بررسی اثر القاء الیسیتورها بر خواص آنتی‌اکسیدانی و ترکیبات ثانویه میسلیوم قارچ‌های Stereum hirsutum, Hyphodontia paradoxa و Arthrinium arundinis در استان گلستان

اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی

دوره 8، شماره 2 - شماره پیاپی 30، شهریور 1399، صفحه 76-88   

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

گلایم لازمی¹؛ وحیده پیام نور^{* 2}؛ جمیله نظری¹؛ عمران عالیشاه³

¹دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

²هیات علمی داشنگاه منابع طبیعی گرگان

³سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات پنبه کشور، گرگان

چکیده

این تحقیق با هدف بررسی اثر القاء الیسیتورها بر خواص آنتی‌اکسیدانی و ترکیبات ثانویه میسلیوم قارچ‌های Arthrinium arundinis ، همزیست گلسنگ، Hyphodontia paradoxaو Stereum hirsutum به میزبانی گیاه Betula pendulaانجام شد. در تابستان 1395 نمونه‌برداری اولیه از پوست تنه درختان از منطقه سیاه مرزکوه  استان گلستان از ارتفاع 2400متری از سطح دریا انجام و خالص‌سازی قارچ انجام شد. در 1397 از ذخایر میسیلیومی دوساله برای تحقیق حاضر با هدف بررسی تغییرات ترکیبات ثانویه استفاده گردید. تیمارهای نیترات سدیم، نانوفیبرسلولز و سولفات منیزیم به­عنوان الیسیتور به کار برده شدند. همچنین ارزیابی اولیه میزان تری ترپنوئید با استفاده از دستگاه HPLC با کمک استاندارد بتولین و بتولینیک اسید، انجام و جهت اطمینان از تری ترپنوئید بودن پیک مربوطه از دستگاه LC-MS استفاده شد. بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی میسیلیوم قارچ‌های فوق با روش DPPH صورت گرفت. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که پیک مربوط به تری ترپنوئیدها که مشتقات بتولین هستند در قارچ
H. paradoxa در الیسیتور نانو فیبرسلولز و قارچ S. hirsutumدر الیسیتور نیترات سدیم (به ترتیب 5/6 و 37/6 برابر شاهد) بیشترین مقدار بوده است. در قارچ A. arundinis تزریق الیسیتورها تاثیری بر میزان تری ترپنوئیدها نداشت و به طور قابل ملاحظه‌ای باعث کاهش آن شد. میزان آنتی‌اکسیدان H. paradoxaدر تیمار شاهد 1/83 درصد بود و القاء الیسیتورها نتیجه عکس داشته و میزان خواص را کاهش داد. مقدار آنتی‌اکسیدان قارچ A. arundinisباالیسیتورمنیزیم سولفات از 05/82 به 12/87 درصد و در A. arundinis با افزودن نیترات سدیم به محیط از 62/24 به 04/86 درصد رسید.

کلیدواژه‌ها

آنتی‌اکسیدان؛ الیسیتور؛ تری‌ترپنوئید؛ توس؛ میسلیوم؛ متابولیت ثانویه

اصل مقاله

 

 

فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، شماره پیاپی 30، سال هشتم، شماره 2، تابستان 1399

 

بررسی اثر القاء الیسیتورها بر خواص آنتی‌اکسیدانی و ترکیبات ثانویه میسلیوم قارچ‌های
 Stereum hirsutum,  Hyphodontia paradoxaو Arthrinium arundinisدر استان گلستان

 

وحیده پیام نور^1*، گل‌آیم لازمی ²، جمیله نظری³، عمران عالیشاه⁴

¹دانشیار، دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی ومنابع طبیعی گرگان گرگان، ایران

²کارشناسی ارشد، دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

³دکتری، دانشکده علوم جنگل، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران

⁴دانشیار، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، موسسه تحقیقات پنبه کشور، گرگان، ایران

تاریخ دریافت: 6/9/98            تاریخ پذیرش: 25/5/99

چکیده

            این تحقیق با هدف بررسی اثر القاء الیسیتورها بر خواص آنتی‌اکسیدانی و ترکیبات ثانویه میسلیوم قارچ‌های Arthrinium arundinis ، همزیست گلسنگ، Hyphodontia paradoxaو Stereum hirsutum به میزبانی گیاه Betula pendulaانجام شد. در تابستان 1395 نمونه‌برداری اولیه از پوست تنه درختان از منطقه سیاه مرزکوه  استان گلستان از ارتفاع 2400متری از سطح دریا انجام و خالص‌سازی قارچ انجام شد. در 1397 از ذخایر میسیلیومی دوساله برای تحقیق حاضر با هدف بررسی تغییرات ترکیبات ثانویه استفاده گردید. تیمارهای نیترات سدیم، نانوفیبرسلولز و سولفات منیزیم به­عنوان الیسیتور به کار برده شدند. همچنین ارزیابی اولیه میزان تری ترپنوئید با استفاده از دستگاه HPLC با کمک استاندارد بتولین و بتولینیک اسید، انجام و جهت اطمینان از تری ترپنوئید بودن پیک مربوطه از دستگاه LC-MS استفاده شد. بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی میسیلیوم قارچ‌های فوق با روش DPPH صورت گرفت. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که پیک مربوط به تری ترپنوئیدها که مشتقات بتولین هستند در قارچ
H. paradoxa در الیسیتور نانو فیبرسلولز و قارچ S. hirsutumدر الیسیتور نیترات سدیم (به ترتیب 5/6 و 37/6 برابر شاهد) بیشترین مقدار بوده است. در قارچ A. arundinis تزریق الیسیتورها تاثیری بر میزان تری ترپنوئیدها نداشت و به طور قابل ملاحظه‌ای باعث کاهش آن شد. میزان آنتی‌اکسیدان H. paradoxaدر تیمار شاهد 1/83 درصد بود و القاء الیسیتورها نتیجه عکس داشته و میزان خواص را کاهش داد. مقدار آنتی‌اکسیدان قارچ A. arundinisباالیسیتورمنیزیم سولفات از 05/82 به 12/87 درصد و در A. arundinis با افزودن نیترات سدیم به محیط از 62/24 به 04/86 درصد رسید.

