34
Fertilization	Between Groups	5015.362	7	716.480	22.388	.000
	Within Groups	864.068	27	32.003
	Total	5879.431	34

 

شکل 1- در این تصویر فلش نشان دهنده کروموزوم‌ها به رنگ قرمز و میکروتوبول‌ها(دوک تقسیم) به رنگ سبز می‌باشد .A :کنترل کروموزوم‌ها به صورت خوشه‌ای قرار گرفته و میکروتوبول‌ها از یک قطب به قطب دیگر با آرایش نرمال کشیده شده‌اند و هم چنین از قطب‌های دوک به سمت کروموزوم‌ها امتداد پیدا کرده اند. B: گروه انجمادی اول میکروتوبول‌ها به صورت یک دوک تیپیک سازمان‌دهی نشده‌اند و کروموزوم‌ها به صورت غیر نرمالی پراکنده شده‌اند. C: گروه انجمادی دوم D:دوستاکسل +گروه انجمادی اول E: دوستاکسل + گروه انجمادی دوم.

 

 

جدول 4- نتایج حاصل از رنگ آمیزی تخمک با آنتی بادی آلفاتوبولین.

گروه‌ها	% میکروتوبول نرمال	%میکروتوبول غیرنرمال	%کروموزم پراکنده	%کروموزم فشرده
کنترل	94±1	5/5± 33/0	73/20 ±15/1	1/4 ±57/0
دوستاکسل	94±9/2	1/5±  33/0	01/21 ±85/1	1/5 ±33/0
دوستاکسل+  محلول انجمادی اول	82±57/0	1 ± 08/12	45/19 ±33/0	37/7 ±33/0
دوستاکسل+  محلول انجمادی دوم	83±61/0	15/0±1/12	2/18±21/0	21/7±18/0
انجماد شیشه‌ای اول	57±1 a	5/39  ± 66/0	1/38 ±33/0 a	66/16 ±33/0 a
انجماد شیشه‌ای دوم	56±51/0 a	9/38±11/0	12/37±23/0 a	55/15±18/0 a
دوستاکسل+ انجماد شیشه‌ای اول	66±57/0 b	1/34 ±33/0	b 18/21	8/7 ±33/0 b
دوستاکسل+ انجماد شیشه‌ای دوم	66±44/0 b	2/34±11/0	b 66/19	1/7±12/0 b

* حروف متفاوت در هر ستون نشان دهنده معنی دار بودن اختلاف در(P<0.05) می‌باشد.

 

