بررسی توزیع ژن‌های مولد بیوفیلم در سویه‌های استافیلوکوکوس ارئوس جدا شده از شیرهای خام عرضه‌شده در شهرستان سنندج

بهداشت مواد غذایی

مقاله 1، دوره 4، 2 (14) تابستان، شهریور 1393، صفحه 1-8   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

مهسا شجاعی¹؛ هیوا کریمی دره آبی^{* 2}؛ جوادی افشین³

¹دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات کردستان، دانشجوی کارشناسی ارشد علوم و صنایع غذایی، سنندج، ایران

²دانشگاه آزاد اسلامی، واحد سنندج، استادیار گروه بهداشت موادغذایی، سنندج، ایران

³دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تبریز، دانشیار گروه بهداشت مواد غذایی، تبریز، ایران

چکیده

   استافیلوکوکوس ارئوسیکی از عوامل اصلی بیماری ورم پستان گاوی می‌باشد. این باکتری گستره وسیعی از عفونت‌ها و بیماری‌های تهدیدکننده زندگی را در انسان ایجاد می‌نماید. عواملحدتمختلفیدربیماری‌زاییاین باکترینقشدارند یکی از مهم‌ترین فاکتورهای حدت استافیلوکوکوس ارئوس قابلیت تشکیل بیوفیلم می‌باشد. این باکتری قادر به تولید پلی‌ساکاریدها و فاکتورهای پروتئینی چسبیده به سطح است که منجر به تولید بیوفیلم می‌شود. در این مطالعه به منظور بررسی میزان آلودگی استافیلوکوکوس ارئوس در شیرهای خام، از 120 نمونه شیر خام عرضه‌شده در سطح شهرستان سنندج نمونه‌برداری و با روش‌های متداول میکروبیولوژی کشت‌داده شده و نتایج با استفاده از PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. به منظور تشخیص تاییدی جدایه‌ها به عنوان استافیلوکوکوس ارئوس با استفاده از PCR ژن اختصاصی nucو برای شناسایی ژن‌های عامل تولیدکننده بیوفیلم fnbA، clfaB، icaD  و  icaA از پرایمرهای اختصاصی مربوط به هر ژن با استفاده از روش Multiplex PCRاستفاده گردید. با توجه به نتایج حاصل از کشت میکروبی و تایید آن با روش مولکولی، 49 جدایه بوسیله آزمایش‌های بیوشیمیایی استاندارد و نیز تکثیر ژن ترمونوکلئاز اختصاصی گونه (nuc) به‌عنوان استافیلوکوکوس ارئوس شناسایی شدند. بر اساس نتاییج حاصل از MultiplexPCR ژن‌های مولد بیوفیلم (38/69%)fnbA، (6/32%) clfaB، (77/38%) icaD  و (18/59%) icaAدر جدایه‌ها تشخیص داده شد. نتایج حاکی از آلودگی بالای شیرخام عرضه‌شده در سطح شهرستان سنندج به استافیلوکوکوس ارئوس و نیز قابلیت بالای جدایه‌ها در تشکیل بیوفیلم می‌باشند.