 

 واژه‌های کلیدی: آنتی‌اکسیدان، الیسیتور، تری‌ترپنوئید، توس، میسلیوم، متابولیت ثانویه[1]

 

 

مقدمه

قارچ‌ها دامنه وسیعی از متابولیت‌های ثانویه تولید می‌نماینـد (Macheleidt et al., 2016). ایـن ترکیبات به­طور مسـتقیم بـرای رشـد مـورد نیـاز نمـیباشـند، امـا در فعالیت‌های مختلف زیستی (Yang et al., 2018) نقش مهمی دارند. متابولیت‌های ثانوی منحصر به گونه یا حتی نژاد و اغلب در طی یک دوره رشد و نموی خاص در گیاه تولید می‌شوند و دارای عملکردهای اکولوژیکی مهم در گیاهان مانند بقا ، سازگاری و رقابت (Halder et al., 2019) هستند. این دسته از ترکیبات، در حفاظت گیاهان مقابل گیاهخواران و عوامل بیماری‌زای میکروبی، به عنوان جذب گرده افشان‌ها و جانوران منتشرکننده بذر (Wink, 2018)، رقابت گیاه با گیاه و همزیستی گیاه با میکروب نقش دارند (Wink, 2018). بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه پیچیده‌تر از متابولیت‌های اولیه می‌باشد و به آسانی از عوامل محیطی مختلفی تاثیر می‌پذیرد از جمله نور، دما، آب موجود در خاک و حاصلخیزی آن، شوری و بطور کلی برای بسیاری از گیاهان تغییر در یک عامل خاص حتی اگر سایر عوامل ثابت باشند (Yang et al., 2018). یکی از راه‌های افزایش کمی متابولیت‌های ثانویه استفاده از الیسیتورهاست. الیسیتورها (محرک‌ها)، مولکول‌هایی با وزن مولکولی پایین می­باشند که باعث تحریک پاسخ دفاعی در گیاهان شده (Abdul Malik et al., 2020) و با توجه به منشأ تولیدشان، در دو گروه زنده و غیرزنده طبقه‌بندی می‌گردند. الیسیتورهای غیرزنده عوامل فیزیکی، شیمیایی و هورمونی و الیسیتورهای زنده مواد با منشاء بیولوژیکی را در بر میگیرند (Naike & Al-khayri, 2016). محرک‌ها ممکن است ژن‌های جدیدی را فعال کنند که آنزیم‌ها و در نهایت مسیرهای بیوسنتزی مختلفی را راه‌اندازی کرده و باعث تشکیل متابولیت‌های ثانویه شوند. ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی و فیتوشیمیایی ترامتس جیبوزا (Trametes gibbosa) مطالعه شده است (Tabari et al., 2013). نتایج نشان داد که در غلظت‌های بالاتر، فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالاتر عصاره و در غلظت‌های پایین‌تر، فعالیت آنتی‌اکسیدانی کمتر عصاره حاصل شد. بای و همکاران (Bai et al., 2012) ماده موثره بتولین را در شرایط سوسپانسیون به وسیله کشت میسلیوم‌های قارچ Inonotus obliquusتولید و بهینه‌سازی کرده و فعالیت‌های آنتی‌اکسیدان این قارچ را نیز تعیین نموده‌اند. ژائی و همکاران (Zhai et al., 2011) با استفاده از 40 میکروگرم در لیتر از محرک قارچی در کشت سوسپانسیون سلولی B. platyphylla میزان تری‌ترپنوئید را (5/29 میلی‌گرم بر گرم وزن خشک) نسبت به شاهد 78 درصد افزایش داده‌اند. نجفی و همکاران (Najafi et al., 2013) اظهار داشتند نانو ذرات نقره باعث افزایش محتوای ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی گیاه بومادران (Achillea millefolium L..) شد و ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی گیاه را تحت تاثیر قرار داد. راعی و همکاران (Raei et al., 2014) در کشت سوسپانسیون سلولی گیاه Aloe veraاز نانو نقره و نانو Tio2 برای افزایش متابولیت ثانویه آلوئین استفاده نمودند و میزان این ماده موثره پس از گذشت 48 ساعت افزایش یافت. اثر الیسیتورهای زیستی (Botrytis cinerea) و غیر زیستی (متیل جاسمونات) و فنیدون (بازدارندة اختصاصی آنزیم لیپواکسیژناز) در میزان تأثیر آنزیم لیپواکسیژناز بر تولید سنگوئینارین، در محیط کشت، بررسی و میزان افزایش مقدار آن در محیط کشت تحریک شده توسط متیل جاسمونات پس از گذشت 10 ساعت، 8/9 برابر و پس از تحریک توسط B. cinerea   2/9 برابر، گزارش شده است
(et al., 2010 Holková). نظری و همکاران
(Nazari et al., 2017) به ارزیابی میزان جذب برخی متابولیت‌های ثانوی (بتولین، اسید بتولینیک، فنل، فلاونوئید) و فعالیت آنتی‌اکسیدان قارچ‌های چوب زی گیاه دارویی Betula pendula (L.) Roth. در استان گلستان پرداختند. نتایج منجر به شناسایی دو گونه قارچ ماکروسکوپی (Stereum hirsutum و Hyphodontia paradoxa) گردید که توانایی جذب بتولین و بتولینیک اسید را از میزبان خود داشتند. میزان فنل کل و تری ترپنوئید بتولین و بتولینیک اسید در بافت قارچ S. hirsutum نسبت به قارچ دیگر برتری داشت. این محققین در مطالعه دیگری گلسنگ (Ramalina sinensis) و قارچ همراه آن (Arthrinium arundinis) را برای نخستین بار به عنوان منابع جدید حاوی دو ماده مؤثره بتولین و اسید بتولینیک معرفی نمودند (Nazari et al., 2018). تحقیق حاضر به نوعی ادامه آن تحقیق می­باشد. بتولین و مشتقات آن  خاصیت ضد توموری، ضد ویروسی، ضد قارچی و ضد باکتریایی فوق العاده ای دارند (Hordyjewska et al., 2019). تعداد زیادی مقاله علمی در این خصوص وجود دارد. احتمال تبدیل یا تجزیه شدن بتولین به مشتقات آن شامل اسید یتولینیک، اسید اورسولیک، اسید اولئانولیک، اریتریدیول و دیگر تری­ترپنوئیدها وجود دارد (Kosyakov et al., 2014 et al., 2015; Orsini). از آنجا که بسیاری از مشتقات مصنوعی این ترپن‌ها نتایج امیدوارکننده‌ای را به‌عنوان عوامل شیمی درمانی برای انواع مختلف سرطان نشان داده‌اند، توجه جهانی را به خود جلب کرده‌اند (Sousa et al., 2019)، ضمن اینکه این مشتقات مشکل غیر حلال بودن بتولین و بتولینیک اسید را تا حد یادی حل کرده‌اند (Csuk, 2014). در پژوهش حاضر به تعیین میزان آنتی‌اکسیدان و بررسی اثر القاء الیسیتورها بر میزان متابولیتهای میسلیوم سه قارچ S. hirsutum،
H. paradoxa و A. arundinis. پرداخته می­شود. لازم به ذکر است این تحقیق با فرض اثرگذاری زمان بر تبدیل بتولین و بتولینیک اسید به سایر مشتقات انجام و از میسلیوم‌های دو ساله استفاده گردیده است. در مقاله از مشتقات بتولین با عنوان تری‌ترپنوئیدها یاد می­شود.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری: قارچ‌های بازیدیومیست چوب‌زی و گلسنگ‌های پوست‌زی با جنگل‌گردشی از محدوده ارتفاعی 2400 متری از سطح دریا در منطقه سیاه مرزکوه شهرستان فاضل‌آباد استان گلستان به میزبانی گیاه B.pendulaدر تابستان 1395 جمع‌آوری و توسط نظری و همکاران خالص‌سازی و شناسایی گردید (Nazari et al., 2017; Nazari et al., 2018). قارچ همزیست گلسنگ، Arthrinium arundinisو قارچ‌های چوب­زی Stereum hirsutum و Hyphodontia paradoxa تشخیص داده شد. وجود بتولین و بتولینیک اسید برای قارچهای ذکر شده محرز شده بود. جهت انجام کار از ذخایر میسیلیومی دو ساله همین نمونه ها (موجود در آزمایشگاه) در سال 1397 استفاده شد.

