معرفی و مقایسه روش‌های اندازه‌گیری خواص ضد‌کپکی باکتری‌های لاکتیکی در پنیر

بهداشت مواد غذایی

مقاله 2، دوره 3، 4 (12) زمستان، اسفند 1392، صفحه 9-21   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

حسین صداقت¹؛ محمدهادی اسکندری^{* 2}؛ مرضیه موسوی‌نسب³؛ سیدشهرام شکرفروش⁴؛ محمدامین حنیف‌پور⁵

¹دانش‌آموخته کارشناسی ارشد بخش علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

²استادیار بخش علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

³دانشیار بخش علوم و صنایع غذایی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران

⁴استاد بخش بهداشت مواد غذایی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شیراز، شیراز، ایران.

⁵مشاور صنعتی و مدیر عامل شرکت شیر پگاه فارس، شیراز، ایران

چکیده

روش­های آزمایشگاهی مختلفی برای بررسی اثر ضد­کپکی باکتری­های مولد اسید­لاکتیک ابداع شده است که بیشتر آن­ها در سطح محیط ­کشت این اثرات را بررسی می­کنند. اما به دلیل ترکیبات موجود در غذا و پیچیدگی روابط اجزای آن در بسیاری موارد ممکن است اثرات دیده شده در محیط کشت، در غذای واقعی دیده نشود. پژوهش­های مختلف در این رابطه بیشتر ظاهر ­نشدن کپک در سطح مواد ­غذایی را معیاری برای خاصیت ضد­کپکی میکروارگانیسم­های درون غذا دانسته­اند.از این رو ابداع و مقایسه­ روش­های کارآمد جهت بررسی خاصیت ضدکپکی باکتری­های مولد اسید­لاکتیک در مواد ­غذایی مفید می­باشد. در این بررسی از باکتری­های مولد اسید­لاکتیک تولید­کننده مواد ضد­قارچی در تولید پنیر استفاده شد و با استفاده از روش­های مختلف شامل آزمون Overlay  قطعات پنیر، آزمون Microdilution عصاره­های پنیر و رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر، اثر ضد­قارچی این باکتری‌ها بر علیه دو کپک flavusAspergillus   و  A. parasiticusبررسی شد. مقایسه نتایج مربوط به باکتری­های مولد اسید­لاکتیک و استارتر معمول در تولید پنیر، کارآمد بودن هر سه آزمون را در نشان دادن تفاوت بین نمونه‌ها، نشان داد. مقایسه نتایج آزمون­ها با یکدیگر نشان داد که نتایج آزمون Overlay قطعات پنیر و رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر با هم همبستگی مثبت و معنی‌داری داشته و این دو آزمون همانند هم اثر ضد­قارچی باکتری­ها را که شامل برهم‌کنش خود باکتری بر علیه کپک­ها و همچنین تولید مواد ضد­قارچی است، مشخص می‌سازند. البته به دلیل اینکه نمی‌توان OD را سنجشی برای رشد کپک دانست، استفاده از آزمون Microdilution در این مورد توصیه نمی‌شود.
 

کلیدواژه‌ها

باکتری‌های مولد اسیدلاکتیک؛ پنیر؛ ضدکپک؛ آزمونMicrodilution؛ آزمون Overlay

اصل مقاله

مقدمه

   امروزه علاقه مردم به غذا­­های عاری از مواد شیمیایی افزایش یافته است. این موضوع اهمیت استفاده از کشت­های میکروبی محافظت­کننده را نشان می­دهد. اصطلاح Biopreservation به کنترل یک میکروارگانیسم توسط میکروارگانیسم دیگر اطلاق می‌گردد که در سال­های اخیر اهمیت زیادی پیدا کرده است (Magnusson et al., 2003). نگه­دارنده­های بیولوژیکی مدت زمان ماندگاری را طولانی­تر می­کنند و سلامتی غذا را به خاطر فلور میکروبی طبیعی یا تکمیلی و محصولات ضدمیکروبی بهبود می­بخشند (Schnürer and Magnusson, 2003). واکنش بین قارچ­های مولد توکسین و دیگر میکروارگانیسم­ها یک پدیده­ معمول در طبیعت است که می­تواند رشد قارچ و تولید مایکوتوکسین­ها را تحت تاثیر قرار دهد (Hassan and Bullerman, 1997).

   باکتری­های مولد اسیدلاکتیک با تولید چندین ترکیب ضدمیکروبی قادرند میکروارگانیسم­های پاتوژن و مولد فساد را در مواد غذایی کنترل کنند. استفاده از باکتری­های مولد اسیدلاکتیک برای کنترل رشد کپک­ها می­تواند یک جایگزین مناسب برای نگه­دارنده­های شیمیایی باشد که علاوه بر تولید مواد ضدقارچی، می­توانند نقش مثبتی در طعم، بافت و ارزش تغذیه­ای غذا داشته باشند (Arendt et al., 2007; Guldfeldt et al., 2001). گزارش­هایی مبنی بر کنترل رشد میکروارگانیسم­ها و افزایش زمان نگه­داری توسط باکتری­های مولد اسیدلاکتیک در محصولات تخمیری ارائه شده است که نشان‌ دهنده­ کاهش خطرات تهدید کننده­ سلامتی توسط مایکوتوکسین­ها می­باشد (Gourama and Bullerman, 1995).

   جهت انتخاب باکتری­های مولد اسیدلاکتیک به عنوان یک نگه­دارنده­ بیولوژیکی، در ابتدا می­بایست اثرات آن‌ها را بر علیه میکروارگانیسم­های مورد نظر در محصولات غذایی هدف، بررسی نمود. روش­های آزمایشگاهی مختلفی برای بررسی اثر ضدمیکروبی باکتری­های مولد اسیدلاکتیک ابداع شده است که بیشتر آن­ها در سطح محیط کشت این اثرات را بررسی می‌کنند. این در حالی است که به دلیل ترکیبات موجود در غذا و پیچیدگی روابط بین اجزای آن در بسیاری از موارد ممکن است اثرات دیده شده در محیط کشت، در غذای واقعی دیده نشود.