کلیدواژه‌ها

شیر خام؛ استافیلوکوکوس ارئوس؛ بیوفیلم؛ سنندج

اصل مقاله

مقدمه

   شیر و فرآورده‌های آن به عنوان یک محیط مغذی می‌توانند نقش بسیار موثری در انتقال انواع میکروارگانیسم‌های عامل فساد و عوامل بیماری‌زا به مصرف‌کننده می‌باشد(Anonymous, 2011).استافیلوکوکوس ارئوس به‌عنوان یکی از مهمترین عوامل بیماری‌زا می‌تواند در شیر و فراورده‌های آن تکثیر پیدا کرده و منجر به بیماری‌زایی در انسان شود از سوی دیگر می‌تواند از طریق تولید بیوفیلم نقش مهمی در ایجاد  بیماری مزمن ورم پستان ایفا نماید(Kumar and Anand, 1998). این باکتری قادر به تولید پلی ساکاریدها و فاکتورهای پروتئینی چسبنده به سطح است که از این طریق در تولید بیوفیلم نقش دارد. در حقیقت بیوفیلم، گروهی ازمیکرروارگانیسم‌ها می‌باشد که با شبکه‌ای از کانال‌های داخلی در ماتریکس گلیکو پروتئینی و پلی ساکاریدی خارج سلولی به نام ماده پلیمری خارج سلولی در ارتباط هستند. ماده پلیمری خارج سلولی از پلی ساکارید، پروتئین، فسفولیپید، اسید تیکوییک و دیگر مواد پلیمریک هیدراته با ۸۵ تا ۹۵ درصد آب تشکیل شده است و از این طریق می‌توانند باعث چسبیده شدن انواع عوامل بیماری‌زا در روی سطح داخلی کارتیه‌ها و سطوح تجهیزات صنایع غذایی شده که این روند باعث انتقال انواع میکروب‌های بیماری‌زا می‌گردد. از دیگر مشکلات بیوفیلم در صنایع غذایی تشکیل آن در مکان‌هایی مانند مبادله‌کننده‌های حرارتی ماشین‌آلات صنایع غذایی می‌باشد که باعث کاهش بازدهی انتقال حرارتی می‌شود. علاوه بر این برخی از میکروارگانیسم‌های موجود در بیوفیلم، واکنش‌های شیمیایی و بیولوژیکی را که منجر به خوردگی سطوح فلز می‌شوند کاتالیز می‌کنند (Costerton et al., 1999). در استافیلوکوکوس ارئوس تشکیل بیوفیلم مستلزم مجموعه ژن‌های(ica ADBC)است که با رمزگذاری آنزیم‌های دخیل در سنتز پلی‌ساکاریدهای چسبنده داخل سلولی (polysaccharide intercellular adhesin)صورت می‌گیرد. لوکوسica(Intercellular adhesion)از ژن‌های icaA، icaB، icaC و icaD تشکیل شده است. از میان ژن‌های لوکوسica ، icaA و icaDنقش بیشتری را برای تشکیل بیوفیلم در استافیلوکوکوس ارئوس و استافیلوکوکوس اپیدرمیس دارا می‌باشند(Foster and Hook, 1998). ژن‌های fnbA fnbB(fibronectin-binding protein)clfA,clfB(clumpingfactor  نیز نقشمهمی را در بالا رفتن احتمال چسبیدن باکتری به سطوح دارند(OConnell et al., 1998).

   هدف از انجام این مطالعه بررسی میزان درصد آلودگی شیرهای خام عرضه‌شده به استافیلوکوکوس ارئوس، و توانایی این میکروارگانیسم از نقطه نظر داشتن ژن‌های عامل حدت تولیدکننده بیوفیلم می‌باشد.

 

مواد و روش‌ها

   در این تحقیق 120 نمونه از شیرهای خام تولیدی از 8 مرکز عمده پرورش گاوهای شیری به صورت کاملاً تصادفی در سطح شهرستان سنندج در بازه زمانی دی ماه سال 91 تا اردیبهشت ماه سال92 در شرایط استریل نمونه‌برداری و در مجاورت یخ به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشکده علوم پزشکی کردستان انتقال داده شد.

 

جداسازی استافیلوکوکوس ارئوس

   برای ترغیب رشد استافیلوکوکوس 1 میلی‌لیتر از هر کدام از نمونه‌های اخذ شده بعد از یکنواخت کردن به 9 میلی‌لیتر محیط کشتCooked meat  براث (Merck، آلمان) انتقال داده و به مدت 24 تا 48 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرمخانه‌گذاری کرده سپس بر روی محیط کشت جامد Baird parker agar (Merck، آلمان) با استفاده از روش کشت سطحی کشت داده و در 37 درجه سلسیوس به مدت 48 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند. هر کدام از پرگنه‌های سیاه دارای هاله روشن را در مرحله بعد بر روی محیط کشت افتراقی  Mannitol salt  agar (Merck، آلمان) به منظور بررسی تخمیر مانیتول و انجام تست‌های بیوشیمیایی از جمله کاتالاز و کواگولاز مورد ارزیابی قرار گرفتند. جدایه‌های مانیتول، کاتالاز و کواگولاز مثبت به عنوان استافیلوکوکوس ارئوس فرض گردیده و تا زمان انجام آزمایشات مولکولی در محیط  Tryptic soy broth (Merck، آلمان) حاوی 15درصد گلیسرول در دمای 20 -درجه سلسیوس نگه‌داری شدند.