آماده‌سازی نمونه‌ها و محیط کشت: با استفاده از روش نوک هیف از قارچ‌های رشد کرده بر روی محیط PDA (سیب‌زمینی 300 گرم +20 گرم دکستروز+ 17گرم آکار)، برداشته و به محیط جدید منتقل و به مدت سه هفته در انکوباتور با دمای 28 درجه نگهداری شدند. در مرحله بعد نمونه‌ها در محیط (PDB300 گرم سیب زمینی+20 گرم دکستروز) کشت و در روی شیکر مغناطیسی بدون گرما، در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در شرایط تاریکی و دور rpm 120 به‌مدت 21 روز نگهداری شدند تا میسیلیوم‌ها رشد کنند.

القا محرک بر روی قارچ‌های بازیدیومیست و گلسنگ منتخب: از محرک نیترات سدیم (NaNo₃) به‌عنوان منبع نیتروژن در غلظت یک و نیم گرم در لیتر و نانوفیبرسلولز (C5H10O5)n)) به‌عنوان منبع کربن در غلظت‌ صد میلی‌گرم درلیتر و سولفات منیزیم (MgSo₄) به عنوان منبع موادآلی در غلظت 5 میلی‌مول به عنوان الیسیتور استفاده شد محلول مادری در آب تهیه و به منظور استریل اتوکلاو شدند. جهت اعمال تیمارها ابتدا در ظرف 200 میلی‌لیتری، 100میلی لیتر محیط کشت مایع PDB به همراه غلظت‌های مختلف الیسیتورهای مدنظر تهیه و با استفاده از پیپت پاستور 4 قطعه از هیف قارچ‌های مورد بررسی جدا و به آن اضافه شد سپس ظروف کشت روی شیکر، در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در شرایط تاریکی و دور rpm 120 نگهداری و عصاره‌گیری پس از 8 روز انجام شد.

عصاره‌گیری از میسیلیوم قارچ‌های بازیدیومیست و قارچ همراه گلسنگ: جهت عصاره­گیری میسلیوم‌ها به وسیله 3 بار غربال از قسمت مایع جدا شده سپس  10 میلی­لیتر از محیط کشت با  1 میلی­لیتر متانول گرید HPLC و 9 میلی­لیترحلال کلروفوم مخلوط و به وسیله قیف دکانتور فازآلی جدا گردید. فازآلی به‌دست آمده در دمای 51 درجه سانتی‌گراد خشک و در 1 میلی‌لیتر متانول گرید HPLC حل شد و در تاریکی و دمای 20- درجه در فریزر جهت تزریق به دستگاهHPLC  نگهداری گردید (Nasiri-Madiseh, 2010).

سنجش میزان ماده موثره با دستگاه HPLC و LC-MS: دستگاه مورد استفاده هیتاچی آلمان–ژاپن و ستون مورد استفاده، (C18 250 در 6/4 میلی‌متر) با میکرومتر منافذ ستون بوده است. طول موج دستگاه روی 210 نانومتر تنظیم شد، سرعت جریان حلال یک میلی‌لیتر بر دقیقه در نظر گرفته شد و از فاز متحرک به صورت مخلوط حلال‌های استونیتریل و آب دیونیزه، به نسبت 91:9 استفاده شد. استاندارد بتولین و اسید بتولینیک از شرکت سیگما خریداری شد.