   در مورد استفاده از باکتری‌های مولد اسیدلاکتیک به عنوان یک نگه‌دارنده‌ بیولوژیکی جهت مهار آلودگی‌های باکتریایی، شمارش اختصاصی باکتری‌های آلوده‌کننده یک معیار مناسب جهت تعیین میزان مهارکنندگی باکتری‌های مولد اسیدلاکتیک بر علیه این باکتری‌ها است و در پژوهش‌های گوناگون به عنوان یک روش معمول و کارآمد مورد استفاده قرار می‌گیرد (Settanni et al., 2011; Speranza et al., 2009).

   از آنجایی که کپک‌ها برای تکثیر تولید اسپور می‌کنند، لذا امکان ارزیابی میزان رشد آن‌ها از طریق شمارش تعداد امکان‌پذیر نمی‌باشد و جهت بررسی میزان رشد یا مهار رشد کپک‌ها در مواد غذایی می‌بایست به دنبال روش‌هایی غیر از شمارش بود. در این رابطه، پژوهش‌های مختلف عمدتاً رشد مستقیم کپک را در سطح مواد غذایی مد نظر قرار داده و عدم ظهور پرگنه کپک در سطح مواد غذایی را معیاری برای خاصیت ضدکپکی میکروارگانیسم‌های درون غذا دانسته‌اند (Lynch et al., 2013). از این رو ابداع و مقایسه‌ روش­هایی کارآمد جهت بررسی خاصیت ضدکپکی باکتری­های مولد اسیدلاکتیک در مواد غذایی مفید می‌باشد.

   در این تحقیق از باکتری­های مولد اسیدلاکتیک تولیدکننده مواد ضدقارچی در تولید پنیر سفید استفاده شد و با استفاده از روش­های مختلف اثرات ضدکپکی آن­ها در پنیر­های تولیدی مورد بررسی قرار گرفت تا با مقایسه نتایج به دست آمده بتوان ویژگی این آزمون‌ها را مشخص کرد و با مقایسه آن‌ها، کارآمدی و موارد استفاده‌ هر کدام را بررسی نمود.

 

مواد و روش­ها

روش تهیه تولید پنیر

   جهت تهیه مخلوط اولیه برای تولید پنیر از 2/11 درصد شیرخشک، 10 درصد کنسانتره پروتئین شیر، 5/3 درصد کنسانتره­ پروتئین آب پنیر، 14 درصد پودر خامه 59 درصد چربی (شرکت پگاه فارس) و 2 درصد نمک استفاده شد. سپس آب با دمای 35 درجه سلسیوس به مخلوط پودر­های مورد نظر افزوده شد و به منظور هیدراته شدن پودر­­ها، به مخلوط یک ساعت زمان داده شد. سپس فرآیند همگن‌سازی در فشار 150 بار و دمای 50 درجه سلسیوس و پاستوریزاسیون در دمای 70 درجه سلسیوس  و زمان 30 دقیقه اعمال شد.  پس از آن مخلوط تا دمای 30 درجه سلسیوس به منظور تلقیح باکتری­های مولد اسیدلاکتیک و یا استارتر سرد گردید.

   از باکتری­های مولد اسیدلاکتیک که در تحقیق دیگری از منابع طبیعی جدا و خالص سازی شده و خواص ضدکپکی آن­ها در سطح محیط کشت اثبات شده بود، در تولید پنیر استفاده شد. این باکتری­ها شامل،L. plantarum PIN ،L. plantarum CAG23 ، L. casei D31، L. pentosus H39 ،L. plantarum NBRC107151، L. plantarum KU13 بودند (جعفرپور، 1390). باکتری­های مولد اسیدلاکتیک با تعداد 8  واحد لگاریتمی ( log cfu/g 8) در هر گرم و استارتر  R-704(Christian-Hansen, Denmark) به میزان 1 گرم در 100 کیلوگرم اضافه شد. پس از تلقیح باکتری­ها و استارتر، نمونه‌ها در دمای 30 درجه سلسیوس تا رسیدن به  pHبرابر با 6/5 زمان نگه‌داری گردید. در ادامه رنین به میزان 2 گرم در 100 کیلوگرم اضافه شد و برای تکمیل انعقاد، پنیر­ها به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سلسیوس قرار گرفتند. در نهایت در دمای 30 درجه سلسیوس و تا رسیدن به pH حدود 8/4 تا 5 گرمخانه­گذاری گردید.

تهیه­ سوسپانسیون اسپور کپک

   در این تحقیق اثر باکتری­های مولد اسیدلاکتیک بر روی دو کپک A. flavus PTCC 5004 (PTCC 5004) و  A. parasiticus PTCC 5286(PTCC 5286)(مرکز کلکسیون قارچ‌ها و باکتری‌های صنعتی ایران) بررسی شد. جهت آماده­سازی و تهیه­ سوسپانسیون حاوی تعداد مشخص کپک، ابتدا کپک­های مورد نظر روی محیط کشت extract Agar (MEA) Malt در لوله آزمایش و به صورت مورب کشت داده شد. لوله­های محتوی کپک در دمای 30 درجه سلسیوس و به مدت 4 تا 7 روز گرمخانه­گذاری شدند. پس از این مدت در هر لوله سوسپانسیونی از اسپور­های کپک با آب مقطر استریل تهیه شد. سوسپانسیون تولیدی به لوله­ استریل دیگری منتقل شد و به منظور جدا شدن اسپور­های تولیدی از هم، به مدت 5 دقیقه مخلوط گردید. سپس با استفاده از لام هموسایتومتر زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی 40 شمارش اسپور انجام شد. در نهایت میزان آب لازم جهت رقیق‌سازی سوسپانسیون اولیه و رسیدن به سوسپانسیونی با تعداد اسپور مورد نظر محاسبه شد.