استخراج DNA

   هر کدام از پرگنه‌های خالص شده به 5/1 میلی‌لیتر نوترینت براث انتقال داده و 24 ساعت در 37 درجه سلسیوس گرم‌خانه‌گذاری شد و سپس با دور 7500 برای 10 دقیقه سانتریفیوژ گردید و در مرحله بعد به رسوب حاصله 100 میکرولیتر بافر پروتئاز و 5 میکرولیتر پروتئاز اضافه و به طور کامل به همزده و به مدت 30 دقیقه در 55 سلسیوس قرار داده شد. 100 میکرولیتر از هر نمونه با 400 میکرولیتر از محلول لیزکننده مخلوط شد و برای 15 تا 20 ثانیه ورتکس گردید. در مرحله بعد 300 میکرولیتر از محلول رسوب‌دهنده به مخلوط اضافه شد و به وسیله حرکت دورانی به مدت 3 تا 5 ثانیه مخلوط گردید و در دمای 20 – درجه سلسیوس برای 20 دقیقه قرار داده شد. سپس در دور 12000 برای 10 دقیقه سانتریفیوژ شده و مایع رویی خالی گردیده و یک میلی‌لیتر بافر شستشو به رسوب حاصله اضافه و برای 5-3 ثانیه مخلوط شد و به مدت 5 دقیقه در دور 12000 سانتریفیوژ شد، سپس بافر شستشو به طور کامل خالی گردید و برای 5 دقیقه در 65 درجه سلسیوس قرار داده شد تا خشک شود. ماده ته‌نشین در 30 میکرولیتر از بافر حل‌کننده به وسیله تکان دادن آرام و قرار دادن در 65 درجه سلسیوس برای مدت 5 دقیقه به طور کامل حل شد. مواد غیرمحلول با سانتریفیوژ به مدت 30 ثانیه در دور 12000 ته‌نشین شد. ماده شناور رویی حاوی DNA خالص است. غلظت DNA. بعد از الکتروفورز روی ژل الکتروفورز 2/1%  اندازه‌گیری شد ((http://cinnagen.com.

آزمون PCR برای شناسایی ژن ترمو نوکلئاز (nuc)

   جهت تشخیص تاییدی جدایه‌های مشکوک استافیلوکوکوسارئوس از نظر تکثیر ژن ترمونوکلئاز(nuc)از روش PCR استفاده گردید. واکنش PCR در حجم نهایی 50 میکرولیتر، که در این حجم DNA 2 μl، dNTPs 1μl  ، 1μl Taq DNA polymerase ،Primer 1μl ,Mgcl2 2.5μl ,Buffer (10X)6μl و D.W.36.5 μlاستفاده گردید.برای کنترل منفی از آب مقطر استریل به‌جای اسید نوکلئیک استفاده کرده و از DNA استخراج‌شده از سویه لیوفیلیزه استافیلوکوکوساورئوس ATCC 12228  به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. واکنش تکثیر با برنامه زمانی: دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سلسیوس به‌مدت 10 دقیقه، 37 چرخه دمایی شامل دناتوراسیون در 94 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، اتصال در55 درجه سلسیوس به مدت30 ثانیه و امتداد در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 5/1 دقیقه و در نهایت گسترش نهایی واکنش در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه انجام گرفت(Brakstad et al., 1992) .واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در دستگاه ترموسایکلر گرادیان دار (شرکت Ependorph) انجام گرفت. فرآورده PCR پس از الکتروفورز روی ژل آگاروز 2/1درصد و مشاهده در زیر دستگاه ماوراء بنفش بررسی شد. اندازه محصول  PCRبا استفاده از مارکرهای ساخت شرکت فرمنتاز کشور آلمان مشخص گردید. جدایه‌های استافیلوکوکوسارئوس پس از تشخیص قطعی وجود ژن ترمونوکلئاز به طول تقریبی 279 جفت باز به عنوان استافیلوکوکوسارئوس در نظر گرفته شدند.