 

 

 

شکل 1: منحنی استاندارد بتولین و بتولینیک اسید

 

 

            بر طبق نتایج پیک شارپی در محل بعد از پیکهای بتولین و اسید بتولینیک ایجاد شد که در تحقیقات دیگر محققین (Kosyakov et al., 2014 et al., 2015; Orsini Nazari, 2018;) نیز آمده و نشان از تبدیل بتولین به سایر مشتقات مربوطه می­باشد. جهت حصول اطمینان، نمونه عصاره­گیری شده تحت شرایط رعایت شده برای دستگاه HPLC جهت تزریق به دستگاه LC-MS به دانشکده داروسازی دانشگاه شهید بهشتی تهران ارسال شد که مورد تائید قرار گرفت (شکل 2). 

 

 

 

شکل 2: منحنی کروماتوگرافی عصاره کالوس تزریق شده به دستگاه LC-MS

 

جدول 1: جرم مولکولی ترکیبات ثانویه عصاره کالوس تزریق شده به دستگاه LC-MS

زمان (دقیقه)	جرم مولکولی
276/15	8/390	7/391	7/428	8/435	7/797	6/802	7/803	7/804

 

 

            چنانچه در جدول 1 مشاهده می­شود جرم مولکولی تقریبی 400، ترپنوئید بودن ترکیبات فوق را ثابت میکند. می­دانیم که بتولین در اثر گذشت زمان به مشتقات آن تبدیل می­گردد. جرم مولکولی دوبرابر مشاهده شده در جدول 1 حاصل دیمر شدن برخی ترکیبات است. ضمنا نیاز به یاداوری است کلیه مشتقات بتولین خواص ضد سرطانی بالایی دارند.

بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی: خواص آنتی‌اکسیدانی میسیلیوم قارچ‌های S. hirsutum، H. paradoxa و
A. arundinis، براساس روش مشایخی و آتشی (Mashayekhi and Atashi, 2014) و بـا
محلول DPPH بررسی شد.

تجزیه و تحلیل آماری نتایج: تجزیه و تحلیل تمامی داده‌های قارچ‌های مورد نظر بر اساس طرح فاکتوریل دو عامله و مقایسه میانگین‌ها از طریق آزمون دانکن انجام گرفت.

 

نتایج

نتایج حاصل از تجزیه واریانس اعمال الیسیتورها بر مقدار تری ترپنوئید نشان می‌دهد که تیمارها بر میزان تری‌ترپنوئیدها (مشتقات بتولین)بااحتمال 95 درصد اثر معنی‌داری دارند (جدول 2).

 

 

جدول 2: تجزیه واریانس القاء الیسیتور بر میزان تری‌ترپنوئیدها (مشتقات بتولین) قارچ‌های S. hirsutum، H. paradoxaو
 A. arundinis

متغیر	درجه آزادی	میانگین مربعات	F
نمونه	2	806/6314600	683/5×1014**
تیمار	3	274/1×107	146/1×1015* *
نمونه×تیمار	6	867/2×107	580/2×1015**
اشتباه آزمایشی	24	111/1×108
کل	35

** معنی‌دار در سطح اطمینان 99 درصد       

 

            مقایسه میانگین غلظت تری‌ترپنوئید در بین سه قارچ مورد مطالعه نشان داد که بیشترین غلظت تری‌ترپنوئید را قارچ A. arundinis با مقدار سطح زیر پیک10⁴×88/2682 پی‌پی‌ام داشته است و سپس
S. hirsutum با مقدار10⁴× 41/2176 پی‌پی‌ام و بعد از آن قارچ H. paradoxa با مقدار10⁴×25/1252 پی‌پی‌ام دارای کمترین غلظت تری‌ترپنوئید بوده است (شکل 3). بررسی مستقل تیمارهای اعمال شده بر میزان تری ترپنوئید نشان می‌دهد که بیشترین غلظت تری‌ترپنوئید به ترتیب در تیمارهای شاهد، نیترات سدیم، نانوفیبرسلولز و منیزیم سولفات با مقادیر10⁴×60/3243، 10⁴×37/2543، 10⁴×35/1911 و10⁴×39/450 پی‌پی‌ام مشاهده شد (شکل 4). نتایج مقایسه میانگین‌ اثر متقابل بین الیسیتورها و قارچ‌های مورد بررسی بر میزان تری­ترپنوئیدها نشان می‌دهد که بیشترین غلظت تری‌ترپنوئید در بین کل تیمارها در تیمار شاهد قارچ A. arundinis با 10⁴× 27/8134 پی‌پی‌ام و کمترین غلظت تری‌ترپنوئید در تیمار نیترات سدیم H. paradoxa با 10⁴× 52/41 پی‌پی‌ام مشاهده شده است . در قارچ S. hirsutum غلظت تری‌ترپنوئیدها به‌ترتیب در تیمارهای نیترات سدیم، نانوفیبرسلولز، شاهد و منیزیم سولفات با مقادیر10⁴×37/6065، 10⁴× 4/1135، 10⁴×38/951 و10⁴×48/553 پی‌پی‌ام، در قارچ H. paradoxa غلظت تری‌ترپنوئیدها به ترتیب در تیمارهای نانوفیبرسلولز، شاهد، منیزیم سولفات و نیترات سدیم با مقادیر10⁴×81/3879، 10⁴× 16/645، 10⁴×51/442 و10⁴×52/41 پی‌پی‌ام،در قارچ A. arundinis غلظت تری‌ترپنوئیدها به ترتیب در تیمارهای شاهد، نیترات سدیم، نانوفیبرسلولز و منیزیم سولفات با مقادیر10⁴×27/8134، 10⁴×23/1523، 10⁴×85/718 و10⁴×18/355 پی‌پی‌ام مشاهده شد (شکل 5).