طرح مطالعه

   جهت انجام آزمون Microdilution و آزمون تعیین خواص ضد قارچی قطعات پنیر به روش Overlay، 6 نمونه پنیر که هر کدام حاوی یکی از باکتری­های مولد اسیدلاکتیک مورد مطالعه بودند، در ظروف 400 گرمی تولید شد. همچنین یک نمونه پنیر نیز با استارتر R-704 جهت مقایسه با باکتری­های مورد مطالعه تولید شد. جهت بررسی میزان رشد مستقیم کپک­ها بر سطح پنیر، 6 نمونه پنیر که هر کدام حاوی یکی از باکتری­های مولد اسیدلاکتیک مورد مطالعه بودند، درون پلیت­های استریل تهیه و همچنین یک نمونه نیز با استارتر R-704 جهت مقایسه با باکتری­های مورد مطالعه تولید گردید.

آزمون Microdilution عصاره­ پنیر

   در این آزمون فعالیت ضد کپکی عصاره­ پنیر­های تولید شده مورد بررسی قرار گرفت. برای این کار از پنیر­ها، عصاره بدون سلول تهیه شد. برای تهیه­ عصاره­ بدون سلول پنیر­ها، 10 گرم از پنیر­های تولیدی با 10 میلی‌لیتر آب مقطر استریل هموژن شد و پس از سانتریفوژ­ کردن، مایع رویی از فیلتر غشایی 22/0 میکرون عبور داده شد. آزمون بر روی این مایع و در پلیت­های 96 خانه­ای انجام شد. برای این کار 150 میکرولیتر از محیط کشت Sabouraud Dextrose Broth  به هر چاهک افزوده شد و 150 میکرولیتر عصاره­ بدون سلول به چاهک اول افزوده شد و رقیق‌سازی سریالی در چاهک‌های بعدی انجام گرفت. در نهایت 10 میکرولیتر از محلول اسپور کپک‌های مورد آزمایش با تعداد 5 واحد لگاریتمی اسپوردر هر میلی‌لیتر به تمام چاهک­ها اضافه گردید. پس از انجام این مراحل، پلیت به دستگاه میکروپلیت ریدر (مدلMicro 200R  ساخت آمریکا) انتقال داده شد و در دمای 30 درجه سلسیوس به مدت 48 ساعت گرمخانه‌گذاری انجام شد و هر نیم ساعت یک بار OD چاهک­ها در طول موج 550 نانومتر توسط دستگاه قراعت گردید. نتایج این آزمون به صورت نمودار OD در مقابل زمان به دست آمد.

   جهت تفسیر نتایج از مساحت سطح زیر منحنی Area under the curve (AUC) استفاده شد. برخی محققین از مساحت سطح زیر نمودار جهت نشان دادن میزان رشد میکروارگانیسم استفاده کردند و آن را بهترین پارامتر برای این کار معرفی نمودند et al., 2009; Tiina and Sandholm, 1989) Gutierrez). برای محاسبه­ سطح زیر منحنی از روش ذوزنقه­ای مطابق فرمول زیر استفاده شد (Pruessner et al., 2003).

 

 

                                        

   در این معادله  iدفعات قرائت  ODتوسط دستگاه،n  تعداد کل دفعات قرائت دستگاه که در این آزمایش 97 می‌باشد،  m مقادیر  ODقرائت شده توسط دستگاه و t فواصل زمانی بین قرائت‌های دستگاه است که در این جا 5/0 می‌باشد.

آزمون تعیین خواص ضدقارچی قطعات پنیر به روش Overlay

   در این آزمون از پنیر­های تولیدی قطعات استوانه­ای شکل با ارتفاع 2 تا 3 میلی‌متر تهیه و در وسط پلیت قرار داده شد. پس از آن محیط مذاب MEA تا سطح پنیرها اضافه شد. پس از آن به محیط کشت فرصت داده شد تا منعقد گردد. سپس 10 میلی‌لیتر از محیط MEA حاوی 7/0 درصد آگار به همراه 1 میلی­لیتر محلول اسپور کپک مورد نظر با تعداد 4 لوگ اسپور در میلی‌لیتر به سطح هر پلیت اضافه شد. پلیت­های آماده شده به مدت 48 ساعت و در دمای 30 درجه سلسیوس گرمخانه­گذاری شدند. پس از اتمام زمان گرمخانه‌گذاری از نمونه­ها در شرایط یکسان به لحاظ نور و فاصله نمونه تا دوربین، عکس تهیه شد. پس از تهیه­ عکس از نمونه‌ها، توسط نرم افزار  Image J (Rawak software) مساحت هاله­ بازدارندگی رشد، مساحت قطعه پنیر مورد آزمایش و مساحت کل پلیت محاسبه شد. به دلیل تفاوت­های جزئی که در مساحت قطعات پنیر مورد آزمایش وجود داشت مساحت هاله­ خالص بازدارندگی محاسبه شد که از تفاضل مساحت هاله بازدارندگی و مساحت قطعه پنیر مورد آزمایش محاسبه می‌شود. برای محاسبه­ درصد بازدارندگی رشد از معادله استفاده شد:

 

 

 

درصد بازدارندگی از رشد = × 100

 

آزمون بررسی میزان رشد مستقیم کپک­ها بر سطح پنیر

   در این آزمون پس از تولید پنیر، به سطح تمام نمونه­ها 100 میکرولیتر محلول حاوی اسپور کپک­های A.  flavus  و  A. parasiticus با تعداد 4 لوگ اسپور در میلی­لیتر اضافه شد. سپس پنیر­های تولید شده در دما­های 4، 15 و 30 درجه سلسیوس نگه­داری شده و زمان ظاهر ­شدن کپک روی نمونه­ها مورد بررسی قرار گرفت.

