کلون سازی و بیان ژن هماگلوتینین ویروس آنفولانزا H9N2 در سلول Sf9

فصلنامه علمی پژوهشی دنیای میکروب ها

مقاله 2، دوره 15، شماره1(پیاپی 50)، خرداد 1401، صفحه 32-40   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

محدثه محب شاهدین¹؛ مجید مقبلی^{* 2}؛ محمد کارگر³؛ مجتبی جعفرینیا⁴

¹گروه زیست شناسی ، واحد مرودشت ، دانشگاه آزاد اسلامی ، مرودشت ایران

²عضوهیئت علمی

³، گروه میکروبیولوژی ، دانشکده زیست شناسی ، واحد جهرم ،دانشگاه آزاد اسلامی،

⁴گروه زیست شناسی واحد مرودشت دانشگاه آزاد اسلامی مرودشت ایران

چکیده

سابقه و هدف: ویروس آنفولانزا یکی از مهمترین عوامل مرگ و میر طیور بر اثر بیماریهای تنفسی است که سالیانه خسارات زیادی را به صنعت پرورش طیور در سراسردنیا وارد می‌کند.پروتین هماگلوتینین(HA)  از عوامل اصلی در بیماری‌زایی این ویروس است لذا هدف از پژوهش حاضر کلون کردن و بیان این ژن در سلول Sf9 با استفاده از باکولوویروس می‌باشد.
مواد و روشها: بعد از جداسازی ژنوم ویروس آنفولانزا H9N2، ژنHA  توسط پرایمرهای اختصاصی  با روشهایRT-PCR  و PCR تکثیر و با کمک وکتورpFastBac Dual  به بکمید منتقل گردید. بکمید نوترکیب واجد ژن HA به سلول میزبانDH10Bac انتقال داده شد. با ترانسفکت کردن سلولSf9  با بکمید نوترکیب، چگونگی بیان و میزان بیان پروتین نوترکیب با روشهای       SDS-PAGE، western blotting و بردفورد بررسی شد.
یافتهها: پروتین حاصل از بکمید نوترکیب با استفاده ازSDS PAGE  بررسی و خلوص آن تائید شد. غلظت پروتین نوترکیب در محلول رویی سلولهایSf9  آلوده به ویروس نوترکیب µg/ml 138 تخمین و توسطwestern blotting  تائید شد.
نتیجهگیری: در تحقیق حاضر ژن HA بر روی وکتورPfastBacDual  با موفقیت کلون شد و بعد از انتقال بر روی بکمید و ترانسفکت به سلولSf9  بیان مناسبی از ژن در محلول رویی سلولهایSf9  بدست آمد. با انجام آزمایشهای حیوانی، این پروتین میتواند به عنوان واکسن نوترکیب بر علیه آنفولانزا H9N2 مورد استفاده قرار گیرد.
 

کلیدواژه‌ها

ویروس آنفولانزا؛ باکولوویروس؛ وکتور PfastBacDual؛ واکسن نوترکیب

مراجع

References

1. Bahari P, Pourbakhsh SA, Shoushtari H, Bahmaninejad MA. Molecular characterization of H9N2 avian influenza viruses isolated from vaccinated broiler chickens in northeast Iran. Tropical animal health and production. 2015 Aug;47(6):1195-201.
2. Barjesteh N, O'Dowd K, Vahedi SM. Antiviral responses against chicken respiratory infections: focus on avian influenza virus and infectious bronchitis virus. Cytokine. 2020 Mar 1;127:154961..
3. Jawetz, M. (2016). Medical Microbiology 27 edition, Lange
4. Carroll, K. C., et al. (2015). Jawetz Melnick and Adelbergs Medical Microbiology 27 E, McGraw-Hill Education.
5. Nicholson, K. G., et al. (1998). Textbook of influenza, Blackwell Science Ltd.
6. Bommakanti G, Citron MP, Hepler RW, Callahan C, Heidecker GJ, Najar TA, Lu X, Joyce JG, Shiver JW, Casimiro DR, ter Meulen J. Design of an HA2-based Escherichia coli expressed influenza immunogen that protects mice from pathogenic challenge. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2010 Aug 3;107(31):13701-6.
7. Adel A, Arafa A, Hussein HA, El-Sanousi AA. Molecular and antigenic traits on hemagglutinin gene of avian influenza H9N2 viruses: Evidence of a new escape mutant in Egypt adapted in quails. Research in veterinary science. 2017 Jun 1;112:132-40.
8. Gaikwad SS, Lee HJ, Kim JY, Choi KS. Expression and serological application of recombinant epitope-repeat protein carrying an immunodominant epitope of Newcastle disease virus nucleoprotein. Clinical and experimental vaccine research. 2019 Jan;8(1):27.
9. Swayne, D. and D. Halvorson (2008). Influenza in Diseases of Poultry, (eds. Saif, YM, Fadly, AM, Glissom, JR, McDougald, LR, Nolan, LK & Swayne, DE) 153–184, Blackwell.
10. Sambrook J, Russell DW. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 Jun 1;2006(1):pdb-rot3932.
11. Gaikwad SS, Lee HJ, Kim JY, Choi KS. Expression and serological application of recombinant epitope-repeat protein carrying an immunodominant epitope of Newcastle disease virus nucleoprotein. Clinical and experimental vaccine research. 2019 Jan;8(1):27
12. Schägger H. Tricine–sds-page. Nature protocols. 2006 Jun;1(1):16.
13. Ellebedy, A. and R. Webby (2009). "Influenza vaccines." vaccine 27: D65-D68
14. Kuchipudi SV, Nissly RH. Novel flu viruses in bats and cattle:“Pushing the Envelope” of Influenza Infection. Veterinary sciences. 2018 Sep;5(3):71.
15. Skehel, J. J. and D. C. Wiley (2000). "Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin." Annual review of biochemistry 69(1): 531-569.
16. Steel, J., et al. (2010). "Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain." MBio 1(1): e00018-00010.
17. Vemula, S. V., et al. (2013). "Broadly protective adenovirus-based multivalent vaccines against highly pathogenic avian influenza viruses for pandemic preparedness." PloS one 8(4).
18. Hajam, I. A., et al. (2020). "Intranasally administered protein coated chitosan nanoparticles encapsulating influenza H9N2 HA2 and M2e mRNA molecules elicit protective immunity against avian influenza viruses in chickens." Veterinary research 51(1): 1-17.
19. Roche X, Fredrick K, Kamata A, Okuthe S, Kone P, Wiersma L, Von Dobschuetz S, Soumare B, Makonnen Y, Morzaria S, Lubroth J. 2016–2018 Spread of H5N8 highly pathogenic avian influenza (HPAI) in sub-Saharan Africa.
20. Subathra M, Santhakumar P, Pardhasaradhi P, Narasu ML, Chakravarty C, Lal SK. Cloning, expression and purification of haemagglutinin and neuraminidase gene of highly pathogenic avian influenza H5N1 in Escherichia coli. Current Trends in Biotechnology and Pharmacy. 2012 Apr 1;6(2):222-8.
21. Bidram M, Behzadian F, Fotouhi F, Fazeli M. Cloning and prokaryotic expression of the globular head domain of hemagglutinin antigen (HA1) of influenza A (H3N2) virus in        Escherichia coli and Bacillus subtilis. Archives of Medical Laboratory Sciences. 2017;3.