آزمون مولتی پلکس PCR برای شناسایی ژن‌های مولد بیوفیلم

   این واکنش در حجم 50 میکرولیتر، که شامل کیت مستر PCR  10.5 میکرولیتر، 1 میکرولیتر پرایمر (μL 5/0 پرایمر forward و μL 5/0 پرایمر reverse), 3μL نمونه DNA هر کدام از سویه‌های جدا شده و μL 5/35 آب مقطر دوبار تقطیر شده برای رساندن به حجم رساندن تیوپ‌هایPCR  می‌باشد. توالی پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده برای ژن‌های icaD,clfB,icaAوfnbA مورد نظر در جدول 1 آمده است. تکثیر ژن هدف در ترموسایکلر با برنامه سیکل‌های حرارتی شامل مرحله شروع در دمای 94 درجه سلسیوس به مدت 4 دقیقه، 35 سیکل شامل 94 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، 55 درجه سلسیوس به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه و مرحله بسط نهایی در 72 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه صورت گرفت. محصولات حاصله پس از الکتروفورز روی ژل آگاروز 5/1% و با استفاده از دستگاه ژل داکیومنت مورد عکس‌برداری قرار گرفت. برای نشان دادن اندازه قطعات تکثیری 100 bp DNA Ladder استفاده شد (http://cinnagen.com).

 

 

 

جدول 1- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای جستجوی ژن‌ها

نام ژن‌	توالی پرایمر	دمای اتصال	اندازه محصول	منابع
icaD	5ʹ-ATGGTCAAGCCCAGACAGAG-3 ʹ 5ʹ-AGTATTTTCAATGTTTAAAGCAA-3ʹ	55	198	Rohde et al., 2001
clfB	5ʹ-ACATCAGTAATAGTAGGGGCAAC-3ʹ 5ʹ-TTCGCACTGTTTGTGTTTGCAC-3	55	203	Tristan et al., 2003
icaA	5-ACACTTGCTGGCGCAGTCAA-3ʹ 5’-TCTGGAACCAACATCCAACA-3ʹ	55	188	Rohde et al., 2001
fnbA	5ʹ-CATAAATTGGGAGCAGCATCA-3ʹ 5ʹ- ATCAGCAGCTGAATTCCCATT-3ʹ	55	128	Vancraeynest et al., 2004
nuc	5ʹ-GCGATTGATTGATGGTGATACGGTT-3ʹ 5ʹ-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3ʹ	55	279	Brakstad et al.,1992

یافته‌ها

   از 120 نمونه مورد بررسی، بر اساس روش کشت، تست‌های بیوشیمیایی استاندارد و انجام تست تائیدی مولکولی از نظر داشتن ژن ترمو نوکلئاز(nuc) اختصاصی گونه استافیلوکوکوس ارئوس، 49 نمونه (83/40%) از نقطه نظر آلودگی به استافیلوکوکوس ارئوس مثبت گزارش شدند (شکل 1).

 

 

 

 

 

شکل 1- ژل الکتروفورز محصول PCR ژن nuc به منظور شناسایی ژنوتیپی ایزوله‌های
مشکوک به  استافیلوکوکوس ارئوس. ستون M: نشانگر DNA، ستون 1: کنترل مثبت
  استافیلوکوکوس ارئوس ATCC-12228ستون2: کنترل منفی، ستون 3-6 ایزوله‌های مثبت
از نظراستافیلوکوس ارئوس، ستون‌های7: ایزوله‌های منفی از نظر استافیلوکوکوس ارئوس.

 

  

 

   در مطالعه حاضر هر یک از ژن‌های عامل حدت مولد بیوفیلم شامل icaD,clfaB, fnbA وicaA با استفاده از پرایمرهای اختصاصی با استفاده از روش مولتی پلکس PCR مورد آنالیز قرار گرفتند. فراوانی هر یک از ژن‌ها به ترتیب (38/69%)fnbA  (6/32%), clfaB(77/38%icaD18/59%)  icaA می‌باشد (شکل 2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل 2- نتایج PCR مربوط به سویه‌های استافیلوکوکوس ارئوس دارای ژن icaA، icaB، icaC و icaD

 