بحث و نتیجه گیری

مطالعه حاضر به منظور ارزیابی اثرات انجماد شیشه‌ای روی زنده ماندن، لقاح آزمایشگاهی و فراساختار تخمک‌های بالغ موش در مرحله متافاز دوم انجام شد. منجمد کردن تخمک یک روش حفظ باروری در خانم‌ها می‌باشد. هر چند که میزان حاملگی اندک و تعداد محدودی تولد زنده از تخمک‌های منجمد شده گزارش شده است. یکی از مشکلاتی که در مورد انجماد تخمک‌های بالغ وجود دارد، مقاومت کمتر غشای این اووسیت‏ها نسبت به کاهش درجه حرارت و آسیب‏های ناشی از سرما به‏دلیل داشتن ترکیب لیپیدی متفاوت در مقایسه با اووسیت‏های نابالغ و در نتیجه به هم ریختگی آرایش اندامک‌های سلولی بویژه اسکلت سلولی می‌باشد(8). این عامل منجر به کاهش توانایی زنده مانی تخمک و جنین پس از انجماد می‌گردد. به‏علاوه نتایج نشان داده است که غشای اووسیت‏های بالغ دارای یک ترکیب لیپیدی متفاوت در مقایسه با اووسیت‏های نابالغ بوده و نسبت به کاهش درجه حرارت و آسیب‏های ناشی از سرما دارای مقاومت کمتری هستند(29). بنابراین با انجماد اووسیت‏های نابالغ می‏توان بر این مشکلات غلبه نمود. مطالعات فراساختاری نشان دادند که انجماد سبب کاهش تعداد گرانول‏های قشری در اووسیت‏های بالغ انسانی می‏شود(27). در یک مطالعه انسانی نشان داده شده است که فرآیند انجماد سبب کاهش تعداد گرانول‏های قشری در ناحیه قشری و ظهور واکوئل‏ها در سیتوپلاسم اووسیت‏های بالغ و نابالغ می‏شود که ممکن است نشان دهنده آسیب ساختاری به آن‏ها باشد(13). اگزوسیتوز زودرس گرانول‏های قشری در اووسیت‏های انسانی که در معرض PrOH و یا DMSO قرار گرفتند نشان داده شده است. مشخص شده است که در تخمک‌ها در اثر انجماد شیشه ای سطح رادیکال‌های آزاد افزایش یافته و ظرفیت آنتی اکسیدانی کاهش می‌یابد؛ هم چنین میکروتوبول‌ها دچار آسیب شده و در نتیجه توزیع میتوکندری‌ها در سطح تخمک دچار اختلال می‌شود. با توجه به این که میکروتوبول‌ها و دیگر فیبرهای اسکلت سلولی ممکن است در طول انجماد شیشه‌ای دچار آسیب شده و در نتیجه باعث شکست در پروسه لقاح پس از ذوب شدن گردند، پایداری رشته‌های دوکی برای انجماد شیشه‌ای موفق تخمک ها بسیار مهم می‌باشد. دوستاکسل یک عامل پایدار کننده است که می‌تواند با مهار تجمع میکروتوبول‌های توبولین در طی انجماد، باعث تثبیت میکروتوبول‌ها شود(35). در این مطالعه، میزان بقا و لقاح تخمک‌های منجمد و ذوب شده که قبل از انجماد با دوستاکسل پیش انکوبه شدند، بهتر از تخمک‌های پیش انکوبه نشده بود. بنابراین، آرایش نرمال اسکلت سلولی، گرانول‌های قشری تخمک و میتوکندری پس از انجماد و ذوب می‌تواند با سطح متابولیسم، تکثیر و تمایز سلولی وابسته باشد. یکی از مهم ترین آسیب‌های مرتبط با انجماد آسیب به سیستم اسکلت سلولی تخمک است. بر اساس نتایج مطالعات قبلی، پس از انجماد شیشه‌ای و ذوب، دوک‌های میتوزی در زمان مشخص بازسازی شده و تکوین جنینی بهبود می‌یابد(11،34). نظم آرا و همکاران در سال 1390 نشان دادند روش انجماد شیشه ای با استفاده از کرایوتاپ و ضدیخ اتیلن گلیکول، دی متیل سولفوکساید و سوکروز تأثیری بر پتانسیل تکوینی و میزان ATP تخمک موش در مراحل مختلف تکوینی نداشت اما بر روی پراکندگی میتوکندری اثر گذار بود. Giaretta و همکاران در 2013 برای اولین بار اهمیت Resveratrol را در انجماد شیشه ای تخمک بررسی کردند. نتایج آن ها نشان داد 2µM R در IVM و فازهای منجمد ذوب شده توانایی زنده مانی تخمک‌ها را افزایش داده و فرایند آپاپتوز را تعدیل می‌کند.رنگ آمیزی TITC-VAD-FMK تمایل به افزایش اووسیت های زنده با کاسپازهای غیر فعال در همه گروه‌های Resveratrol در مقایسه با CTR را نشان می‌دهد و یک تفاوت معنی دار فقط بین A و گروه‌های CTR وجود دارد. به هر حال درصد زنده مانی اووسیت ها با کاسپاز فعال با وجود Resveratrol تحت تاثیر قرار نمی‌گیرد. مطالعات قبلی نشان می‌دهد که با واسطه PS فاگوسیتوز می‌تواند بدون فعال شدن کاسپازها رخ دهد. نتایج Giaretta و همکاران در 2013 نشان داد ترکیبات Resveratrol در فازهای مختلف IVM و فرایند انجماد شیشه ای- ذوب می‌تواند فرایند آپاپتوز را تعدیل کند و پایداری اووسیت های خوک را در مقابل آسیب های انجمادی بهبود ببخشد. آسکوربات( 01/0mMol/L) شرح داده شده که ترازهای پراکسید هیدروژن را در جنین