آنالیز آماری

   برای انجام آنالیز داده­ها و بررسی اطلاعات به دست آمده از آزمون­های مختلف از طرح بلوک‌های کامل تصادفی استفاده شد. به منظور تعیین اختلاف بین میانگین اعداد (حداقل سه تکرار برای هر آزمایش)، پس از آنالیز واریانس از آزمون چند دامنه­ای دانکن در سطح (05/0P<) استفاده گردید. در تمام مراحل، تجزیه و تحلیل آماری داده­ها با استفاده از نرم افزار SAS 9.1 صورت گرفت. تعیین ضرایب همبستگی با روش پیرسون و با استفاده از نرم افزار Minitab انجام گرفت.

 

یافته­ها

آزمون Microdilution عصاره­ پنیر

   نتایج مساحت سطح زیر منحنی در این آزمون در مورد کپک A. flavus در جدول (1) آورده شده است. همان­گونه که مشاهده می­شود به جز زمان صفر، در هر کدام از زمان‌های آزمایش عصاره­ پنیر­های تولید شده با باکتری­هایL. pentosus H39 وL. casei D31 دارای کمترین میزان مساحت سطح زیر منحنی هستند که نشان دهنده­ این است که در بین عصاره­ پنیر­های مورد آزمایش، بیشترین اثر ضدقارچی را داشته­اند. همچنین عصاره­ پنیر تولیدی با باکتریL. plantarum KU13  دارای بیشترین مساحت سطح زیر منحنی است و بنابراین دارای کمترین اثر ضدقارچی در بین باکتری­های مورد آزمایش می­باشد.

   در مورد اثر زمان بر نتایج این آزمون، غیر از زمان صفر، نتایج بقیه­ زمان­ها تفاوت معنی‌داری با هم ندارند و هر کدام ازعصاره­­های پنیر نتایج نسبتاً یکسانی را در زمان­های مختلف از خود نشان داده­اند. در زمان صفر هیچ­ کدام از نمونه­ها با هم تفاوت آماری نداشته و هر نمونه در زمان صفر نسبت به سایر زمان­ها، سطح زیر منحنی بیشتری دارد. البته این مورد در عصاره­ پنیر تولیدی با استارتر پنیر مشاهده نمی­شود و در تمام زمان‌های آزمایش میزان سطح زیر منحنی این نمونه بالا است.

   نتایج سطح زیر منحنی در مورد کپک  A. parasiticus در جدول (2) آمده است.همان­گونه که مشاهده می‌شود  به جز زمان صفر، عصاره­ پنیر­های تولید شده با باکتری­های  NBRC107151 L. plantarum و L. casei D31 دارای کمترین میزان مساحت سطح زیر منحنی هستند که نشان­دهنده­ این است که در بین عصاره­ پنیر­های مورد آزمایش، بیشترین اثر ضدقارچی را داشته­اند. همچنین عصاره پنیر تولیدی با باکتریL. plantarum KU13  دارای بیشترین مساحت سطح زیر منحنی است و بنابراین دارای کمترین اثر ضدقارچی در بین باکتری­های مورد آزمایش می­باشد.

   در این آزمون نیز مانند آزمون مشابه بر روی کپک A. flavusدر مورد اثر زمان بر نتایج این آزمون، غیر از زمان صفر، نتایج زمان‌های مختلف آزمایش تفاوت معنی‌داری با هم ندارند و عصاره­ پنیر­های مورد آزمایش نتایج نسبتاً یکسانی در زمان­های مختلف از خود نشان دادند. این آزمون در مورد ارزیابی اثر ضدمیکروبی مواد مختلف مانند اسانس­های گیاهی کاربرد داشته است و در این تحقیق برای اولین بار در مورد نشان­دادن اثر ضدقارچی باکتری­های مولد اسیدلاکتیک در محیط پنیر استفاده شد.

 

 

 

جدول 1-  مساحت سطح زیر نمودار حاصل از آزمون Microdilution روی کپک Aspergillus flavus

هفته	باکتری
	L.pentosus  H39	L.plantarum KU13	L.plantarum NBRC107151	L.casei D31	L.plantarum CAG23	L.plantarum  PIN	استارتر
0	Aa54/2 ± 80/22	Aa63/0 ± 32/21	Aa28/0 ± 58/19	Aa93/1 ± 21/21	Aa95/1 ± 23/23	Aa53/2 ± 78/20	Ab19/1 ± 28/23
2	Bbc16/1 ± 88/7	Ba00/2 ± 22/14	Bbc72/1 ± 80/9	Bc38/0 ± 82/5	Bab97/1 ± 32/11	Bbc42/1 ± 91/9	Da09/1 ± 15/15
4	Bde53/0 ± 63/8	Bb65/1 ± 27/15	Bcd27/1 ± 66/10	Be77/0 ± 65/5	Bbc13/1 ± 41/13	Bcd38/1 ± 45/10	Aa12/2 ± 52/25
6	Bd45/0 ± 90/6	Bab24/1 ± 05/16	Bcd91/0 ± 49/9	Bcd62/0 ± 34/7	Bdb61/1 ± 87/12	Bbc77/1 ± 72/12	Ca84/1 ± 522/19
8	Bd28/0 ± 01/9	Bb64/0 ± 66/17	Bd14/1 ± 13/9	Bd45/0 ± 18/6	Bc73/1 ± 44/13	Bd55/0 ± 79/8	BCa81/1 ± 07/21

 -  حروف بزرگ متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ستون و حروف کوچک متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ردیف است )05/0(p<.