بحث و نتیجه‌گیری

   دسته وسیعی از میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا می‌توانند با تولید بیوفیلم، منبع مهمی برای گسترش عوامل عفونت‌زا در روی سطوح مورد تماس با انواع مواد غذایی باشند که در این میان  استافیلوکوکوس ارئوس به عنوان یکی از مهمترین عوامل بیماری‌زا می‌تواند در شیر و فراورده‌های آن تکثیر پیدا کرده و منجر به بیماری‌زایی در انسان گردد و از سوی دیگر می‌تواند از طریق تولید بیوفیلم نقش مهمی در ایجاد بیماری مزمن ورم پستان گاوی داشته باشد.(Armisalo et al., 2007) باکتری استافیلوکوکوس ارئوس در میان باکتری‌های دیگر از جهت تولید لایه لعابی (Slime layer) شناخته شده است. باکتری‌هایی که قادر به تولید لایه لعابی نیستند بایوفیلم ضعیف‌تری تشکیل می‌دهند. طبیعت شیمیایی این لایه چسبناک هنوز به طور کامل روشن نیست ولی شواهد نشان می‌دهد که عمدتا از پلی‌ساکاریدهای هیدراته تشکیل شده است. مک و همکاران در سال 1996 توانستند دو ساختار پلی‌ساکاریدی را از این لایه خالص‌سازی کنند. پلی‌ساکارید یک (بیش از 80%) یک هموگلیکان خطی از استخلاف بتا 1-6 متصل به ان استیل گلوکز آمین است، پلی‌ساکارید دو (کمتر از 20%) مقدار کمتری از استخلاف دی گلوکز آمینیل‌های غیر ان‌استیله دارد و در عوض فسفات و سوکسینات متصل به استر را دارا می‌باشد. پلی‌ساکارید یک دارای بار مثبت است در حالیکه پلی‌ساکارید دو دارای بار منفی می‌باشد. پلی‌ساکارید دو به عنوان یک ساختار منحصر به فرد با پلی‌ساکاریدی چسبنده داخل سلولی (PIA) در ارتباط بوده که فعالیتشان سبب تشکیل تجمعات سلولی می‌شود (Gotz, 2002).

   در این مطالعه میزان آلودگی شیر خام به استافیلوکوکوس ارئوس در شهرستان سنندج 83/40% گزارش شد. در مرحله بعد پس از ارزیابی میزان حضور ژن‌های عامل حدت تولید بیوفیلم از هر کدام از جدایه‌ها با استفاده از مولتی‌پلکس PCR فراوانی هر یک از ژن‌های icaD ,icaA.fnbA,clfB  به ترتیب 6/32%، 38/69%، 18/59%، 77/38% بود. در این مطالعه میزان حضور ژن fnbA  نسبت به بقیه بیشتر گزارش گردید.

   واسدوان و همکاران در سال 2003 گزارش کردند که از میان 35 جدایه استافیلوکوکوس ارئوس حاصله از ورم پستان همگی دارای ژن‌های لوکوس ica بودند (Vaseduan et al., 2003). مطالعات نشان می‌دهد که پروتئین‌های متصل شونده به فیبرونکتین (fnbpAو fnbpB) نقش بسیار مهمی در تجمع، اتصال و تهاجم استافیلوکوکوسارئوسبه سلول‌های غده پستان و از آن جمله غده پستان گاو دارند (Dziewanowska et al., 1999). تارک و همکاران در سال 2010 در یک تحققیق نشان دادند که 26/78%  از سویه‌های استافیلوکوکوس ارئوس جدا‌شده دارای ژن‌های icaA و icaDبوده‌اندکه این درصد بالای آلودگی با مطالعه ما هم‌خوانی دارد.