 

 

شکل 3: مقایسه میانگین مقادیر تری‌ترپنوئید (مشتقات بتولین) در قارچ‌های S. hirsutum، H. paradoxa و A. arundinis، در سطح احتمال 5 درصد.	شکل 4: مقایسه میانگین مقادیر تری‌ترپنوئید (مشتقات بتولین) در تیمارهای شاهد، نانوفیبرسلولز، نیترات سدیم و منیزیم سولفات، در سطح احتمال 5 درصد

 

 

            نتایج نشان می‌دهد در قارچ A. arundinis تزریق الیسیتورها نه تنها تاثیری بر میزان تری ترپنوئید نداشتند بلکه به‌طور قابل ملاحظه‌ای باعث کاهش شدند. در قارچ H. paradoxaتیمارنانو فیبرسلولز باعث افزایش 01/6 برابری نسبت به شاهد شد. در قارچ S. hirsutum الیسیتور نیترات سدیم باعث شد مقدار تری ترپنوئید نسبت به شاهد 37/6 برابر گردد. با این حال مقدار تری ترپنوئید موجود در قارچ
A. arundinisدر تیمار شاهد نسبت به همه تیماره بیشتر بوده است. پیک‌های مربوطه در شکل 6 نمایش داده شده است.

 

 

شکل 5: تصاویر (مشتقات بتولین) در تیمارهای مختلف قارچ‌هایS.hirsutum ، H. paradoxaو A. arundinis،

در سطح احتمال 5 درصد

 

 

الف

ج

ب

شکل 6:پیک حاصل از تزریق به دستگاه  HPLC، الف) تیمار نانوفیبر سلولز در قارچ H. paradoxa، ب) تیمار نیترات سدیم در قارچ S. hirsutumج) تیمار شاهد در قارچ A. arundinis

 

جدول 3: نتایج تجزیه واریانس اثر تیمار بر مقدار آنتی‌اکسیدان قارچ‌هایS. hirsutum، H. paradoxa و A. arundinis ‌

متغیر	درجه آزادی	میانگین مربعات	F
نمونه	2	089/2119	057/491**
تیمار	3	229/2430	157/563**
نمونه×تیمار	6	909/1800	325/417**
اشتباه آزمایشی	24	315/4
کل	35

** معنی‌دار با اطمینان 99 درصد

 

            نتایج تجزیه واریانس نشان داد که اثر تیمار بر مقدار آنتی‌اکسیدان قارچ‌­ها با احتمال 95 درصد دارای اثر معنی‌داری بوده است (جدول 3). نتایج حاصل از بررسی میزان آنتی‌اکسیدان در قارچ‌های مورد مطالعه نشان می‌دهد که بیشترین مقدار آنتی‌اکسیدان در قارچ H. paradoxaبا 11/71 درصد و سپس در قارچ
A. arundinis با 61/60 درصد و کمترین مقدار در قارچ S. hirsutumبا 72/44 درصد مشاهده شده است (شکل 7).

 

 

شکل 7: مقایسه میانگین درصد آنتی‌اکسیدان در قارچ‌های S. hirsutum، H. paradoxaو A. arundinis، در سطح احتمال 5 درصد	شکل 8: مقایسه میانگین مقادیر آنتی‌اکسیدان در تیمارهای شاهد، نانوفیبرسلولز، نیترات سدیم و منیزیم سولفات، در سطح احتمال 5 درصد.

           

 

            بررسی اثر مستقل تیمارهای شاهد، نانوفیبرسلولز، نیترات سدیم و منیزیم سولفات نشان می‌دهد که بیشترین مقدار آنتی‌اکسیدان در تیمار نیترات سدیم با 45/72 درصد مشاهده شده است. در بین تیمارهای شاهد و منیزیم سولفات به‌ترتیب با مقادیر آنتی‌اکسیدان 26/63 و 62/64 درصد اختلاف معنی‌داری وجود ندارد و کمترین مقدار آنتی‌اکسیدان در تیمار نانوفیبر سلولز با 92/34 درصد مشاهده شده است (شکل 8). نتایج حاصل از مقایسه میانگین‌ اثر متقابل قارچ­ها و الیسیتورهای اعمال شده نشان می‌دهد تیمار شاهد قارچ‌های H. paradoxaو
A. arundinisبه‌ترتیب با 1/83 و 05/82 درصد دارای بیشترین مقدار آنتی‌اکسیدان بوده و بر اثر اعمال الیسیتورها شاهد کاهش خواص آنتی‌اکسیدانی بودیم. در قارچ S. hirsutumبا 62/24 درصد کمترین مقدار آنتی‌اکسیدان  مشاهده شد. القاء الیسیتور نانو فیبرسلولز باعث کاهش مجدد آن شد ولی دو الیسیتور نیترات سدیم و منیزیم سولفات به‌ترتیب باعث افزایش 5/3 و 2 برابری آنتی‌اکسیدان شدند. مقدار آنتی‌اکسیدان تحتتاثیرنانوفیبر سلولز در قارچ
H. paradoxa42/63 درصد و سپس در قارچ‌های
A. arundinis و S. hirsutumبه‌ترتیب 23/23 و 13/18 درصد مشاهده شد (شکل 9). میزان آنتی‌اکسیدان در قارچ‌های S. hirsutum،H. paradoxaو A. arundinis تحت تاثیر تیمار نیترات سدیم به‌ترتیب 04/86، 25/81 و 05/50 درصد می‌باشد. در تیمار منیزیم سولفات بیشترین میزان آنتی‌اکسیدان در قارچ A. arundinis با 12/87 درصد و کمترین مقادیر به ترتیب در قارچ‌های H. paradoxaو S. hirsutumبا 68/56 و 08/50 درصد مشاهده شده است (شکل 9).

 

 

شکل 9: مقایسه میانگین مقادیر آنتی‌اکسیدان در تیمارهای مختلف قارچ‌های S. hirsutum، H. paradoxa

وA. arundinis، در سطح احتمال 5 درصد.