های موش کاهش می‌دهد و وقتی به محلول های انجماد شیشه ای یا انجماد آهسته اضافه می‌شود توده سلولی داخلی را بالا می‌برد و β مرکاپتو اتانول (50mMol/L ) فعالیت Ros را پایین می‌آورد اما نمی‌تواند توانایی لقاح و زنده مانی را در اووسیت های M II منجمد ذوب شده بهبود ببخشد در حالی که به طور معنی داری قابلیت تشکیل بلاستوسیست را در اووسیت های انجمادی خوک بعد از لقاح آزمایشگاهی را افزایش می‌دهد(14). نتایج ما نیز تایید کننده این مطلب می‌باشد که می‌توان با استفاده از دوستاکسل میزان آسیب را به حداقل رسانده تا سیتواسکلتون و دوک میتوزی تخمک‌ها در مدت زمان کوتاه‌تری به آرایش نرمال بازگردند. در مطالعه حاضر میزان تکامل بـه جنـین دوسـلولی پـس از انجمـاد شیـشه ای در هر گروه(انجمادی و غیر انجمادی) کاهش معنی‌داری را با گروه کنترل نشان داد. در تایید این نتایج عابدپور و همکارانشدر سال 2015 ثابت کردند که انجماد شیشه‌ای باعث کاهش معنی‌داری در سرعت بلوغ تخمک‌ها می‌شود(1). در مطالعه آن ها سرعت لقاح تخمک‌های منجمد شده اختلاف معنی‌داری با یک دیگر نداشتند اما هر کدام از آن ها به طور معنی‌داری کمتر از گروه کنترل بودند. عابدپور و همکارانش هم چنین در سال 2015 نشان دادند انجماد شیشه‌ای با استفاده از کرایوتاپ باعث آسیب به تخمک از طریق کاهش سرعت بلوغ و لقاح می‌شود. در مطالعه حاضر درصد لقاح در گروه‌های پیش انکوبه شده با دوستاکسل بیشتر از گروه‌های انکوبه نشده بود(1).در تحقیــق چزمبت و همکاران(7) بر روی تخمک گاو، درصد بقاء تخمک ها بیشتر از نتایج به دست آمده از تحقیق ما بوده که این می تواند ناشی از تفاوت در گونه حیوانی، حساسیت متفاوت گونه های مختلف به انجماد، درصد متفاوت ضدیخ، استفاده از ضدیخ ها و پروتوکل‌های انجمادی متفاوت باشد. گزارش شده که نگهداری تخمک‌ها در دمای فوق پایین(196- درجه سانتی گراد) باعث القا دپلیمریزاسیون میکروتوبول‌ها در تخمک ها می‌شود(26). به علاوه دمای فوق پایین باعث شکسته شدن اسکلت سلولی و کروموزوم‌های تخمک می‌گردد که منجر به تکوین سلولی ناکامل و شکست در پروسه لقاح پس از ذوب می‌شود(5،6). این مطلب پیشنهاد می‌کند پایداری فیبرهای دوک با دوستاکسل می‌تواند در موفقیت انجماد شیشه‌ای تخمک ها در دماهای فوق پایین مهم باشد. نتایج مطالعات قبلی نشان دادند پیش انکوبه کردن تخمک‌های گاو با تاکسان‌هایی از قبیل پاکلیتاکسل در غلظت پایین(1 میکرومولار) برای 30 دقیقه قبل از انجماد شیشه‌ای می‌تواند از شکست اسکلت سلولی در طول انجماد شیشه‌ای ممانعت کرده و در نتیجه باعث افزایش نرخ بقا پس از ذوب شده و تکوین جنینی متعاقب آن را بهبود می‌بخشد(26،33). هم چنین مطالعات قبلی نشان دادند که دوستاکسل نرخ گسترش توبولین به میکروتوبول‌های پایدار را افزایش داده و مانع از دپلیمریزاسیون آن ها به هنگام مواجهه با سرما می‌شوند(18،30).در مطالعه دیگری گزارش شد که دوستاکسل می‌تواند میکروتوبول را توسط اتصالات محکم بین دیمرهای αوβ –توبولین و تغییرات بعدی در اتصال MAP پایدار کند که این از آسیب یا دپلیمریزاسیون در طول انجماد شیشه‌ای تخمک‌ها جلوگیری می‌کند(11). در مطالعه حاضر تخمک‌های پیش انکوبه شده با دوستاکسل به مدت 20 دقیقه قبل از انجماد شیشه‌ای سهم بیشتری از تخمک‌های منجمد ذوب شده با آرایش میکروتوبول و کروموزوم نرمال و هم چنین نرخ بالاتر بقا و تسهیم را در مقایسه با تخمک‌های پیش انکوبه نشده را دارند. این نتایج به خوبی بر این مطلب دلالت دارد که پایداری اسکلت سلولی تخمک ها توسط دوستاکسل می‌تواند آسیب القا شده توسط انجماد شیشه‌ای را کاهش دهد. از محدودیت‌های این مطالعه می‌توان به کمبود هزینه‌ها و دسترسی سخت به مواد اولیه که از خارج از کشور تامین می‌شود، اشاره کرد. در صورت تامین هزینه کافی می‌توانارزیابی‌های بیشتری در زمینه فراساختار و تغییرات ژنتیکی تخمک انجام گرفته شود. در یک نتیجه‌گیری کلی می‌توان گفت با انکوبه کردن تخمک‌های بالغ مرحله متافاز دوم موش با دوستاکسل به مدت 20 دقیقه قبل از انجماد شیشه‌ای در غلظت 05/0 میکرومولار، درصد بقاء و لقاح تخمک‌ها بهبود یافته و آسیب اسکلت سلولی مهار می‌شود. از این نتایج می‌تواند جهت بهبود تکنیک‌های کمک باروری و افزایش نرخ موفقیت در لقاح آزمایشگاهی استفاده کرد.