   سیفتیک و همکاران در سال 2009 گزارش کردند که 15 جدایه از 59 جدایه جدا شده از ورم پستان دارای هر دو ژن icaAو icaD بودند و 16 جدایه دارای ژن icaA و 38 جدایه به ترتیب دارای ژن icaDبودند. در مطالعه‌ای که توسط  دوران و همکاران در سال 2010 روی جدایه‌های استافیلوکوکوس ارئوس حاصله از زخم‌های جراحی به منظور شناسایی ژن‌های بیوفیلم انجام گردید، 69 جدایه از 88 جدایه مورد مطالعه (4/78 درصد) حاوی ژن cna و 86 جدایه (7/97%) حاوی ژن  fnbA  بوده‌اند. در مطالعه ایریو و همکاران در سال 2011 از میان 47 جدایه استافیلوکوکوس ارئوس جدا شده از خون 40 جدایه دارای ژن‌های ica بودند و در آزمایش تشخیص فنوتیپی بیوفیلم 25 جدایه در میکرو پلیت مثبت بود. آلودگی بالای شیر خام به استافیلوکوکوس ارئوس در این شهرستان نشان‌دهنده کاهش سطح بهداشتی در گاوداری‌ها و نیز رعایت نکردن موازین بهداشتی است. با توجه به نتایج بدست آمده توسط محققان دیگر و نتیجه مطالعه حاضر، در پژوهش ما نمونه‌ای یافت نشد که به لحاظ وجود 4 ژن مورد بررسی منفی باشد که این مطلب قابلیت بالای این باکتری را در تشکیل بایوفیلم نشان می‌دهد.

مراجع

• Aarnisalo, K., Lundén, J., Korkeala, H. and Wirtanen, G. (2007). Susceptibility of Listeriamonocytogenes strains to disinfectants and chlorinated alkaline cleaners at cold temperatures. LWT - Food Science and Technology, 40(6): 1041-1048.
• Anonymous. (2011). DQA—dairy quality assurance scheme regulations for Belgium. (Lastenboek IKM Productie) Version 5-11-86.
• Brakstad O.G., Aasbakk, K. and Maeland, J.A. (1992). Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. Journal. Clinical Microbiology, 30: 1654–1660.
• Ciftci, A., Findik A., Emek Onuk E. and Savasan S. (2009). Detection of meticillin resistance and slime factor production of s.aureus in bovin mastitis. Brazilian Journal of Microbiology, 40: 254-261.
• Costerton, J.W., Stewart, P.S. and Greenberg, E.P. (1999). Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections, 284: 1318–1322.
• Duran, N., Dogramaci, Y., Ozer, B., Demir, C. and Kalaci, A. (2010). Detection of adhesin genes and slime production among Staphylococci in orthopaedic surgical wounds. African Journal of Microbiology Research, 4(9): 708-715.
• Dziewanowska, K., Patti, J.M., Deobald, C.F., Bayles, K.W., Trumble, W.R. and Bohach, G.A. (1999). Fibronectin binding protein and host cell tyrosine kinase are required for internalization of Staphylococcus aureus by epithelial cells. Infection and Immunity, 67: 4673-78.
• Foster, T.J. and Hook, M. (1998). Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus. Journal. Trends Microbial, 6(12): 484–488.
• Gotz, F. (2002). Staphylococcus and biofilms Molecular Microbiology, (43): 1367-1378.
• Iorio, N.L., Lopes, A.P., Schuenck, R.P., Barcellos, A.G., Olendzki, A.N., Lopez, G.L., et al. (2011). A combination of methods to evaluate biofilm production may help to determine the clinical relevance of Staphylococcus in blood cultures. Microbiology and Immunology, 55(1): 28-33.
• Ní Eidhin, D., Perkins, S., Francois, P., Vaudaux, P., Hook, M., and Foster, T.J. (1998) Clumping factor B (ClfB), a new surface-located fibrinogen-binding adhesin of Staphylococcus aureus. Mol Microbiol30:245–257.
• O'Connell, D.P., Nanavaty, T., McDevitt, D., Gurusiddappa, S., Hook, M. and Foster, T.J. (1998). The fibrinogen-binding MSCRAMM (clumping factor) of Staphylococcus aureus has a Ca²⁺-dependent inhibitory site. The Journal of Biological Chemistry, 273(12): 6821–6829.
• Tarek, Z., Bochra, K., Hanene, M., Kacem, M. and Amina, B. (2010). A Microtiter plateassay for Staphylococcus aureus biofilm quantification at various pH levels and hydrogenperoxide supplementation. The New Microbiologica, 33(2): 137-145.
• Vasudevan, P., Nair, M.K., Annamalai, T. and Venkitanarayanan, K.S. (2003). Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation. Veterinary Microbiology, 92(1-2): 179-185.