 

بحث

            مطالعه حاضر اولین گزارش از بررسی اثر گذاری القاء الیسیتور بر روی قارچ همزیست گلسنگ (Arthrinium arundinis) و میسیلیوم‌های قارچ‌های بازیدیومیست Hyphodontia paradoxaو Stereum hirsutumمی­باشد. پژوهش حاضر به نوعی ادامه تحقیق  نظری و همکاران (Nazari et al., 2017؛ Nazari et al., 2018) می­باشد. در دو تحقیق قبلی وجود ترکیبات ثانویه بتولین و بتولینیک اسید در میسیلیوم قارچ‌های مورد مطالعه به اثبات رسیده بود. با توجه به اینکه امکان تبدیل این دو ترکیب ثانویه به مشتقات آن در اثر گذشت زمان قبلا در کشت‌های سلولی گزارش شده بود (Nazari, 2018) در تحقیق حاضر از ذخایر دو ساله میسیلیومی قارچها استفاده گردید تا این موضوع در کشت های قارچی نیز کنترل شود. نتایج قابل توجه بود چرا که  این تبدیلات اتفاق افتاده و پیک شارپی پس از زمان بازداری مربوط به بتولین و بتولینیک اسید مشاهده گردید که ترپنوئید بودن آن با استفاده از جرم مولکولی (LC-MS) اثبات شد. در سالهای اخیر نتایج امیدوار کننده در کنترل انواع مختلف سرطان با استفاده از بتولین و مشتقات آن شامل اسید یتولینیک، اسید اورسولیک، اسید اولئانولیک، اریتریدیول و دیگر تری­ترپنوئیدها (Sousa et al., 2019) حاصل شده است.  تبدیل بتولین به مشتقات مربوطه هزینه بر و به نسبت سخت می­باشد؛ در این تحقیق تبدیلات فوق فقط بر اثر گذشت زمان اتفاق افتاده و منبع خوبی از تولید این مواد موثره مفید با هزینه تولید ارزان ارائه گردیده است. نتایج نشان داد میزان این ترکیبات در قارچ A. arundinis > S. hirsutum <  H. paradoxaمی­باشد. در این مطالعه از الیسیتورهای نیترات سدیم و سولفات منیزیم و همچنین از نانوفیبر سلولز با هدف افزایش مقدار ترکیبات ثانویه استفاده گردید. مشخص شد القاء الیسیتورها می­­تواند بر میزان ماده موثره میسلیوم قارچ‌های مورد مطالعه تاثیرگذار باشد. در قارچ H. paradoxa نانوفیبر سلولز باعث افزایش 5/6 برابری ترکیبات ثانویه و در قارچ
S. hirsutumالیسیتور نیترات سدیم باعث 37/6 برابری این ترکیبات نسبت به شاهد گردید. در قارچ A. arundinis تزریق الیسیتورها تاثیری بر میزان تری ترپنوئیدها که مشتقات بتولین هستند نداشت و به‌طور قابل ملاحظه‌ای باعث کاهش آن شد (شکل 5). اثر القاء الیسیتورهای مختلف بر میزان ماده موثره قارچ­ها توسط محققین مختلفی چون جاسیکامیسیاک و همکاران (Jasicka-Misiak et al., 2010) بر روی قارچ‌هایI. obliquus، betulinus Piptoporus و Daedalea confragosa، مورد بررسی قرار گرفته است، نتایج بررسی­های این محققین تاثیر گذاری القاء الیسیتور را نشان داد.اگر چه بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه در شرایط درون شیشه­ای[2] به­طور ژنتیکی کنترل می­شود، اما به شدت تحت تاثیر عوامل محیطی و به‌ویژه ترکیبات محیط کشت قرار می­گیرد. از بین کلیه عوامل محیطی، کیفیت و کمیت منبع نیتروژن مورد استفاده در محیط رشد، تأثیر ویژه‌ای نه تنها در رشد و تمایز، بلکه در بیوسنتز بسیاری از متابولیت‌های ثانویه شناخته شده قارچی دارد (Tudzynski, 2014 ;Raei et al., 2017). در تحقیق حاضر از سدیم نیترات به‌عنوان منبع نیتروژن استفاده شد. این الیسیتور فقط در قارچ S.hirsutum باعث افزایش ترپنوئیدها (مشتقات بتولین) نسبت به شاهد شد. الیسیتور نیترات سدیم در تحقیق بای و همکاران باعث افزایش تولید بتولین در محیط کشت میسلیوم قارچ I. obliquusشد که همراستا با نتایج مطالعه حاضر  S. hirsutum می­باشد (Bai et al., 2012). در دو قارچ دیگر این الیسیتور کاهش مقادیر را باعث شد.این نتایج در مورد خواص آنتی‌اکسیدان نیز تکرار گردید. قارچ‌ها به تغییرات در دسترس بودن ازت با تغییرات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی و فعال سازی فرایندهای تمایز پاسخ می‌دهند (Tudzynski, 2014). آزمایشات ژنومی Fusariumfujikuroiنشانداد کمیت و کیفیت منبع نیتروژن روی 30 ژن از 45 ژن بیان کننده متابولیت‌های ثانویه تاثیرگذار است (Wiemann et al., 2013).

            نانوفیبر سلولز با فرمول C₅H₁₀O₅)n) با پلی‌مرهای گلوکزی به ضخامت معمول 20 – 40 نانومتر و طول بلندتر از 5 میکرومتر شامل هر دو مناطق کریستالی و آمورف می­شود که به­طور عمده از طریق کوچک‌سازی ابعاد فیبرهای میکرومتری سلولز با نیروهای مکانیکی به دست می­آید (Yousefi et al., 2011). نانو مواد از لحاظ ساختاری طول به قطر بالایی دارند که هر چه این نسبت بالاتر، در هم‌پیچیدگی این شبکه بیشتر شده، نقاط اتصال زنجیره­ها به هم زیادتر و شبکه تشکیل شده محکم­تر می‌شود (Spagnol et al., 2012). این الیسیتور در
A. arundinisباعث کاهش شدید ترپنوئیدها نسبت به شاهد گردید ولی افزایش مقادیر را در دو گونه
 S. hirsutumو  H. paradoxaموچب گردید. خواص آنتی‌اکسیدانی در هر سه گونه قارچ مورد مطالعه در این تیمار کاهش یافت. نانوفیبر سلولز در دو قارچ
P. citrinumو F. cicatricum نیز سبب حداکثر میزان سنتز تری­ترپنوئیدها در مطالعه نظری گردید (Nazari, 2018) که همراستا با نتایج مطالعه حاضر برای دو گونه S. hirsutumو  H. paradoxa بوده و با نتایج مربوط به فارچ A. arundinisدر یک راستا نمی­باشد.