 

مراجع

1.Abedpour, N., Rajaei, F. (2015). Vitrification by cryotop and the maturation, fertilization, and developmental rates of mouse oocytes. Iranian Red Crescent Medical Journal, 17(10); e18172.

2.Almasi- turk, S., Roozbehi, A. (2013). Mouse oocytes and embryos cryotop-vitrification using low concentration solutions: Effect of meiotic spindle, genetic material array and developmental ability. Iranian Journal of Basic Medial Science, 16; 599-609.

3.Amidi, F., Khodabandeh, Z/, Mogahi, MHN. (2018). Comparison of the effects of vitrification on gene expression of mature mouse oocytes using cryotop and open pulled straw. International Journal of Fertility & Sterility, 12(1); 61.

4.Bissery, M-C. (1995). Preclinical pharmacology of docetaxel. European Journal of Cancer 31; S1-S6.

5.Boiso, I., Martí, M., Santaló, J., Ponsá, M., Barri, P.N., Veiga, A. (2002). A confocal microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human oocytes cryopreserved at the germinal vesicle and metaphase II stage. Human Reproduction, 17(7); 1885-1891.

6.Bouquet, M., Selva, J., Auroux, M. (1992). The incidence of chromosomal abnormalities in frozen thawed mouse oocytes after in-vitro fertilization. Human Reproduction, 7(1); 76-80.

7.Chasombat, J., Nagai, T., Parnpai, R., Vongpralub, T. (2015). Pretreatment of in vitro matured bovine oocytes with docetaxel before vitrification: effects on cytoskeleton integrity and developmental ability after warming. Cryobiology, 71(2); 216-223.

8.Ciotti, P. M., Porcu, E., Notarangelo, L., Magrini, O., Bazzocchi, A., Venturoli, S. (2009). Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility, 91(6); 2399-2407.

9.Cetin, Y., Bastan, A. (2006). Cryopre servation of immature bovine oocytes by vitrification in straws. Anim Reprod Sci, 92 (1); 29-36.

10.Dehghani, N., Dianatpour, M., Hosseini, S. E., Khodabandeh, Z., Daneshpazhouh, H. (2019). Over expression of mitochondrial genes (mitochondrial transcription factor a and cytochrome c oxidase subunit 1) in mouse metaphase ii oocytes following vitrification via cryotop. Iran J Med Sci, 44(5); 406-414.

11.Devillard, L., Vandroux, D., Tissier, C., Dumont, L., Borgeot, J., Rochette, L. (2008). Involvement of microtubules in the tolerance of cardiomyocytes to cold ischemia-reperfusion. Molecular and Cellular Biochemistry, 307(1-2); 149-157.

12.Fuchinoue, K.,Fukunaga, N., Chiba, S., Nakajo, Y., Yagi, A., Kyono, K. (2004). Freezing of human immature oocytes using cryoloops with taxol in the vitrificationsolution. J. Assist.Reprod.Genet, 21; 307-309.

13.Ghetler, Y., Skutelsky, E., Ben Nun, I., Ben Dor, L. (2006). Huma oocyte cryopreservation and the fate of cortical granoles. Fertil and Steril, 86;210-216.

14.Giaretta, E., Spinaci, M., Bucci, D., Tamanini, C., Galeati, G. (2013). Effect of resveratrol on vitrified porcine oocytes. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 1-7.

15.Gook, DA., Edgar, DH. (2007). Human oocyte cryopreservation. Hum Reprod Update, 13(6); 591–605.

16.Gualtieri, R., Iaccarino, M., Mollo, V., Prisco, M. (2009). Slow cooling of human oocytes: ultrastructural injuries and apoptotic status. Fertil Steril, 91(4); 1023-34.

17.Gueritte-Voegelein, F., Guenard, D., Lavelle, F., Le Goff, M.T., Mangatal, L., Potier, P. (1991). Relationships between the structure of taxol analogs and their antimitotic activity. Journal of Medicinal Chemistry, 34(3); 992-998.

18.Huang, J., Li, Q., Zhao, R., Li, W., Han, Z. (2007). Effect of sugars on maturation rate of vitrified-thawed immature porcine oocytes. Anim Reprod Sci, Mar 30.