 

 

 

 

 

 

 

 جدول 2 -  مساحت سطح زیر نمودار حاصل از آزمون Microdilution روی کپک Aspergillus parasiticus

هفته	باکتری
	L.pentosus  H39	L.plantarum KU13	L.plantarum NBRC107151	L.casei D31	L.plantarum CAG23	L.plantarum  PIN	استارتر
0	Aab27/2 ± 52/22	Ac96/2 ± 24/15	Abc88/3 ± 82/19	Ac73/2 ± 65/15	Aa08/0 ± 20/27	Aab10/3 ± 54/22	Aabc48/2 ± 63/20
2	Bbc63/1 ± 86/10	Aa12/1 ± 74/15	Bc41/1 ± 36/10	Bc52/1 ± 44/8	Bab90/0 ± 21/14	Bbc64/1 ± 93/11	Aa40/1 ± 34/17
4	Bc53/0 ± 11/9	Aa37/1 ± 90/15	BCcd92/2 ± 90/7	BCd25/2 ± 00/4	Bab70/1 ± 60/14	Bbc08/2 ± 89/10	Aa44/2 ± 16/17
6	Bcd06/1 ± 06/11	Ab05/2 ± 67/15	Bc26/0 ± 06/12	Bd20/2 ± 58/7	Ccd30/1 ± 58/8	Bcd22/1 ± 98/9	Aa27/1 ± 21/20
8	Bb77/1 ± 39/8	Ab00/0 ± 37/12	Cc18/0 ± 40/3	Cc32/0 ± 47/1	BCb50/2 ± 85/11	Bb82/1 ± 59/10	Aa32/2 ± 74/16

 -  حروف بزرگ متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ستون و حروف کوچک متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ردیف است )05/0(P<.

 

تعیین خواص ضدقارچی قطعات پنیر به روش Overlay

   نتایج درصد بازدارندگی بر علیه رشد کپک­های مورد آزمایش در جداول 3 و 4 آمده است. همان­گونه که مشاهده می­شود، غیر از پنیر تولیدی با باکتریL. casei D31 ، بین تمامی نمونه­های تولیدی پنیر با باکتری­های مولد اسید لاکتیک و نمونه­ی تولیدی با استارتر پنیر به لحاظ آماری تفاوت معنی­داری وجود داشت. در بین پنیر­های تولیدی با باکتری­های مولد اسید لاکتیک، پنیرهای تولید شده با دو باکتری L. plantarum PIN  و L. plantarum CAG23 بیشترین درصد بازدارندگی را بر علیه رشد هر دو کپک داشتند و پنیر تولید شده با باکتری L. casei D31  کمترین درصد بازدارندگی را نشان داد، به طوری که درصد بازدارندگی آن با پنیر تولیدی از استارتر پنیر تفاوت معنی‌داری را نشان نداد.

 

 

جدول 3- درصد بازدارندگی قطعات پنیر تولیدی بر علیه رشد کپک Aspergillus flavus

هفته	باکتری
	L.pentosus  H39	L.plantarum KU13	L.plantarum NBRC107151	L.casei D31	L.plantarum CAG23	L.plantarum  PIN	استارتر
0	Ac02/0± 67/7	Abc59/1 ± 68/8	Ab40/1 ± 61/10	Bd14/0 ± 40/2	Aa92/0 ± 05/13	ABa46/0 ± 86/14	Ad92/0 ± 08/2
2	Ac55/0 ± 68/6	Ab49/1 ± 05/10	Ab55/1 ± 76/9	Acd14/0 ± 87/3	Aab48/1 ± 07/12	ABa81/1 ± 55/13	Ad58/0 ± 72/1
4	Ab73/1 ± 83/7	Ab05/1 ± 16/11	Ab73/1 ± 72/9	BCc68/0 ± 88/1	Ab83/1 ± 63/11	Aa12/1 ± 40/15	Ac52/0 ± 64/2
6	Aa39/1 ± 74/8	Aa20/0 ± 40/9	Aa90/1 ± 17/9	Cb07/0 ± 11/1	Aa52/1 ± 75/10	ABa76/1 ± 14/12	Bb48/0 ± 64/1-
8	Aa75/1 ± 41/8	Aa61/0 ± 79/8	Aa16/0 ± 47/9	Db09/0 ± 24/1-	Aa02/1 ± 95/10	Ba33/1 ± 94/10	Cb02/0 ± 74/3-

-  حروف بزرگ متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ستون و حروف کوچک متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ردیف است )05/0(P<

 

جدول 4- درصد بازدارندگی قطعات پنیر تولیدی بر علیه رشد کپک  Aspergillus parasiticus

هفته	باکتری
	L.pentosus  H39	L.plantarum KU13	L.plantarum NBRC107151	L.casei D31	L.plantarum CAG23	L.plantarum  PIN	استارتر
0	Aa53/1± 40/10	Aa24/1 ± 57/7	Aa45/0 ± 80/8	Ab32/0 ± 05/0-	Aa00/1 ± 96/10	Aa94/1 ± 20/11	Ab43/0 ± 66/1-
2	Aab79/0 ± 72/7	Aab85/1 ± 23/8	Ab43/0 ± 85/5	Ac51/0 ± 84/1	Aa96/1 ± 98/9	Aa37/1 ± 38/10	Bd45/0 ± 26/4-
4	Aab27/1 ± 92/8	Ab61/1 ± 91/6	Aab69/0 ± 82/7	Ac05/0 ± 46/0	Aab75/0 ± 50/8	Aa28/1 ± 45/10	Ad90/0 ± 26/2-
6	Abc80/0 ± 26/7	Abc23/0 ± 76/6	Ac52/0 ± 63/5	Ad18/0 ± 78/0	Ab30/0 ± 96/7	Aa32/1 ± 81/9	Be21/0 ± 04/4-
8	Aa17/1 ± 26/7	Aa79/0 ± 06/7	Aa47/0 ± 15/6	Ab59/0 ± 09/2	Aa84/0 ± 68/8	Aa28/0 ± 97/8	Bc14/0 ± 89/3-

-  حروف بزرگ متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ستون و حروف کوچک متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ردیف است )05/0(P<

رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر

   نتایج این آزمون به صورت تعداد روز لازم جهت رشد کپک در جداول 5 و 6 آمده است. همان­گونه که مشاهده می‌شود در تمام دماهای آزمایش و در مورد هر دو کپک، همه نمونه­ها به جز نمونه­ پنیر تولیدی با باکتری L. plantarum KU13  توانستند نسبت به نمونه­ تولیدی با استارتر پنیر، ایجاد کپک را در سطح پنیر به تعویق بیاندازند. باکتری‌های L. plantarum PINو L. plantarum CAG23 بیشترین بازدارندگی را بر علیه رشد کپک‌ها بر سطح پنیر داشتند.