            االیستور منیزیم سولفات مقدار ترکیبات ترپنوئیدی را در هر سه گونه قارچی کاهش داد ولی خواص آنتی اکسیدانی در این تیمار فقط در قارچ H. paradoxa کاهش و در دو گونه دیگر باعث افزایش شد. این محرک در مطالعه بای و همکاران در قارچ I. obliquus باعث افزایش مقدار بتولین نسبت به شاهد گردید که با نتایج تحقیق حاضر همراستا نمی­باشد. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که قارچ‌هایS.hirsutum, H. paroduxa, A.arundinis دارای خواص آنتی‌اکسیدانی به ترتیب در حد 05/82، 1/83 و 62/24 درصد می‌باشند که برای دو گونه اول مقادیر قابل تاملی است. خواص آنتی اکسیدانی در بسیاری از قارچ‌ها از جمله Mucor circinelloides (Hameed et al., 2017)، Phellinus torulosus (Hokmollahi et al., 2011)، Trametes gibbosa (Tabari et al., 2013)، Ganoderma lucidum(Wong et al., 2004) نیز گزارش شده است. تاکنون آنتی‌اکسیدان‌های سنتز شده بسیاری شناسایی شده‌اند که در غذاها، به‌عنوان نگهدارنده به‌کار می‌روند (Lourenco et al., 2019) اما از آنجایی که این مواد غیرطبیعی بوده و ممکن است عوارض سمی و جانبی دیگری داشته باشد، لذا بهتر است که منابع طبیعی حاوی آنتی‌اکسیدان شناسایی شده و جهت مصرف معرفی گردد. ممکن است بتوان به میسیلیوم دو قارچ A. arundinisو , H. paroduxa در این خصوص بیشتر توجه کرد. مقدار آنتی‌اکسیدان گونه S. hirsutumبدون اعمال الیسیتور در حد 62/24 درصد بود که با افزودن نیترات سدیم به محیط کشت به 04/86 درصد رسید که که مقدار بالایی بوده و بسیار امیدوار کننده است.

 

نتیجه‌گیری نهایی

            نتایج این مطالعه نشان داد بتولین موجود در میسیلیوم دو ساله قارچ­های A. arundinis،
H. paradoxa و A. arundinis  به مشتقات آن تبدیل می­شود. بالاترین مقدار تری ترپنوئید (مشتقات بتولین) در قارچ A. arundinisدر تیمار شاهد مشاهده گردید. الیسیتورهای نانو فیبر سلولز در H. paradoxa و نیترات سدیم درS. hirsutumباعث افزایش قابل ملاحظه این ترکیبات نسبت به شاهد شدند با هدف افزایش خواص آنتی اکسیدانی در قارچ S. hirsutum الیستور نیترات سدیم و در قارچ A. arundinisسولفات منیزیم پیشنهاد می­گردد. با توجه به اینکه منبع تولید بتولین و مشتقات آن یعنی درختان توس در ایران رو به انقراض است به نظر می‌رسد این قارچ‌ها گزینه بسیار مناسب، سهل الوصول و ارزان برای تحقیقات بعدی با هدف بهره گیری از خواص مربوطه باشند.

 

 

---

^*نویسنده مسئول:[e-mail]

[2]. In vitro

مراجع

 