19.Huang, J. Y., Chen, H, Y., Park, J. Y. S., Tan, S. L., Chian, R-C. (2008). Comparison of spindle and chromosome configuration in in vitro-and in vivo-matured mouse oocytes after vitrification. Fertility and Sterility, 90(4); 1424-1432.

20.Jahromi, Z, K., Amidi, F., Mugehe, S., Sobhani, A., Mehrannia, K., Abbasi, M., et al. (2010). Expression of heat shock protein (HSP A1A) and MnSOD genes following vitrification of mouse MII oocytes with cryotop method. Yakhteh Med J, 12(1); 113-119.

21.Jain, J., Paulson, RJ. (2006). Oocyte cryopreservation. Fertil Steril, 86(3);1038-1046.

22.Jimenez-Trigos, E., Naturil-Alfonso, C., Marco-Jimenez, F. (2013). Post warming competence of in vivo matured rabit oocytes treated with cytoskeletal stabilization (taxol) and cytoskeletal relaxant(cytochalasin B) befor vitrification. Reprod. Domest.Anim,45;15-19.

23.Kuwayama, M. (2007). Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: the Cryotop method. Theriogenology, 67(1); 73-80.

24.Khodabandeh, JZ., Amidi, F., Nouri, MS., Sobhani, A., Mehranian, KM., Abbasi, M. (2010). Expression of heat shock protein(HSP A1A) and MnSOD genes following vitrification of mouse MII oocytes with cryotop method Cell Journal, 12(1); 1-119.

25.Lassalle, B., Testart, J., Renard, JP. (1985). Human embry features that influence the success of cryopre servation with the use of 1, 2 propanediol. Fertil Steril., 44(5); 645-651.

26.Morató, R., Izquierdo, D., Albarracín, J. L., Anguita, B., Palomo, M.J. (2008). Effects of pre‐treating in vitro‐matured bovine oocytes with the cytoskeleton stabilizing agent taxol prior to vitrification. Molecular Reproduction and Development: Incorporating Gamete Research, 75(1); 191-201.

27.Nottola, SA., Coticchio, G., Sciajno, R., Gambardella, A. (2009). Ultrastructural markers of quality in human mature oocytes vitrified using cryoleaf and cryoloop. Reprod BioMed Online, 19;17-27.

28.Park, SE., Chung, H.M., Cha, K.Y., Hwang, W.S. (2001). Cryopreservation of ICR mouse oocytes: improved post-thawed preimplantation development after vitrification using Taxol, a cytoskeleton stabilizer, fertil. Steril, 75; 1177-1184.

29.Rao, GD., Tan, SL. (2005). In vitro maturation of oocytes. Semin Reprod Med, 23(3); 242-247.

30.Ringel, I., Horwitz, S. B. (1991). Studies with RP 56976 (taxotere): a semisynthetic analogue of taxol. JNCI: Journal of the National Cancer Institute, 83(4); 288-291.

31.Roozbehi, A. (2013). Mouse oocytes and embryos cryotop-vitrification using low concentrated solutions: Effects on meiotic spindle, genetic material array and developmental ability. Iranian Journal of Basic Medical Sciences, 16(4); 590.

32.Rienzi, L., Martinez, F., Ubaldi, F., Minasi, MG., Iacobelli, M., Tesarik, J. (2004). Polscope analysis of meiotic spindle changes in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures. Hum Reprod, 19; 655–9.

33.Schmidt, D., Nedambale, T., Kim, C., Maier, D., Yang, X., Tian, X. (2004). Effect of cytoskeleton stabilizing agents on bovine matured oocytes following vitrification. Fertility and Sterility, 82; S26.

34.Shaw, JM., Oranratnachai, A., Trounson, AO. (2000). Cryopreservation of oocytes and embryos, Handbook of in Vitro Fertilization ;chapter sixteen.

35.Shi, W-Q., Zhu, S-E., Zhang, D., Wang, W-H., Tang, G-L., Hou, Y-P. (2006). Improved development by Taxol pretreatment after vitrification of in vitro matured porcine oocytes. Reproduction, 131(4); 795-804.

36.Sparreboom, A., Nooijen, W., Beijnen, J. (1998). Preclinical pharmacokinetics of paclitaxel and docetaxel. Anti-Cancer Drugs, 9(1); 1-17.

37.Vajta, GC., Nagy, ZP. (2006). Are programmable freezers still needed in the embryo laboratory? Review on vitrification. Reprod Biomed Online, 12(6); 779-796.

38.Zhou, C-J., Wang, D-H., Niu, X-X., Kong, X-W., Li, Y-J., Ren, J. (2016). High survival of mouse oocytes using an optimized vitrification protocol. Scientific Reports, 6; 19465..