 

 

 

جدول 5-  تعداد روز لازم جهت رشد کپک  Aspergillus flavusدر سطح پنیر

هفته	باکتری
	L.pentosus  H39	L.plantarum KU13	L.plantarum NBRC107151	L.casei D31	L.plantarum CAG23	L.plantarum  PIN	استارتر
4	c51/2 ± 33/61	e00/1 ± 00/46	c08/2 ± 66/62	d05/3 ± 33/53	b00/2 ± 00/67	a00/2 ± 00/73	e08/2 ± 33/51
15	b57/0 ± 33/30	d00/1 ± 00/21	b57/0 ± 33/32	c00/1 ± 00/26	a52/1 ± 66/32	a15/1 ± 66/33	d00/1 ± 00/25
30	a52/1 ± 33/10	c00/0 ± 00/4	a57/0 ± 66/10	b57/0 ± 33/8	a57/0 ± 33/11	a15/1 ± 66/11	c57/0 ± 33/5

-  حروف کوچک متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ردیف است )05/0(P<.

 

جدول 6 - تعداد روز لازم جهت  رشد کپک  Aspergillus parasiticusدر سطح پنیر

هفته	باکتری
	L.pentosus  H39	L.plantarum KU13	L.plantarum NBRC107151	L.casei D31	L.plantarum CAG23	L.plantarum  PIN	استارتر
4	c00/2 ± 00/55	e52/1 ± 33/44	c00/2 ± 00/58	d06/2 ± 33/53	b08/2 ± 66/61	a08/2 ± 66/65	a00/2 ± 00/47
15	b57/0 ± 33/24	e00/0 ± 00/19	b57/0 ± 66/24	c57/0 ± 33/21	a57/0 ± 66/25	a57/0 ± 33/26	d57/0 ± 33/20
30	b00/0 ± 00/15	d57/0 ± 66/5	b52/1 ± 66/15	c57/0 ± 66/9	a57/0 ± 33/17	a52/1 ± 66/17	d57/0 ± 66/6

-  حروف کوچک متفاوت نشان­دهنده اختلاف معنی­دار در هر ردیف است )05/0(P<.

 

 

نتایج همبستگی داده­های حاصل از آزمون­های مختلف

   همان­گونه که در جداول 7 و 8 ملاحظه می­شود، در مورد هر دو کپک مورد آزمایش، بین نتایج آزمون overlay قطعات پنیر و رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر همبستگی مثبت و معنی‌داری وجود دارد و این دو آزمون با آزمون Microdilution همبستگی معنی‌داری ندارند.

 

 

 

جدول 7- نتایج همبستگی آزمون های انجام شده بر علیه کپک Aspergillus flavus

	Overlay	Microdilution	رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای درجه سلسیوس) 4	رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 15 درجه سلسیوس)	رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای درجه سلسیوس) 30
Overlay	1
Microdilution	ns  115/0-	1
رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 4 درجه سلسیوس)	** 763/0	ns  131/0	1
رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 15 درجه سلسیوس)	** 662/0	ns  066/0	** 914/0	1
رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 30 درجه سلسیوس)	** 598/0	ns  129/0	** 900/0	** 993/0	1

** معنی‌داری ضرایب همبستگی در سطح 05/0

ns عدم معنی‌داری در سطح 05/0

 

جدول 8- نتایج همبستگی آزمون های انجام شده بر علیه کپک Aspergillus parasiticus

	Overlay	Microdilution	رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 4 درجه سلسیوس)	رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 15 درجه سلسیوس)	رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 30 درجه سلسیوس)
Overlay	1
Microdilution	ns  11/0-	1
رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 4 درجه سلسیوس)	** 629/0	ns  144/0	1
رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 15 درجه سلسیوس)	** 692/0	ns  056/0	** 928/0	1
رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر (دمای 30 درجه سلسیوس)	** 717/0	ns  122/0	** 941/0	** 9776/0	1

** معنی‌داری ضرایب همبستگی در سطح 05/0

ns عدم معنی‌داری در سطح 05/0

 

بحث و نتیجه­گیری

   همان­گونه که از نتایج مشخص است، باکتری­های مورد آزمایش توانستند به صورت معنی‌داری در مقایسه با استارتر صنعتی تولید پنیر، رشد کپک­ها را به تعویق بیاندازد. این مورد نشان از توانایی قابل قبول این باکتری­ها در کنترل رشد کپک است و می‌توان از آن­ها به عنوان نگه­دارنده­های بیولوژیکی در پنیر استفاده کرد که این مورد به لحاظ اقتصادی و بهداشتی حائز اهمیت است.

   در سال 2011، محی‌الدین و همکاران اثر مهار­کنندگی باکتری­های L. fermentum Te007 ، L. pentosus G004 ، L. paracasei D5 و P. pentosaceus Te010 را برعلیه کپک‌های  A. nigerو A. oryzae در پنیر فرآوری شده نشان دادند. پنیر­های بدون باکتری­های مورد آزمایش ماندگاری 4 تا 6 روز را در 30 درجه سلسیوس نشان دادند و نمونه­های تولیدی توسط باکتری­های مورد آزمایش از 6 تا 9 روز رشد کپک را به تأخیر انداختند. در حالی که باکتری­های مورد آزمایش در این تحقیق نتایج بسیار بهتری را نسبت به تحقیق فوق نشان دادند زیرا باکتری‌های موثر در این آزمون توانستند رشد flavus A.  را 10 تا 11 روز و کپک A. parasiticus را 15 تا 17 روز به تأخیر انداختند. لازم به توضیح است که در هر دو تحقیق نمونه­های تولیدی بدون حضور باکتری­های دارای خواص ضدقارچی نتایج مشابهی را از خود نشان دادند.