References

1. Abdul Malik, N.A., Kumar, I.S. and Nadarajah, K. 2020. Elicitor and receptor molecules: Orchestrators of Plant Defense and Immunity. Int. J. Mol. Sci. 21: 963.
2. Bai, Y-H., Feng, Y-Q., F., Mao, D-B. and Xu, Ch-P. 2012. Optimization for betulin production from mycelia culture of Inonotus obliquus by orthogonal design and evaluation of its antioxidant activity. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 43:663-690.
3. Halder, M., Sarkar, S. and Jha, S. 2019. Elicitation: A biotechnological tool for enhanced roduction of secondary metabolites in hairy root cultures. Eng Life Sci., 19: 880-895.
4. Hameed, A., Hussain, S.A., Yang, J., Ijaz, M.U., Liu, Q., Suleria, H.A.R. and Song, Y. 2017. Antioxidants potential of the filamentous fungi (Mucor circinelloides). Nutrients, 9(10): 1101.
5.  Hokmollahi, F., Rafati, H., Riahi, H., Hakimi, M., Aliahmadi, A. and Heydari, H. 2011. Collection and identification of a medicinal mushroom, phellinus conchatus in iran and investigation of the antibacterial activity of total methanol extract and fractional extracts. Journal of Shahid Sadoughi University of Medical Sciences, 18 (6):521-530.
6. Holková, I., Bezáková, L., Sek Bilka, F., Bala_zová, A. and Blanáriková, V. 2010. Involvement of lipoxygenase in elicitor-stimulated sanguinarine accumulation in Papaver somniferum suspension cultures. Plant Physiology and Biochemistry, 48: 887-892.
7. Hordyjewska, A., Ostapiuk, A., Horecka, A. and Kurzepa, J. 2019. Betulin and betulinic acid: triterpenoids derivatives with a powerful biological potential. Phytochem Rev, 18:929–951.
8. Jasicka-Misiak, I., Lipok, J., Swider, I. and Kafarski, P. 2010. possible fungistatic implications of betulin presence in betulaceae plants and their Hymenochaetaceae Parasitic Fungi. Z. Naturforsch, 65 c: 201-206.
9. Kosyakov, D.S., Ul’yanovskii, N.V. and Falev, D.I. 2014. Determination of Triterpenoids from birch bark by liquid chromatography—tandem mass spectrometry. Journal of Analytical Chemistry, 69 (13): 1264–1269.
10. Lourenço, S., Moldão-Martins, M. and Alves, V. 2019. Antioxidants of natural plant origins: from sources to food industry applications. Molecules, 24(22): 4132.
11. Macheleidt, J., Mattern, DJ., Fischer, J., Netzker, T., Weber, J., Schroeckh V., et al. 2016. Regulation and role of fungal secondary metabolites. Annual review of genetics, 50: 371-392.
12. Mashayekhi, K. and Atashi, S. 2014. The analyzing methods in plant physiology. Sirang press. Gorgan. 310 p. (In Persian).
13. Naik, PM. and Al-Khayri, JM. 2016. Impact of abiotic elicitors on in vitro production of plant secondary metabolites: A Review. J. Adv. Res. Biotech 1(2): 7. DOI: 10.15226/2475-4714/1/2/00102.
14. Najafi, S., Heidari, R. and Jamei, R. 2013. Influence of silver nanoparticles and magnetic field on phytochemical, antioxidant activity compounds and physiological factors of Phaseolus vulgaris. Technical Journal of Engineering and Applied Sciences, 3(21): 2812-2816.
15. Nasiri-Madiseh, Z., Mofid, M.R., Ebrahimi, M., Khayyam-Nekoei, S.M. and Khosro-Shahli, M., 2010. Isolation of taxol-producing endophytes fungi from Iranian yew (Taxus baccata L.). Journal of Shahrekord University Medicinal Science, 11(4): 101-107.
16. Nazari, J. 2018. Identification and effect of basidiomycete and endophytic fungus of Betula pendula to triterpnoids amount in cell suspension culture and effect of stem cells extract on apoptosis in esophageal cancer cells. Ph.D thesis in Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources.
17. Nazari, J., Payamnoor, V. and Kavosi, M.R. and Asadi J. 2018. Extraction of anti-cancer triterpenoids (betulinic acid and betulin) from the birch bark-inhabiting lichen (Ramalina sinensis). Iranian Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 34 (4): 64-616.
18. Nazari, J., Payamnoor, V. and Kavosi, M.R., 2017. The evaluation absorption of some secondary metabolites (betulin, betulinic acid, phenol, flavonoids) and antioxidant activity of woodinhabiting agaric fungi on medicinal birch tree (Betula pendula Roth.) in Golestan province. Eco-Phytochemical Journal of Medicenal Plant, 14(2): 44-55.
19. Orsini, S., Ribechini, E., Modugno, F., Klügl, J., Di Pietro, J. and Colombini, M.P. 2015. Micromorphological and chemical elucidation of the degradation mechanisms of birch bark archaeological artefacts. Heritage Science, 3: 2-11.
20. Raei, M,, Angaji, SAH, Omidi, M. and Khodayari,  M. 2014. Effect of abiotic elicitors on tissue culture of Aloe vera. Int J Biosci, 5(1): 74-81.
21. Raei, M., Esna-Ashari, M. and Khodayari, M. 2017. Abiotic elicitors and medicinal plants biotechnology. Journal of Cell & Tissue, 7(4):1-11.
22. Roberts, S.C. and Shuler, M.L. 1997. Large-scale plant cell culture. Current Opinion in Biotech, (8): 154-159.
23. Sousa, J., Freire, C., Silvestre, A. and Silva, A. 2019. Recent developments in the functionalization of betulinic acid and its natural analogues: A Route to New Bioactive Compounds. Molecules, 24: 355: 1-33.
24. Spagnol, C., Rodrigues, F.H.A., Pereira, A.G.B., Fajardo, A.R., Rubira, A.F. and Muniz, EC. 2012. Superabsorbent hydrogel composite made of cellulose nanofibrils and chitosan-graft-poly (acrylic acid). Carbohydrate Polymers, 87:2038-2045.
25. Tabari, SH, Ghorbanli, M., Safaian, Sh. and Moosazade, S. 2013. Comparison of antioxidant and phytochemical properties of Trametes gibbosa. J. Cell Mol. Biotech, 10(3):73-78
26. Tudzynski, B. 2014. Nitrogen regulation of fungal secondary metabolism in fungi. Front Microbiol, 5: 656.
27. Wiemann, P., Sieber, C.M.K., von Bargen, K.W., Studt, L., Niehaus, E.M., Huß, K. 2013. Deciphering the cryptic genome: genome-wide analyses of the rice pathogen Fusarium fujikuroi reveal complex regulation of secondary metabolism and novel metabolites. PLoS Pathog. 9:e1003475 10.1371/ journal. ppat.1003475.
28. Wink, M. 2018. Plant secondary metabolites modulate insect behavior-steps toward addiction? Front. Physiol. 9:364. DOI: 10.3389/fphys.2018.00364
29. Wong, K.L., Chao, H.H., Chan, P., Chang, L.P. and Liu, C.F. 2004. Antioxidant activity of Ganoderma lucidum in acute ethanol-induced heart toxicity. Phytother Res, 18(12):1024-6.
30. Yang, L., Wen, K., Ruan, X., Zhao, Y., Wei, F. and Wang, Q. 2018. Response of plant secondary metabolites to environmental factors. Molecules. 23(4): 762. DOI: 10.3390/molecules 23040762.
31. Yousefi, H., Nishino, T., Faezipour, M., Ebrahimi, G.H. and Shakeri, A. 2011. Direct fabrication of all-cellulose squeezing flow viscometry. Journal of Procedia Food Science, 1: 1997-2002.
32. Zhai, Q., Fan, G. and Zhan, Y. 2011. Accumulation of triterpenoids in Betula platyphylla suspension culture induced by a fungal elicitor. Scientia Silvae Sinicae, 47(6):42-47.