   آزمون Overlay قطعات پنیر توانست به خوبی تفاوت بین نمونه‌های تولیدی را در مهار رشد کپک نشان دهد. این آزمون در تحقیقی برای نشان دادن اثر کشندگی Enterococcus faecium FAIR-E 198 بر علیه لیستریا در پنیر استفاده شده است (et al., 2002 Sarantinopoulos).

   آزمون Microdilution نیز همانند دو آزمون دیگر تفاوت بین پنیرهای تولیدی از باکتری­های مورد آزمایش و استارتر صنعتی را نشان داد. این مورد نشان می­دهد که از این آزمون می‌توان جهت نشان دادن اثر ضدقارچی باکتری‌های دارای خاصیت ضدقارچی در پنیر استفاده نمود. در این آزمون­ها، نتایج دو آزمون Overlay قطعات پنیر و رشد مستقیم کپک بر سطح پنیر همبستگی مثبت و معنی‌داری با هم دارند. این مورد نشان دهنده­ یکسان بودن عامل محافظت­کنندگی از رشد در این دو آزمون می‌باشد که شامل بر هم کنشی از حضور باکتری و مواد ضدقارچی تولید شده از باکتری است نتایج آزمون Microdilution با دو آزمون دیگر همبستگی معنی‌داری ندارند. چرا که در هر کدام از آزمون­های انجام شده، عاملی که موجب جلوگیری از رشد کپک می­شود متفاوت است. در آزمون Microdilution از عصاره­ بدون سلول پنیر­های تولیدی استفاده شد و بنابراین عامل ضدکپکی در این آزمون تنها مواد ضدقارچی تولیدی در پنیر­ها است و خود سلول باکتری مولد اسیدلاکتیک در این آزمون نقشی ندارد. در دو آزمون دیگر به دلیل استفاده از خود پنیر، هم سلول باکتری و هم مواد ضدقارچی در آزمون نقش دارند. بنابراین می‌توان گفت تفاوت نتایج این آزمون­ها به این دلیل می­باشد. از این مورد می‌توان نتیجه گرفت که با آزمون Microdilution عصاره­های پنیر می‌توان توانایی باکتری­های مورد آزمایش را در تولید مواد ضدقارچی در محیط پنیر بررسی کرد و از دو آزمون دیگر می­توان توانایی کلی این باکتری­ها را در به تعویق انداختن رشد کپک در پنیر مورد بررسی قرار داد.

   به عنوان مثال باکتریL. casei D31  در آزمون­های overlay  قطعات پنیر و میزان کپک زدگی سطح پنیر عملکرد خوبی در مهار رشد کپک نشان نداد و حتی در آزمون overlay قطعات پنیر تفاوت معنی‌داری با پنیر تولیدی با استارتر پنیر نداشد، اما در آزمون Microdilution دارای کمترین مساحت سطح زیر منحنی بوده و بهترین اثر ضدکپکی را نشان داد. که می‌توان نتیجه گرفت این باکتری می‌تواند مواد ضدکپکی قابل توجهی تولید نماید اما خود سلول اثر آنتاگونستی زیادی بر رشد کپک ندارد. البته به دلیل نزدیک بودن شرایط دو آزمون Overlay  قطعات پنیر و میزان کپک‌زدگی سطح پنیر به شرایط کلی حاکم بر رشد کپک بر روی پنیر حین نگه­داری، از نتایج این دو آزمون می­توان جهت ارزیابی توانایی واقعی این باکتری­ها بر علیه رشد کپک در پنیر استفاده نمود و نتایج این دو آزمون بهتر می­تواند توانایی باکتری‌های مورد آزمایش را در پنیر نشان دهد.

   آزمون Microdilution و در کل سنجش میزان OD و ارتباط دادن آن به میزان رشد میکروارگانیسم‌ها، تاکنون در پژوهش‌های مرتبط با باکتری­ها انجام شده است و در مورد کپک­ها به دلیل پیچیدگی­های رشد آن­ها، تولید میسلیوم از اسپور­ها و همچنین امکان تولید میسلیوم بدون ایجاد کدورت، استفاده از این آزمون را با ابهام مواجه می­کند. اگرچه آزمون Microdilution توانست تفاوت بین نمونه‌های تولیدی با باکتری‌های مورد آزمایش و استارتر صنعتی را نشان دهد اما با توجه به موارد ذکر شده این آزمون جهت بررسی خواص ضدکپکی باکتری‌های مولد اسیدلاکتیک صحیح نمی‌باشد.

   در کل با توجه به نتایج به دست آمده می­توان گفت برای بررسی اثرات ضدقارچی باکتری­های مختلف در محیط پنیر می­توان از آزمون­های پیشنهاد شده در این تحقیق استفاده نمود. جهت بررسی اثرات ضدقارچی مناسب­ترین راه رشد مستقیم کپک بر روی محصول غذایی و مقایسه­ نمونه­های تولیدی با باکتری­های مورد آزمایش و نمونه­ کنترل و بدون اثر ضدقارچی می­باشد. در این تحقیق نشان داده شد که آزمون Overlay قطعات پنیر همبستگی معنی‌داری با نتایج رشد مستقیم کپک بر روی پنیر دارد بنابراین می­توان گفت که این آزمون نیز می­تواند به خوبی اثر ضدقارچی باکتری­های مورد آزمایش را در پنیر نشان دهد. نتایج آزمون Microdilution عصاره­های پنیر اگرچه همبستگی معنی‌داری با دو آزمون دیگر نشان ندادند، اما توانست بین نمونه­های تولیدی با باکتری­های مورد آزمایش و استارتر صنعتی تفاوت معنی‌داری نشان دهد. علی‌رغم این موضوع به دلیل اینکه نمی‌توان OD را سنجشی برای رشد کپک دانست، استفاده از این آزمون در این مورد توصیه نمی‌شود.

مراجع

• Ananou, S., Maqueda, M., Martínez-Bueno, M. and Valdivia, E. (2007). Biopreservation, an ecological approach to improve the safety and shelf-life of foods. Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, 1: 475-486.
• Arendt, E.K., Ryan, L.A. and Dal Bello, F. (2007). Impact of sourdough on the texture of bread. Food Microbiology, 24(2): 165-174.
• Bhat, R., Rai, R.V. and Karim, A.A. (2010). Mycotoxins in food and feed: present status and future concerns. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 9(1): 57-81.
• Caplice, E., and Fitzgerald, G.F. (1999). Food fermentations: role of microorganisms in food production and preservation. International Journal of Food Microbiology, 50(1): 131-149.
• Carr, F.J., Chill, D. and Maida, N. (2002). The lactic acid bacteria: a literature survey. Critical Reviews in Microbiology, 28(4): 281-370.
• Davidson, P.M., Taylor, T.M., Doyle, M.P. and Beuchat, L.R. (2007). Chemical preservatives and natural antimicrobial compounds. Food Microbiology: Fundamentals and frontiers, (Edn. 3): 713-745.
• Gorris, L.G. (2005). Food safety objective: an integral part of food chain management. Food Control, 16(9): 801-809.
• Gourama, H. and Bullerman, L.B. (1995). Inhibition of growth and aflatoxin production of Aspergillus flavus by Lactobacillus species. Journal of Food Protection, 58(11): 1249-1256.
• Guldfeldt, L.U., Sorensen, K.I., Stroman, P., Behrndt, H., Williams, D. and Johansen, E. (2001). Effect of starter cultures with a genetically modified peptidolytic or lytic system on Cheddar cheese ripening. International dairy journal, 11(4): 373-382.
• Gourama, H. and Bullerman, L.B. (1997). Anti-aflatoxigenic activity of Lactobacillus casei pseudoplantarum. International Journal of Food Microbiology, 34(2): 131-143.
• Gutierrez, J., Barry-Ryan, C. and Bourke, P. (2009). Antimicrobial activity of plant essential oils using food model media: efficacy, synergistic potential and interactions with food components. Food microbiology, 26(2): 142-150.
• Hammes, W.P., Bantleon, A. and Min, S. (1990). Lactic acid bacteria in meat fermentation. FEMS Microbiology Letters, 87(1): 165-173.
• Jafarpour, D. (2011). Isolation and identification of antifungal lactic acid bacteria from natural sources. M.Sc thesis. Shiraz University.
• Lynch, K.M., Pawlowska, A.M., Brosnan, B., Coffey, A., Zannini, E., Furey, A., et al. (2014). Application of Lactobacillus amylovorus as an antifungal adjunct to extend the shelf-life of Cheddar cheese. International Dairy Journal, 34(1): 167-173.
• Magnusson, J., Strom, K., Roos, S., Sjogren, J. and Schnurer, J. (2003). Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria. FEMS Microbiology Letters, 219(1): 129-135.
• Muhialdin, B.J., Hassan, Z. and Sadon, S.K. (2011). Antifungal activity of Lactobacillus fermentum Te007, Pediococcus pentosaceus Te010, Lactobacillus pentosus G004, and L. paracasei D5 on selected foods. Journal of Food Science, 76: 493–499.
• Nielsen, P.V., Boer, E.D., Samson, R.A., Hoekstra, E.S. and Frisvad, J.C. (2004). Food preservatives against fungi. Introduction to Food-and Airborne Fungi, 7: 357-363.
• Paul Ross, R., Morgan, S. and Hill, C. (2002). Preservation and fermentation: past, present and future. International Journal of Food Microbiology, 79(1): 3-16.
• Sarantinopoulos, P., Leroy, F., Leontopoulou, E., Georgalaki, M.D., Kalantzopoulos, G., Tsakalidou, E., et al. (2002). Bacteriocin production by Enterococcus faecium FAIR-E 198 in view of its application as adjunct starter in Greek Feta cheese making. International Journal of Food Microbiology, 72(1): 125-136.
• Sensidoni, A., Rondinini, G., Peressini, D., Maifreni, M. and Bortolomeazzi, R. (1994). Presence of an off-flavour associated with the use of sorbates in cheese and margarine. Italian Journal of Food Science, 6.
• Settanni, L., Franciosi, E., Cavazza, A., Cocconcelli, P.S. and Poznanski, E. (2011). "Extension of Tosela cheese shelf-life using non-starter lactic acid bacteria". Food Microbiology, 28: 883-890.
• Sjogren, J., Magnusson, J., Broberg, A., Schnurer, J. and Kenne, L. (2003). Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14.Applied and Environmental Microbiology, 69(12): 7554-7557.
• Speranza, B., Sinigaglia, M. and Corbo, M.R. (2009). Non starter lactic acid bacteria biofilms: A means to control the growth of Listeria monocytogenes in soft cheese. Food Control, 20(11): 1063-1067.
• Tiina, M. and Sandholm, M. (1989). Antibacterial effect of the glucose oxidase-glucose system on food-poisoning organisms. International journal of Food Microbiology, 8(2): 165-174.
• Paleologos, E.K., Savvaidis, I.N. and Kontominas, M.G. (2004). Biogenic amines formation and its relation to microbiological and sensory attributes in ice-stored whole, gutted and filleted Mediterranean Sea bass. Food Microbiology, 21(5): 549-557.
• Pruessner, J.C., Kirschbaum, C., Meinlschmid, G. and Hellhammer, D.H. (2003). Two formulas for computation of the area under the curve represent measures of total hormone concentration versus time-dependent change. Psychoneuroendocrinology, 28(7): 916-931.
• Viljoen, B.C. (2001). The interaction between yeasts and bacteria in dairy environments. International Journal of Food Microbiology, 69(1): 37-44.